MLCK敲除对FaDu细胞凋亡的影响.pdf

748安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：23：58 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.007.h t mlMLCK敲除对FaDu细胞凋亡的影响熊垒,黄建尚，周青，汪渊，左莉摘要目的构建肌球蛋白轻链激酶（MLCK）敲除的下咽 癌Fa Du细胞株，并探讨敲除MLCK对Fa Du细胞凋亡的影 响。方法 脂质体转染sg RNA和Ca s9 2NLS Nu c l e a se构建 MLCK敲除的Fa Du细胞株，提DNA测序确定敲除细胞株,分为对照组.MLCK KO 1组.MLCK KO 2组;采用RT-q P CR、West er n bl o t检测MLCK敲除效率;流式细胞术检测MLCK 敲除对细胞周期和凋亡的影响;West er n b l o t检测MLCK敲 除对细胞凋亡的影响。结果 DNA测序显示在sg RNA序列 识别处,MLCK碱基序列发生了缺失或替换;RT-q P CR和 West er n b l o t显示MLCK敲除细胞株mRNA和蛋白质水平低 于对照组（P 0.000 1）;流式细胞术实验显示敲除MLCK对 Fa Du细胞的周期无明显变化,但凋亡率增加（P 0.000 1）；West er n bl o t 检测显示，MLCK 敲除组 Ba x/Bc l-2（P 0.000 1）和 Cl ea v ed Ca spa se-3/Ca spa se-3（P=0.000 7）增加。结论 敲除MLCK诱导细胞凋亡，但具体机制需进一步研究。关键词 下咽癌;肌球蛋白轻链激酶;增殖;凋亡中图分类号 R 739.63文献标志码A 文章编号1000-1492（2023）05-0748-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.008下咽癌是头颈部肿瘤中预后最差的鳞状细胞癌 之一。在发达国家并不常见，它主要在吸烟和酗 酒的男性中被诊断出来，在女性中很少见;但是在发 展中国家，近年来下咽癌的发病率在男性和女性中 都有所增加。通常在晚期被发现，且是多灶性 的,尽管诊断成像、放射治疗、化疗和外科手术技术 已经得到改善，但5年存活率仍然很低。因此迫 切需要找到一个新的治疗靶点。肌球蛋白轻链激酶（my o sin l ig h t c h a in k in a se,MLCK）是一种调节一系 列细胞骨架调节蛋白的关键酶，已被认为是细胞凋 亡的关键调节因子勺。该课题组前期研究发现 与健康组织比较,MLCK在下咽肿瘤组织中的表达 上调，该研究旨在通过CRISP R/Ca s 9技术构建ML-2022-12-10 接收基金项目：国家自然科学基金（编号：82270589、82070548、81800464）作者单位:安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，合肥 230032作者简介:熊 垒，男,硕士研究生；左 莉，女,副教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:zu o l i a h mu.ed u.c nCK敲除细胞株，并探讨其对下咽癌Fa Du细胞凋亡 的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1实验试剂 DMEM高糖培养基和胎牛血清（以色列 Bio l o g ic a l In d u st r ies 公司）；An n ex in V-FITC/P I双染细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测 试剂盒（P I）（海贝博生物科技有限公司）；胰酶、青-链霉素、蛋白酶抑制剂、RIP A裂解液（上海碧云 天生物技术有限公司）;St ea d y P u r e通用型基因组 DNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；Lipo f ec t a min e CRISP RMAX Ca s 9 转染试剂、Mo dr e d sg RNA、Ca s9 2NLS Nu c l ea se（美国 Sy n t h eg o 公 司）；2x S6 Un iv er sa l SYBR q P CR MIX.Hy per Sc r ipt TM HI RT Su per Mix f o r q P CR w it h g DNA Remo v er（上海 新贝生物科技有限公司）；a n t i-Ba x、a n t i-Bc l-2、a n t i-Ca spa se-3、a n t i-Cl ea v ed Ca spa se-3（美国 CST 公司）；a n t i-Ac t in（美国 Af f in it y 公司）；山羊抗兔 Ig G-HRP、山羊抗小鼠Ig G-HRP抗体（美国Sa n t a Cr u z公司）。1-1.2 实验仪器 Lig h t Cy c l er 96实时荧光定量 P CR仪（瑞士罗氏公司）、酶标仪（美国Th er mo Fisher Sc ien t if ic公司）;化学发光凝胶成像分析系统 Ch emiDo c To u c h Ima g in g Sy st em（美国 Bio-Ra d 公 司）;-80兀超低温冰箱（日本三洋电器股份有限公 司）;正置生物显微镜（德国Leic a公司）；pH仪（上 海雷磁仪器厂）；电泳仪（北京六一生物科技有限公 司）。1.2方法1.2.1 Fa Du细胞培养 Fa Du细胞购自于中国科 学院典型培养物保藏委员会细胞库，传代至第三代,培养于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM 培养基中，置于37龙、5%CO?培养箱中培养，每隔 24 h换液,待细胞融合至80%左右时传代,并取对 数生长期细胞进行相关实验。1.2.2 Fa Du细胞MLCK的敲除 利用Sy n t h eg o公 司提供的在线设计网站，设计出MLCK特异性 sg RNA 序列 UGUGUCCCAAGCUUUCCUUG,sg RNA 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)749由达科为生物技术股份有限公司代理购买。取对数生长期的Fa Du细胞按照1 x 104个细 胞/孔接种于24孔板,待细胞长到30%70%融合 度时进行转染，分为对照组(不加Ca s9 2NLS Nu c l ea se 和 sg RNA)和实验组(加 0.5|jl1 Ca s9 2NLS Nuc l ea se 和1.5 jil sg RNA)，对照组和实验组中均加入 25|x l Opt i-MEM 培养基和 1 p.1 Lipr o f ec t a min e Ca s 9 P l u s Rea g en t，同时将 1.5 p.1 CRISP RMAX Rea g en t 加入25|jl1的Opt i-MEM培养基中,5 min后将两者 混合并轻轻混匀，室温孵育10 min后加到需要转染 的细胞培养孔中，培养23 d后将细胞消化接种于 96孔板中，每孔1个细胞。1.2.3 MLCK敲除单克隆细胞株的P CR鉴定 当 96孔板内细胞生长到2 000个左右时，用胰酶消化 细胞，将其接种于24孔板培养,待细胞生长到80%90%融合度时,用胰酶消化细胞,留取一半细胞提 取DNA进行P CR验证,另一半细胞继续扩大培养。提取基因组DNA的方法如下:胰酶消化Fa Du细胞 后取一半细胞1 000 r/min离心5 min,弃上清液，加 入 200|x l 的 P BS 悬浮细胞;加入 180|JL1 Bu f f er BS-2、20 pl 的 P r o t ein a se K 和 10|jl1 RNa se A(10 mg/ml),收集细胞悬液,充分吸打混匀，于56咒水浴加 热10 min至溶液完全裂解成澄清透明状态；向裂解 液中加入200以无水乙醇，充分吸打混匀；然后将 上述溶液转移至吸附柱中，具体操作参见DNA提取 试剂盒说明书。P CR扩增体系为：P r emix Ta q 25 吐上游引物1以,下游引物1 jx l.DNA模板1|il,d d H2O 22|il。P CR扩增条件为：98弋变性10 s,55 七退火30 s,72七延伸1 min,30个循环。将P CR 扩增产物通过120 V电压、1.5%琼脂糖凝胶进行分 离鉴定。将P CR鉴定为阳性的扩增产物送北京擎 科生物科技有限公司测序。1.2.4 RT-q P CR检测MLCK mRNA表达 收集经 测序确定MLCK敲除的2株细胞和对照组细胞，使 用ES Sc ien c e公司的RNA快速提取试剂盒提取总 RNA,测定RNA纯度和浓度后,用上海新贝生物科 技有限公司的反转录试剂盒合成c DNA,用安徽医 科大学基础医学院公共实验室罗氏Lig h t Cy c l er 96 实时荧光定量P CR仪进行扩增，按照试剂盒操作方 法检测各组细胞MLCK mRNA表达水平，采用 2-s e t法计算mlck mRNA相对表达量。MLCK引 物序列 F：5ATGTCAGCATAAGGGGAAGGGG-3,R：5Z-GCTCATTTCACTAAGCATGTTCC3；GAP DH 引物序列 F：5，-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3,R：5，-GCCATCACGCCACAGTITC3。1.2.5 流式细胞术检测细胞周期细胞按照5 x 105个细胞/孔接种在6孔板中，待细胞融合密度达 到90%时，胰酶消化收集细胞，以1 000 r/min离心 5 min；取沉淀细胞，用冷P BS洗涤细胞2次，用500 pel P BS重悬细胞，滴加2 ml冷乙醇4七固定过夜;取5 X106个细胞，在15 ml锥形离心管中2 000 r/min离心10 min,弃上清液，收集细胞;用冷P BS洗 涤细胞2次，用500|jl1冷P BS重悬细胞，加入 Rn a seA溶液20 jjl1,37玄水浴30 min；用400目细胞 筛网过滤，在2 000 r/min离心10 min,弃上清液，收 集细胞;加入400 pl P I染液重悬细胞，轻轻混匀后4 弋避光孵育1 h,最后用流式细胞仪检测细胞周期分 布情况，实验重复3次。1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞按照5 x 105个细胞/孔接种在6孔板中，待细胞融合密度达 到90%时,用不含EDTA的胰酶消化细胞,用冷P BS 洗涤2次，用400|x l 1 X An n ex in V结合液重新悬浮 细胞，在细胞悬液中加入5|x l An n ex in V-FITC染色 液,轻轻混匀后于4咒避光条件下孵育15 min,加入 5|x l P I染色液后轻轻混匀于4七避光条件下孵育5 min,通过流式细胞仪对MLCK敲除组和对照组的 细胞凋亡情况进行检测并分析细胞凋亡率的变化,实验重复3次。1.2.7 West er n bl o t实验 取对数生长期的MLCK 敲除和对照组细胞，按照5X105个细胞/孔接种在6 孔板中，待细胞融合密度达到90%时,吸弃培养基,用P BS洗3次，每孔加入含有蛋白酶抑制剂的RIP A 裂解液于冰上充分裂解细胞,14 000 r/min 4弋离心 20 mino吸取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白浓度 测定。以4：1的比例加入相应体积的总蛋白和5 X蛋白上样缓冲液,震荡混匀后在100龙水浴中煮 沸15 min使蛋白完全变性，冷却后置于-80咒冰箱 中保存。电泳时每泳道加入10憾的蛋白样品进行 SDS-P AGE凝胶电泳，电泳完成后将蛋白转移至 P VDF膜,5%脱月旨牛奶室温封闭2 h,加一抗4七孵 育过夜,用TBST溶液洗涤3次，每次5 min,室温孵 育二抗2 h,再用TBST洗涤3次后,即可进行曝光,检测蛋白的表达情况，使用Ima g e J分析条带灰度 值。1.3 统计学处理 采用Gr a ph pa d P r is m软件进行 分析，各组实验重复3次，数据均采用力土 s表示，组 间比较采用单因素方差分析,P 0.05为差异有统 计学意义。750 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)2结果2.1 FaDu细胞MLCK敲除的测序结果 根据 Sy n t h eg o公司网站上提供的在线CRISP R Desig n To o l,选择靶向MLCK基因第2外显子上的sg RNA,提取DNA后进行P CR鉴定，并将阳性样本送测序,测序结果显示MLCK KO 1细胞株在sg RNA识别序 列处缺失了 4个碱基（图1A）,MLCK KO 2细胞株 则在识别序列发生了碱基的插入与替换（图IB）,表 明成功构建了 MLCK KO 1和MLCK KO 2细胞株。2.2 敲除 MLCK 对 FaDu 细胞 MLCK mRNA 和 蛋白表达的影响 收集培养的Fa Du细胞株,RT-q P CR方法检测细胞中MLCK mRNA的表达。结果 显示,MLCK敲除细胞株中mRNA表达量降低（F=903.8,P 0.000 1,图 2A）。West er n bl o t 方法鉴定 细胞中MLCK蛋白表达,MLCK敲除组中蛋白水平 降低（F=2742,P 0.000 1,图 2B）。2.3 敲除MLCK对FaDu细胞周期的影响 在 Fa Du细胞中敲除MLCK,通过流式细胞技术检测细 胞周期。结果显示,与对照组比较,MLCK敲除组细 胞周期各时期变化并不明显，这说明敲除MLCK不 影响细胞的增殖（图3）。2.4 敲除MLCK对FaDu细胞凋亡的影响 在 Fa Du细胞中敲除MLCK,通过流式细胞术检测细胞1TTCTCTGTCTTCTAGAAGA TGTGTCCCAAGCTTT CCTTGAGGCTGTTGCTGAGGA2 TTCTCTGTCTTCTAGAAGA TGTGTCCCAAGCTTT-GACGCTGTTGCTGAGGA3 TGTGTCCCAAGCTTTCCTTGB1 TTCTCTGTCTTCTAGAAGA TGTGTCCCAAGCTTT CCT-TGAGGCTGTTGCTGAGGA2 TTCTCTGTCTTCTAGAAGA TGTGTCCCAAGCTTT CCCGTGGGCGTGTGGCTGAGGA3 TG 1GTCCCAAGC I Fl L CT-TG图1 MLCK敲除的FaDu细胞测序A:MLCK KO 1细胞株,1:野生型碱基序列,2:MLCK KO 1细胞株碱基序列,3:sg RNA碱基序列；B:MLCK K0 2细胞株,1：野生型碱基序 列,2:MLCK K0 2细胞株碱基序列,3:sg RNA碱基序列*wY O T r iMLCKB1.51 2 3210p-a c t in43A：RT-q P CR 检测 Fa Du 细胞中 MLCK与对照组比较：*p0.000 1B20 40 60 80 100 KP I-Hk u0 0.5.5LaLa0*1 2 3MLCK敲除对FaDu细胞MLCK mRNA和蛋白表达的影响mRNA 的表达;B：West er n bl o t 检测 MLCK 蛋白表达;1:对照组；2：MLCK KO 1 组；3：MLCK KO 2 组;3cD2图3 MLCK敲除对FaDu细胞周期的影响A、B、C：流式检测细胞周期;D:周期分析;1:对照组;2:MLCK KO 1组;3：MLCK KO 2组安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)751凋亡。结果显示,与对照组比较,MLCK敲除组凋亡 增加，这说明敲除MLCK会诱发细胞凋亡(F=93.52,P 0.000 1,图 4)。2.5 敲除MLCK对FaDu细胞中凋亡相关蛋白 Bax x Bcl-2 N Caspase-3 以及 Cleaved Caspase-3 表达 的影响 West er n bl o t方法检测细胞中凋亡相关蛋 白表达。结果显示,MLCK敲除组Ba x和Bc l-2的比 值(F=99.40,P 0.000 1)以及 Cl ea v ed Ca spa se-3 与 Ca spa se-3 的比值(F=31.17,P=0.000 7)均增 加，说明MLCK敲除诱发细胞凋亡(图5)。3讨论下咽癌相对罕见,约占所有头颈部恶性肿瘤的 3%，恶性程度高，为头颈部预后最差的恶性肿瘤之 一。早期无特征性临床表现，一般下咽癌患者总 是在中晚期才被诊断出来，预后较差。因此,有必要 寻找新的标志物，为患者提供早期发现和治疗。本 课题组前期研究发现MLCK在人下咽癌组织中 的表达高于正常的邻近组织，且与5年生存率有关,MLCK高表达患者的生存率较低，提示MLCK可能 是潜在治疗肿瘤的有效靶点。MLCK蛋白由MYLK 基因编码,MYLK基因是一个单拷贝基因，含有2个 启动子，分别转录长MLCK和短MLCK,短MLCK又 称平滑肌MLCK。研究报道,MLCK是免疫介 导的屏障丧失的主要调节因子.MLCK特异性抑制 剂可缓解TNF和抗CD3抗体诱导的屏障丧失，而 MLCK敲除可保护TNF和抗CD3诱导的结肠炎的 发生。研究GT表明，溃疡性结肠炎和克罗恩病中 MLCK的表达明显增加。免疫活化诱导的移植物抗 宿主病(g r a f t-v er su s-h o st d isea se,GVHD)的研究 显示MLCK在GVHD患者组织中明显升高，而ML-CK敲除限制GVHD的进展。此外，同型半胱氨酸 可增加Ca c o 2细胞中MLCK蛋白的表达，从而引起 跨上皮电阻的降低,增加上皮细胞通透性。MLCK 除了在维持上皮细胞屏障通透性平衡中具有重 要作用外,另外一些研究显示MLCK影响细 胞的增殖和凋亡。研究表明，在肝癌细胞中，过 表达MLCK减少细胞凋亡，而抑制MLCK增加细胞 101010*1041510101010101000-10-102-10 0 10 10Co mp-FITC-A图4敲除MLCK对FaDu细胞增殖的影响A、B、C：流式检测细胞凋亡;D：凋亡分析;1：对照组;2；MLCK KO 1组;3：MLCK KO 2组;与对照组比较：*P0.01,*P0.000 10-io2Q15.74連*84.6Q31.88-10-0 10 10Co mp-FITC-AQi0.99Q210.287.5Q31.31-10-010 10Co mp-FITC-AQl7.183-洽巧厂=Q4 rr79.2Q31.84194.1743Cl ea v ed Ca spa se-3p-a c t inA图5敲除MLCK对FaDu细胞中凋亡相关蛋白的影响A:West er n bl o t 检测 Fa Du 细胞 Ba x、Bc l-2、Ca spa se-3、Cl ea v ed Ca spa se-3 蛋白表达；B：Ba x/Bc l-2 蛋白表达直方图；C：Cl ea v ed Ca spa se-3/Ca spa se-3 蛋白表达直方图;1：对照组；2：MLCK KO 1 组；3：MLCK KO 2 组;与对照组比较:*P 0.01,*P 0.001,*P 0.000 1 752 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)凋亡。细胞凋亡的主要途径有死亡受体途径和以线粒 体凋亡途径，线粒体信号通路在调节细胞凋亡中起 着重要作用。线粒体凋亡途径上Bc l-2蛋白家族作 为参与细胞凋亡的核心家族，对凋亡的意义尤为重 要14 目前尚无报道对下咽癌MLCK敲除引起细胞 凋亡的研究，本课题组为了进一步探索MLCK在下 咽癌发生发展中的作用，首先利用CRISP R/Ca s 9技 术敲除MCLK,构建MLCK敲除的Fa Du细胞株。通 过测序发现MLCK敲除细胞株碱基序列发生缺失 或替换，并通过RT-q P CR和West er n bl o t检测敲除 效率，发现MLCK敲除组mRNA和蛋白水平低于对 照组，说明MLCK敲除株构建成功。通过流式细胞 术发现,MLCK敲除并不影响细胞增殖，但诱导细胞 凋亡，这决定了 MLCK在下咽癌中起癌基因的作 用。此外,敲除MLCK,West er n bl o t结果显示凋亡相 关蛋白：Ba x、Ca spa se-3 以及 Cl ea v ed Ca spa se-3 表达 增加，然而，本研究中课题组发现一个现象，即MLCK 敲除组中Bc l-2的表达水平与对照组相比增高,而不是降低。造成这种现象的原因可能为MLCK 敲除引起细胞启动自身的应急保护机制，调用自身 抗凋亡系统来抵抗损伤，但是Ba x与Bc l-2的比值 MLCK敲除组与对照组相比增高，说明MLCK敲除 组细胞发生凋亡，结合Cl ea v ed Ca spa se-3/Ca spa se-3 增高，进一步说明敲除MLCK诱导下咽癌细胞的凋 亡,但具体机制需进一步研究。综上所述,本研究构建了 MLCK敲除的2株细 胞，通过流式细胞术和West er n bl o t实验证明MLCK 敲除诱导细胞凋亡,为进一步开展MLCK在下咽癌 的功能和作用机制奠定了重要基础。参考文献1 Ca o F,Zh u L,Zh a n g J,et a l.My o sin l ig h t c h a in k in a se is a po t ent ia l t a r g et f o r h y po ph a r y n g ea l c a n c er t r ea t men t J.Bio med P h a r-ma c o t h er,2020,131：110665.2 Br a d l ey P J.Epid emio l o g y o f h y po ph a r y n g ea l c a n c er f J.Ad v Ot o-r h in o l a r y n g o l,2019,83：1-14.3 Xu Y,Liu S,Zh u L,et a l.Gr een t ea pr o t ec t s a g a in st h ippo c a mpa l n eu r o n a l a po pt o sis in d ia bet ic en c eph a l o pa t h y by in h ibit in g jn k/ml c k sig n a l in g J.Mo l Med Rep,2021,24(2)：575.4 Zh a n g X,Yu H.Ma t r in e in h ibit s d iet h y l n it r o sa min e-in d u c ed h c c pr o l if er a t io n in r a t s t h r o u g h in d u c in g a po pt o sis via p53,ba x-d e-pen d en t c a spa se-3 a c t iv a t io n pa t h w a y a n d d o w n-r eg u l a t in g ml c k o v er ex pr essio n J.Ir a n J P h a r m Res,2016,15(2)：491-9.5 Kw o n D I,Mil es B A.Hy po ph a r y n g ea l c a r c in o ma:d o y o u k n o w y o u r g u id el in es?J.Hea d&Nec k,2019,41(3)：569 76.6 Gr a h a m W V,He W,Ma r c h 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Molecular Biology of Anhui Medical University,Hefei 230032)Abstract Obje c t ive To c o n st r u c t a my o sin l ig h t c h a in k in a se(MLCK)k n o c k o u t h y po ph a r y n g ea l c a r c in o ma Fa Du c el l l in e a n d d isc u ss t h e k n o c k o u t ef f ec t o f MLCK o n a po pt o sis o f Fa Du c el l s.Me t hods MLCK k n o c k o u t Fa Du c el l l in es w er e c o n st r u c t ed by l ipo so me t r a n sf ec t io n o f sg RNA a n d Ca s9 2NLS Nu c l ea se,a n d t h e k n o c k o u t(下转第759页)安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)759Research on Wnt2/p-catenin pathway changes in liver regeneration and repair in C57BL/6 miceYa o Lu y u a n1,2,Liu Yu n1,Ya n g Qia n1,2,Ba o Xin1,Wa n g Ya n1,Zh a o Xia o y in g1,Ta n g Ju n min g1(1 Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research,Faculty of Basic Medical Sciences,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000；2Dept of Anesthesiology,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000)Abstract Obje c t ive To ex pl o r e t h e c h a n g in g c h a r a c t er ist ic s o f Wn t 2/p-c a t en in pa t h w a y in l iv er r eg en er a t io n a n d r epa ir in C57BL/6 mic e.Me t hods Ma l e C57BL/6 mic e w er e r a n d o ml y d iv id ed in t o a sh a m-o per a t ed g r o u p(Sh a m g r o u p),1 d po st-o per a t iv e g r o u p,2 d po st-o per a t iv e g r o u p,4 d po st-o per a t iv e g r o u p,6 d po st-o per a t iv e g r o u p,a n d 8 d po st-o per a t iv e g r o u p.Mic e in t h e o per a t ed g r o u p u n d er w en t pa r t ia l h epa t ec t o my(P Hx)t o r emo v e t h e l ef t a n d mid d l e l o bes o f t h e l iv er,r espec t iv el y P l a sma a n d l iv er t issu es w er e c o l l ec t ed o n po st o per a t iv e d a y s 1,2,4,6,a n d 8,a n d pl a sma ALT a n d AST a c t iv it y w a s mea su r ed by ALT(a l a n in e a min o t r a n sf er a se)a n d AST(a spa rt a t e a min o t r a n sf er a se)bio c h emic a l a n a l y sis k it s；Ki67-po sit iv e c el l s w er e id en t if ied by immu n o h ist o c h emist r y in ea c h g r o u p；t h e n u mber o f HNF4-a a n d Ki67 d o u bl e po sit iv e c el l s,t h e n u mber o f LYVE1 a n d Ki67 d o u bl e po sit iv e c el l s,a n d t h e n u mber o f p-c a t en in t r a n sf er r ed in t o t h e n u c l eu s w er e d et er min ed by immu n o f l u o r esc en c e met h o d.Th e ex pr essio n o f Wn t 2 pr o t ein in ea c h g r o u p w a s d et ec t ed by West er n bl o t,a n d t h e t ime c h a r a c t er ist ic s o f it s ex pr essio n d u r in g l iv er r eg en er a t io n w er e a n a l y zed.Re sult s Liv er w eig h t a n d l iv ei/bo d y w eig h t r a t io pea k ed o n d a y 6 a f t er P Hx a n d a ppr o a c h ed t h e l ev el o f t h e Sh a m g r o u p.Af t er P Hx,t h er e w a s sev er e l iv er d a ma g e o n d a y 1,bu t it h a d n o rma l ized by d a y 4.On d a y 2 a f t er P Hx,ma in l y h epa t o c y t es pr o l if er a t ed；a n d o n d a y s 4 a n d 6,ma in l y l iv er sin u so id a l en d o t h el ia l c el l s pr o l if er a t ed,w h il e t