苍术素调节cGAS-STING信号通路介导的免疫反应对肺癌细胞恶性生物学行为的影响.pdf

苍术素调节c G A S S T I N G信号通路介导的免疫反应对肺癌细胞恶性生物学行为的影响张美楠,孙鹏冲,魏佳琪,高亚军(北京中医药大学房山医院,肺病科,肿瘤科,北京 )D O I:/b j m y i s s n 收稿日期:;修回日期:作者简介:张美楠(),男,硕士,中医内科主治医师,研究方向:中医肺系疾病相关发热症状及肺癌的中医治疗研究.T e l:;E m a i l:m e i n a n c o m摘要:目的探讨苍术素(A T R)调节环磷酸鸟苷腺苷酸合成酶(c G A S)干扰素基因刺激蛋白(S T I N G)信号通路介导的免疫反应对肺癌细胞恶性生物学行为的影响.方法以不同浓度的A T R及不同的作用时间处理A 细胞,采用C C K 法筛选最佳的A T R浓度及作用时间.取生长状态较好的A 细胞,分为空白组、对照组(二甲基亚砜)、A T R组(m g/LA T R)、A T R s i R N A敲降c G A S(s i c G A S)组(m g/LA T R转染s i c G A S)、A T R阴性对照(s iN C)组(m g/LA T R转染s iN C).h后,流式细胞仪、C C K 分别检测细胞凋亡及增殖变化;T r a n s w e l l实验检测细胞迁移、侵袭;W e s t e r nb l o t检测细胞中金属基质蛋白酶(MM P )、凋亡蛋白(B a x)、增殖蛋白(C y c l i n D)、c G A S、S T I N G蛋白表达.结果 m g/LA T R作用 h为最佳的处理A 细胞的浓度及时间.与空白组、对照组相比,A T R组细胞侵袭及迁移数、增殖率、C y c l i n D、MM P 表达显著下降,凋亡率、c G A S、S T I N G、B a x表达显著增加(P );与A T Rs iN C组相比,A T Rs i c G A S组细胞侵袭及迁移数、增殖率、C y c l i n D、MM P 表达显著增加,凋亡率、c G A S、S T I N G、B a x表达显著降低(P ).结论A T R可通过激活c G A S S T I N G信号通路介导的免疫反应抑制肺癌细胞恶性生物学行为.关键词:苍术素;c G A S S T I NG信号通路;肺癌细胞;恶性生物学行为中图分类号:R 文献标识码:AT h eE f f e c t o fA t r a c t y l o d i no nt h eM a l i g n a n tB i o l o g i c a lB e h a v i o ro fL u n gC a n c e rC e l l sb yR e g u l a t i n g t h e I mm u n eR e s p o n s eM e d i a t e db yc G A S S T I N GS i g n a lP a t h w a yZHANG M e i n a n,S UNP e ngc h o ng,WE I J i aqi,GAOY aju n(D epa r t m e n to fP u l m o n a ryD i s e a s e s,D epa r t m e n to fO n c o l og y,F a ngs h a nH o spi t a l,B e iji ngU n i v e r s i tyo fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e,B e iji ng ,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v eT oi n v e s t iga t e t h ee f f e c to fa t r a c tyl o d i n(A T R)o nt h em a l ign a n tb i o l ogi c a lb e h a v i o ro fl u ngc a n c e rc e l l sbyt h ecyc l i cgu a n o s i n e m o n oph o sph a t ea d e nyl a t esyn t h e t a s e(c G A S)s t i m u l a t o ro fi n t e r f e r o nge n e(S T I N G)s ign a lpa t h w aym e d i a t e di mm u n er e spo n s e M e t h o d sA c e l l sw e r et r e a t e dw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fA T R a n dd i f f e r e n ta c t i o nt i m epo i n t s C C K m e t h o dw a su s e dt os e l e c tt h eopt i m a l c o n c e n t r a t i o na n da c t i o n t i m epo i n t s o fA T R A c e l l s i n t h ego o dgr o w t hc o n d i t i o nw e r ed i v i d e di n t o t h eb l a n kgr o up,c o n t r o lgr o up(d i m e t hyls u l f o x i d e),A T Rgr o up(mg/LA T R),A T Rs i R N Ak n o c k d o w nc G A S(s i c G A S)gr o up(mg/LA T R t r a n s f e c t e dw i t h s i c G A S),a n dA T Rn ega t i v ec o n t r o l(s iN C)gr o up(mg/LA T R t r a n s f e c t e dw i t hs iN C)A f t e r h,c e l l apopt o s i s a n dpr o l i f e r a t i o nw e r ed e t e c t e dr e spe c t i v e lybyf l o wcyt o m e t rya n dC C K ;T r a n s w e l la s s ayw a s u s e d t od e t e c t c e l lm igr a t i o na n di n v a s i o n;W e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c tt h ee xpr e s s i o no fm a t r i xm e t a l l opr o t e i n a s e (MM P ),apopt o s i spr o t e i n(B a x),pr o l i f e r a t i ngpr o t e i n(Cyc l i n D),a n dc G A S,S T I N Gpr o t e i ni nc e l l s R e s u l t s mg/L标记免疫分析与临床 年月第 卷第期A T Rf o r hw a s t h eopt i m a l c o n c e n t r a t i o na n dt i m epo i n to fA c e l l s C o mpa r e dw i t ht h eb l a n kgr o upa n dc o n t r o lgr o up,t h en u m b e r so fc e l l i n v a s i o na n dm igr a t i o n,pr o l i f e r a t i o nr a t e,e xpr e s s i o no fcyc l i n D a n dMM P i nA T Rgr o upd e c r e a s e ds ign i f i c a n t ly,w h i l et h eapopt o s i sr a t e,e xpr e s s i o no fc G A S,S T I N Ga n dB a x i n c r e a s e d s ign i f i c a n t ly(P );C o mpa r e dw i t hA T R s iN Cgr o up,t h en u m b e r s o f c e l l i n v a s i o na n dm igr a t i o n,pr o l i f e r a t i o nr a t e,e xpr e s s i o no fcyc l i n D a n d MM P i nA T Rs ic G A Sgr o upi n c r e a s e ds ign i f i c a n t ly,w h i l e t h eapopt o s i s r a t e,e xpr e s s i o no f c G A S,S T I N Ga n dB a xd e c r e a s e d s ign i f i c a n t ly(P )C o n c l u s i o nA T Rc a ni n h i b i tt h em a l ign a n tb i o l ogi c a lb e h a v i o ro fl u ngc a n c e rc e l l sbya c t i v a t i ngt h ec GA S S T I NGs ign a lpa t h w aym e d i a t e di mm u n er e spo n s e K e yw o r d s:A t r a c tyl o d i n;c G A S S T I N Gs ign a lpa t h w ay;L u ngc a n c e r c e l l s;M a l ign a n t b i o l ogi c a l b e h a v i o r肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的,是发病率和死亡率增长最快的疾病,已经成为世界关注的公共卫生问题.流行病学显示,肺癌新病例数量依然增加,尽管治疗技术不断发展,但肺癌的治疗效果仍不尽如人意,生存率低,预后较差.因此开发新型药物仍然是当前肺癌治疗的重点.传统药物及其衍生的天然化合物目前越来越多地被认为是癌症的潜在治疗方法.苍术素(AT R)主要来源于菊科植物白术的干燥根,具有降低血糖、抗炎和抗肿瘤作用等药理活性,但目前对肺癌的治疗研究甚少报道.环磷酸 鸟 苷腺 苷 酸 合 成 酶(c GA S)是 一 种 细 胞 质D NA传感器,可针对病毒等微生物病原体的入侵发起免疫反应,且c GA S的激活可刺激衔接蛋白干扰素基因刺激蛋白(S T I NG)触发干扰素信号转导,而c GA S S T I NG通路被发现是先天免疫和病毒防御中重要的D NA传感机制,且已扩展到抗肿瘤免疫治疗中 .先前研究表明,激活c G A S S T I N G信号可促进非小细胞肺癌中N K细胞的浸润和抗肿瘤免疫,但A T R能否通过c G A S S T I N G信号通路介导的免疫反应影响肺癌的发展尚不可知,研究表明金属基质蛋白酶(MM P )是MM P家族中的重要成员,与细胞迁移、侵袭呈正相关;凋亡蛋白(B a x)、增殖蛋白(C y c l i n D)分别是促进细胞凋亡、增殖基因 .本研究旨在探讨A T R调节c G A S S T I N G信号通路介导的免疫反应对肺癌细胞凋亡及增殖、侵袭及迁移的影响.材料和方法细胞来源中科院典型培养物保藏中心细胞库提供肺癌细胞系A ,细胞在含 胎牛血清(F B S)的DM E M于 和 C O培养箱中培养.主要材料、仪器成都瑞芬思生物科技有限公司提供A T R(纯度 );I n v i t r o g e n公司提供L i p o f e c t a m i n e 转染试剂 盒;D o j i n d o公 司 提 供C C K 试 剂 及A n n e x i nV F I T C/P I细胞凋 亡检测试剂 盒;G i b c o公 司 提 供DM E M及胎牛血清;广州云舟生物科技提供s i R N A敲降c G A S(s ic G A S)及 阴性对照(s iN C);T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c提供化学发光试剂盒;A b c a m公司提供MM P 、B a x、C y c l i n D、c G A S、S T I N G一抗.B D公司提供F A C SC 流式细胞仪;T h e r m oF i s h e r公司提供酶标仪.C C K 法筛选最佳的A T R浓度及作用时间当A 达到 融合时,将细胞(个细胞/孔)接种在 孔板中,然后分别加入、m g/LAT R处理DMEM培养基,h后,加入 LC C K 溶液,酶标仪测定 n m处的吸光值,分析增殖率变化,以筛选最佳的AT R浓度;同时在最佳的AT R浓度处理、h后,同上操作,分析最佳作用时间.细胞分组及处理取生长状态较好的A 细胞进行以下处理:空白组:不作任何处理;对照组:以 二甲基亚砜(D M S O)处理细胞;A T R组:以 m g/L处理细胞;A T R s i c G A S组:以 m g/L处理细胞并用L i p o f e c t a m i n e 试剂盒将s i c G A S转染细胞;A T R s iN C组:以 m g/L处理细胞并用L i p o f e c t a m i n e 试剂盒将s iN C转染细胞,h后分析A 细胞恶性行为指标变化.C C K 法检测细胞增殖将细胞以 个/孔的密度接种在 孔板中.分组处理后,每孔加入 LC C K 试剂孵育,h后,使用酶标仪在 n m处分析增殖率变化,细L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o 胞增殖率()(实验组O D值空白对照组O D值)/(对照组O D值空白对照组O D值).流式细胞术检测细胞凋亡将收集的细胞用P B S洗涤,之后将细胞重悬于 L结合缓冲液,将细胞与F I T C标记的膜联蛋白和P I在室温下孵育 m i n.所有样品均使用F A C SC 流式细胞仪进行分析细胞凋亡变化.T r a n s w e l l实验检测细胞迁移、侵袭收集各组A 细胞用胰蛋白酶消化并重悬.侵袭测定实验前,将 m g/L基质胶涂在T r a n s w e l l上室表面并在下风干,之后操作侵袭与迁移步骤相同.将 个 细 胞 添 加 含 有 无 血 清R PM I 培养基到上室中,下室填充补充有 F B S的R PM I 培养基.孵育 h后,室温下将细胞用结晶紫染色 m i n.最后经P B S洗涤于光学显微镜下观察,随机选择四个视野并拍摄图像,并对可见细胞进行计数.W e s t e r nb l o t检测相关蛋白表达水平收集细胞并用P B S洗涤两次,然后在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冷R I P A缓冲液中裂解.使用S D S P AG E分离蛋白质,并将 g蛋白质转移到膜上.将P V D F膜与以下一抗孵育:MMP 、B a x、C y c l i n D、c GA S、S T I NG一 抗;第 二天,将样品与HR P偶联的二抗在室温下孵育 h.使用化学发光试剂盒对膜上的蛋白质印迹进行成像,I m a g eJ软件对数据进行量化,分析每个条带的灰度值.统计学处理使用S P S S 软件分析结果,以均数标准差(xs)表示数据,多组间比较采用单因素方差分析,进一步行S NKq检验;两组间比较采用t检验;当P,差异有统计学意义.结果C C K 筛选最佳的A T R浓度及作用时间 m g/LAT R处理A 细胞的细胞增殖率较 m g/LAT R、m g/LAT R、m g/LAT R处理显著下降(P),但与 m g/LAT R处理A 细胞的增殖率差异无统计学意义(P),故后续研究以浓度为 m g/LAT R处理细胞.见表.表不同浓度A T R对A 细胞增殖率的影响(n,xs)项目增殖率()m g/LA T R m g/LA T R a m g/LA T R b m g/LA T R a b c m g/LA T R a b c注:与 m g/LA T R比较,aP;与 m g/LA T R比较,bP;与 m g/LA T R比较,cP 处理 h的A 细胞的增殖率较处理 h、h显著下降(P),但与作用 h的增殖率差异无统计学意义(P),故以 h为后续作用时间.见表.表不同作用时间对A 细胞增殖率的影响(n,xs)项目增殖率()h h a h a b h a b注:与 h比较,aP;与 h比较,bP A T R对A 细胞增殖率的影响与空白组、对照组相比,A T R组细胞增殖率显著下降(P );与A T Rs iN C组相比,A T Rs ic G A S组细胞增殖率显著增加(P ).见表.表细胞增殖率的变化(n,xs)组别增殖率()空白组 对照组 A T R组 a bA T Rs iN C组 A T Rs i c GA S组 c注:与空白组比较,aP;与对照组比较,bP;与A T Rs iN C组比较,cP A T R对A 细胞凋亡率的影响与空白组()、对照组()相比,AT R组细胞凋亡率()显著增加(P);与AT Rs iN C组()相比,AT Rs i c GA S组()细胞凋亡率显著下降(P).见图.标记免疫分析与临床 年月第 卷第期图观察细胞凋亡变化A T R对A 细胞侵袭、迁移的影响与空白组侵袭()及迁移数()、对照组侵袭()及迁移数()相比,A T R组细胞侵袭()、迁移数()显著下降(P );与A T R s iN C组(、)相比,A T R s i c G A S组细胞侵袭()、迁移数()显著增加(P ).见图.图观察细胞侵袭及迁移变化A T R对A 细胞MMP 、B a x、C y c l i n D、c G A S、S T I N G蛋白表达水平的影响与空白组MM P ()、B a x()、C y c l i n D()、c G A S()、S T I N G()表达及对照组MM P ()、B a x()、C y c l i n D()、c G A S()、S T I N G()表达相比,A T R组细胞中C y c l i n D()、MM P ()表达显著下降,c G A S()、S T I N G()、B a x()表达显著增加(P );与A T R s iN C组MM P ()、B a x()、C y c l i n D()、c G A S()、S T I NG()相比,AT Rs i c GA S组细胞中C y c l i n D()、MMP ()表达显著增加,c GA S()、S T I NG()、B a x()表达显著下降(P).见图.注:A为空白组;B为对照组;C为A T R组;D为A T R s iN C组;E为A T Rs i c GA S组图A 细胞中MMP 、B a x、C y c l i n D、c G A S、S T I N G蛋白表达(W e s t e r nb l o t图)L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o 讨论天然药物以其高效低毒的特点受到各个领域的研究和开发,包括癌症方面的治疗.AT R是茅苍术中含量最高的主要活性成分,其具有降血糖、抗炎、调节胃肠动力等作用 .研究 表明AT R可以增加大鼠的心率并降低舒张压,发挥正性肌力作用.此外,AT R具有潜在的抗肿瘤作用,如AT R可以抑制肝癌细胞(H u h、H c c m)的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡和细胞周期停滞.A T R以时间和剂量依赖性方式抑制胆管癌(H u C C T )细胞生长及迁移和侵袭.值得注意的是,Z HA N G等 研究发现A T R可抑制肺癌细胞A 、N C I H 、N C I H 和H C C 的增殖,尤其是对A 细胞,且A T R可抑制A 细胞增殖及迁移,诱导细胞凋亡和细胞周期停滞,表现出良好的抗癌作用.本研究通过设置不同浓度的A T R及时间处理A 细胞,结果发现 m g/LA T R作用 h时,A 细胞增殖率接近 .m g/LA T R处理A 细胞后,细胞增殖率及侵袭和迁移数、C y c l i n D 及MM P 表达显著被下降,而细胞凋亡率及B a x表达显著增加,表明A T R可显著抑制A 细胞的恶性行为发展.c G A S S T I N G信号在先天性抗肿瘤免疫中起重要作用,是一个有吸引力的抗癌免疫治疗药物靶点.c G A S是一种直接的D N A受体,导致S T I N G的激活,而S T I N G是介导胞质D N A诱导的先天免疫反应的必要信号接头,其通路激活可以诱导免疫抑制肿瘤微环境.S T O R O Z Y N S K Y等 研究表明放射疗法可通过c G A SS T I N G通路的激活启动先天免疫信号,促进适应性免疫反应以消灭癌症,发挥抗肿瘤免疫反应.本研究结果显示,A T R处理A 细胞后,S T I N G、c G A S表达显著上调,推测A T R抑制癌细胞增殖及侵袭迁移,诱导其凋亡,进可能与激活c G A SS T I N G通路有关.为验证实验推测,以s i c G A S进行回复验证,结果发现s i c G A S逆转了A T R对A 细胞恶 性 行 为 的 抑 制 作 用,表 明A T R是 通 过 激 活c G A S S T I N G信号通路抑制肺癌细胞恶性生物学行为,进而发挥抗肿瘤免疫作用.综上所述,A T R可抑制肺癌细胞恶性生物学行为,可能与激活c G A S S T I N G信号通路进而发挥抗肿瘤免疫作用有关.但文章机制较为复杂,仅从体外研究无法更好地应用于临床,因此还需进一步深入研究.参考文献XUSH,B O Y H,MA H C,e ta l l n c R NA L I N C p r o m o t e sp r o l i f e r a t i o n,m i g r a t i o n,i n v a s i o na n di n h i b i t i o no fa p o p t o s i so fn o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e rc e l l sb ya c t i n ga sas p o n g eo fm i R pJ O n c o lL e t t,():鲁战胜,刘波,孙勇攀,等 m i R p靶向ON E C UT 抑制肺癌细胞迁移,侵袭的实验研究J临床肿瘤学杂志,():D OUJ,WAN GZ,MAL,e ta l B a i c a l e i na n db a i c a l i ni n h i b i tc o l o nc a n c e r u s i n g t w o d i s t i n c tf a s h i o n s o f a p o p t o s i s a n ds e n e s c e n c eJ O n c o t a r g e t,():邵晨,胡建鹏,严金川,等苍术素对人结肠癌L S 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r a c t y l o d i nI n d u c e sm y o s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d p r o m o t e s g a s t r i ce m p t y i n gt h r o u g hg h r e l i nr e c e p t o rJ E v i dB a s e dC o m p l e m e n tA l t e r n a tM e d,:GAOL,Z HAN G W H,WAN GY W,e t a l P o s i t i v e i n o t r o p i ce f f e c t o f a t r a c t y l o d i n i n n o r m a l r a t s a n d i t s u n d e r l y i n gm e c h a n i s mJ Z h o n g g u o Y i n g Y o n gS h e n gL iX u eZ aZ h i,():HEY,F AN GD,L I AN GT,e ta l A t r a c t y l o d i n m a yi n d u c ef e r r o p t o s i so fh u m a nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac e l l sJA n nT r a n s lM e d,():A C HA R Y AB,C HA I J A R O E N K U L W,N A B A N G C HA N G KA t r a c t y l o d i ni n h i b i t e dt h e m i g r a t i o n a n di n d u c e d a u t o p h a g yi nc h o l a n g i o c a r c i n o m ac e l l sv i a P I K/A K T/m T O R a n d p MA P Ks i g n a l l i n gp a t h w a y sJ JP h a r mP h a r m a c o l,():Z HAN GT,L IS M,L 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