扁桃酸对肺腺癌H1299细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及其机制.pdf

742安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：34：20 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1339.008.h t ml扁桃酸对肺腺癌H1299细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及其机制陆海青打李艳丽駕华兹涵打肖佳欣駕凌 博打叶广彬彳摘要 目的 探索扁桃酸对肺腺癌H1299细胞增殖、凋亡 和迁移的作用及相关的分子机制。方法 CCK-8检测 H1299细胞增殖能力变化；Ho ec h st 33258/P I双染分析 H1299细胞凋亡水平;划痕和Tr a n sw e U实验分析H1299细 胞侵袭迁移能力变化;West er n bl o t检测细胞增殖、凋亡和迁 移相关通路蛋白的表达。结果不同浓度扁桃酸均可抑制 H1299细胞增殖活力和侵袭迁移能力（P 0.05）o扁桃酸 可诱导细胞增殖、凋亡通路蛋白ba x、c l-c a spa se-3高表达,p-st a t 3低表达（P 0.05）o此外，抑制侵袭迁移相关蛋白 MMP-9和Vimen t i n蛋白表达（P 0.01）o结论 扁桃酸抑 制肺腺癌细胞H1299的增殖，提升细胞凋亡水平，其分子生 物学机制可能与st a t 3活化降低及激活ba x/c a spa se-3信号轴 密切相关;抑制H1299细胞侵袭迁移能力，与MMP-9和Vi-men t in蛋白表达降低相关。关键词肺腺癌;扁桃酸;增殖;凋亡;迁移中图分类号R932文献标志码A 文章编号1000-1492（2023）05-0742-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.007中医药防治肺癌广泛应用于临床，且在疗效和 预后中具有其独特的优势1-2o以苦杏仁为核心组 方药物的薯議丸、清气化痰丸和益肺清化膏，均可明 显改善肺癌患者的临床疗效，尤其在增强患者放化 疗的疗效、缓解咳喘等临床症状和提升生活质量方 面优势明显3-40研究A7表明，苦杏仁昔是苦杏 仁抗肿瘤的核心有效成分,苦杏仁昔抗肿瘤的部分 作用是由其催化产物所实现的，如肿瘤细胞无法代 谢氢氤酸（苦杏仁昔催化产物），故诱导肿瘤细胞凋2022-12-20 接收基金项目：国家自然科学基金（编号=82060540）;广西高校中青年教 师基础能力提升项目（编号：2022KY0541、2022KY0533）；广西壮族自治区级大学生创新创业训练计划项目（编号:S202210599069、S202110599069,S202110599095）作者单位:右江民族医学院1药学院、2基础医学院，百色533000 作者简介:陆海青，女,本科；叶广彬，男,实验师，责任作者,E-ma il：y g b9064 126.c o m；凌 博，男，教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:l in g bo 268 163.c o m 亡。但是，同为苦杏仁昔催化产物的扁桃酸，在肺腺 癌中的作用及机制尚不清楚。该研究以不同浓度扁 桃酸干预肺腺癌H1299细胞，分析肺腺癌细胞增 殖、凋亡和迁移能力的变化，聚焦相关通路蛋白的检 测，从而整体分析扁桃酸抗肺腺癌细胞的作用和机 制,继而为苦杏仁及苦杏仁昔对肿瘤治疗的临床应 用提供实验依据。1材料与方法1.1实验材料 人肺腺癌H1299细胞购于中国科 学院细胞库。基础培养基DMEM、10%胎牛血清（美国Gibc o公司）制备完全培养基,0.25%胰蛋白 酶（美国Gibc o公司）用于细胞消化。扁桃酸购于美 国Sig ma公司，用DMSO溶解，制备成母液（500|x g/ml），进行滤膜过滤除菌除杂质，再用培养基稀释成 不同浓度备用。CCK-8试剂购于中国Bio sh a r p公 司；Ho ec h st 33258和P I试剂购于北京索莱宝科技有 限公司;Ma t r ig el基质胶和Tr a n sw el l小室购于美国 BD公司；West er n bl o t实验基础试剂:SDS-P AGE凝 胶试剂盒、BCA检测试剂盒和ECL超敏显影试剂盒 购于上海碧云天生物技术有限公司；st a t 3、p-st a t 3、ba x、bc l2、c a spa se-3 A c l-c a spa se-3 MMP9、Vimen t in 和p-t u bu l in单克隆抗体均购于艾博抗（上海）贸易 有限公司。1.2方法1.2.1 CCK-8检测 取对数期生长的H1299细胞 制成细胞悬液，计数并接种于96孔板，每孔接种 100叭6 x 104个/孔），设置6个复孔。待细胞长满 后，更换含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5、10和20|jLg/ml）的完全培养基，分别培养24 h和48 h。弃培养 基，再分别滴加CCK-8溶液（10 pV孔），培养箱中 孵育4 h后，用酶标仪在450 n m波长下检测各孔的 吸光度值,计算细胞增殖抑制率并绘制曲线。1.2.2 Ho ec h st 33258/P I双染 取对数期生长的 H1299细胞制成细胞悬液，调整细胞密度并接种到 6孔板中（2 x IO个/孔）培养。实验组给予10 p,g/ml和20|x g/ml扁桃酸，对照组给予0|x g/ml扁桃酸 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)743干预24h。收集细胞，加入4%多聚甲醛固定4弋 10 min,l 000 r/min离心3 min弃上清液，加入1 ml 预冷P BS重悬细胞沉淀,1 000 r/min离心3 min弃 上清液，滴加100 pul Ho ec h st 33258和P I混合工作 液重悬细胞沉淀,室温避光染色10 min,加入1 ml 预冷P BS洗涤,1 000 r/min离心3 min弃上清液，残 留上清液50 pl重悬细胞，加入10 pil抗荧光淬灭 剂。取10 pl细胞悬液滴至载玻片，置于倒置荧光 显微镜下拍照。凋亡细胞的判定标准为细胞呈高蓝 光低红光。1.2.3划痕实验 取对数期生长的H1299细胞制 成细胞悬液，调整细胞密度并接种到6孔板中（2 x 105个/孔）培养。待细胞长满后，用10讪枪头在孔 内竖线划痕，并添加含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5和 10 jjig/ml）的无血清培养基进行干预。培养24 h 后，用显微镜进行观察孔内细胞的愈合情况，拍照。1.2.4 Tr a n sw el l迁移实验 将孔径0.8|im小室 放入24孔板中,0.25%胰酶消化处理后的H1299 细胞，离心去上清液,P BS洗涤2遍,用无血清培养 基重悬细胞，计数并调整细胞密度为2 x IO个/ml。取100（jl1细胞悬液加入小室,同时在Tr a n sw el l下室 分别加入600 pl含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5和10 pg/ml）的完全培养基，培养24 h后，用4%多聚甲 醛固定和1%结晶紫染色,P BS洗涤3次，棉签轻轻 擦去上层未迁移的细胞，显微镜下随机选取3个视 野，利用Ima g e J进行细胞计数。1.2.5 Tr a n sw el l侵袭实验 0.25%胰酶消化对数 生长期H1299细胞，用无血清培养基重悬细胞，调 整细胞密度至2 X IO个/ml。Tr a n sw el l下室分别加 A600 111含不同浓度扁桃酸（0、5、7.5和10 Jig/ml）的完全培养基，上室先铺水化的BD胶基底膜,再加100|x l细胞悬液。培养24 h后，用4%多聚甲 醛固定和1%结晶紫染色,P BS洗涤3次，棉签轻轻 擦去上层未迁移的细胞，显微镜下随机选取3个视 野，利用Ima g e J进行细胞计数。1.2.6 West er n bl o t检测 不同浓度扁桃酸（0、5、10和20|x g/ml）干预H1299细胞后，取细胞总蛋白 进行SDS-P AGE电泳,转膜。P VDF膜用5%脱脂奶 粉封闭2 h,TBST洗涤3遍，添加一抗（一抗稀释液 1：2 000稀释）后4咒静置过夜。TBST洗涤3遍,二抗（5%脱脂奶粉1:1 000稀释）室温孵育2 h。取出P VDF膜滴加ECL显影液，在凝胶成像系统下 显影成像，用Ima g e J分析蛋白条带灰度值。1.3 统计学处理 实验数据采用SP SS 23.0和 Gr a ph pa d P r ism 5.0软件进行统计学分析和作图。计量数据采用力土 S表示，符合正态分布和方差齐性 的多组间比较采用单因素方差分析（o n e w a y ANO-VA），两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异 有统计学意义。2 结果2.1扁桃酸抑制肺腺癌H1299细胞增殖 为研究 不同浓度扁桃酸对肺腺癌细胞H1299增殖的影响,用不同浓度扁桃酸分别作用于H1299细胞24 h和 48 h,从而确定扁桃酸的时效和量效。结果表明，不 同浓度扁桃酸对H1299细胞的增殖活力均有抑制 作用（24 h：F=51.6,P 0.001；48 h：F=253.7,P 0.001）,提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞 增殖（图1）。A*5 7.5 10扁桃酸浓度g/ml)200150500100*-I-*5 7.5 10 20扁桃酸浓度g/ml)图1扁桃酸对H1299细胞增殖能力的影响A：24 h；B：48 h；与0 ix g/ml 比较：*P 0.0012.2扁桃酸诱导肺腺癌H1299细胞凋亡 采用 Ho ec h st 33258联合P I双染可以较好区分活细胞和 细胞的凋亡、坏死。结果表明,不同浓度扁桃酸处理 肺腺癌H1299细胞24 h后，实验组（10|ig/ml和20 Mg/ml）细胞凋亡（细胞呈高蓝光低红光）数量均明 显高于对照组（0 l ig/ml）,提示扁桃酸可诱导肺腺 744安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)癌H1299细胞凋亡(图2)。2.3扁桃酸降低肺腺癌H1299细胞的侵袭迁移 划痕实验结果显示,不同浓度扁桃酸处理H1299细 胞24 h后，实验组的细胞迁移率均明显低于对照组(F=332.7,P 0.001)。Tr a n sw eU 迁移实验结果显 示,不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后，实验 组的细胞迁移数5 Mg/ml:(1 552.33 4&13)个/视野；7.5 Mg/ml：(611.67 124.71)个/视野；10 ix g/ml：(266.33 23.07)个/视野均明显低于对照 组的细胞迁移数0 044.67 41.86)个/视野,差异有统计学意义(F=532.6,P 0.001)。以上结果提示扁桃酸可以抑制肺腺癌H1299细胞 迁移。见图3。Tr a n sw eU侵袭实验结果显示，不同浓度扁桃酸处理H1299细胞24 h后,实验组的细胞穿透数5|ig/ml:(464.00 69.42)个/视野；7.5|ig/ml:(65.67 26.31)个/视野；10|ig/ml：(28.00 14.73)个/视野均明显低于对照组的细胞穿透数 0|ig/ml：(657.67 101.12)个/视野，差异有统 计学意义(F=65.94,P 0.001),这提示扁桃酸可 以抑制肺腺癌H1299细胞侵袭。见图3。|x g/ml)比较,实验组(5、10和20|x g/ml)中的细胞 凋亡相关蛋白c l-c a spa se-3/c a s pa se-3明显表达上升(F=1816,P 0.001),bc l-2/ba x 明显表达降低(F=1855,P 0.001)；而细胞侵袭迁移相关蛋白 MMP-9(F=336.2,P 0.001)和 Vimen t in(F=35&9,P 0.001)明显表达降低。这提示扁桃酸可 以诱导肺腺癌细胞H1299凋亡,并抑制H1299细胞 上皮间质转化，从而达到抑制细胞侵袭迁移的作用。2.5扁桃酸对stat3信号通路的影响不同浓度扁 桃酸处理H1299细胞24 h后结果如图5所示。与 对照组(0|x g/ml)比较，不同浓度扁桃酸均能降低 p-st a t 3/st a t 3 的表达(F=236.4,P 0.001),抑制 st a t 3磷酸化水平，从而导致st a t 3信号通路失活，这 提示扁桃酸可以抑制st a t 3信号通路的激活。3讨论扁桃酸是苦杏仁昔催化产物中非常重要的类 型。目前扁桃酸的临床应用和研究主要集中在抗 炎、镇痛和抗菌，与肿瘤的相关性研究不明确。为分析扁桃酸与抗肿瘤活性的相关性,本研究用不 同浓度扁桃酸对肺腺癌H1299细胞进行干预，发现扁桃酸可抑制肺腺癌H1299细胞的增殖活性。肺2.4 扁桃酸对相关通路bax/caspase-3%MMP-9和图2扁桃酸对H1299细胞凋亡的影响X400安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)745A24 h0 pig/ml5|ig/ml7.5 p,g/ml10|ig/mlOhF1.5世*.o.o.5.5.5.5ass.o.o.86 4.2.86 4.2 o.o.a ao.o.a a()耦iHgffiiHgffi0000 5 7.5 10扁桃酸浓度0 5 7.5 10扁桃酸浓度0 5 7.5 10扁桃酸浓度(y g/ml)图3扁桃酸对H1299细胞侵袭迁移能力的影响x 40A戊!J痕实验;B：Tr a n sw el l迁移实验;C：Tr a n sw el l侵袭实验;D:戈J痕实验的定量统计图;E:Tr a n sw el l迁移实验的定量统计图;F:Tr a n sw el l侵袭实验的定量统计图;与0 pig/ml比较:*P 0.05,*P 0.001扁桃酸可抑制肺腺癌H1299细胞中p-st a t 3的表达,继而抑制st a t 3的活化。鉴于st a t 3活化是肺癌细胞 增殖的核心调控通路，扁桃酸抑制st a t 3的活化是其 降低H1299细胞增殖的有效机制之一。同时，分析 了扁桃酸对肺腺癌H1299细胞凋亡水平的影响，结 果表明扁桃酸可显著提升H1299细胞的凋亡水平。在肺腺癌细胞的凋亡途径中，ba x是经典的促凋亡 蛋白，接受凋亡信号后进入线粒体膜,破坏线粒体膜 的完整性，继而促进线粒体释放细胞色素C,继而发 挥c a s pa se的破坏细胞结构和诱导细胞凋亡的作 用。本研究结果表明扁桃酸显著提升H1299细 胞中ba x的表达。证实了扁桃酸促凋亡的机制与 746 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)Ac a spa se-3c l-c a spa se-3AB60MMP-9Vimen t inp-t u bu l in0 jig/ml 5 p,g/ml 10 jig/ml 20 p,g/ml1.5st a t 30 p,g/ml 5|ig/ml 10 p,g/ml 20 jig/mlp-t u bu l inp-st a t 32*旳山嘲衩宾4a bd图4扁桃酸对细胞凋亡和侵袭迁移相关蛋白表达的影响A West er n bl o t检测H1299细胞中凋亡和侵袭迁移相关蛋白的 表达结果；B:相关的蛋白表达比值;a:c l-c a spa se-3/c a spa se3；b:bc l-2/ba x；c:MMP-9/p-t u bu l in；d:Vimen t in/p-t u bu l in；与 0|x g/ml 比较:*P 0.01,*P 0.001ba x信号轴关系密切。ba x促进线粒体释放细胞色 素C中，c a spa se-3起到关键作用，也是其经典的下 游通路蛋白，然而c a spa se-3行使其功能，需要在细 胞内活化成 c l-c a spa se-312。因而采用 West er n bl o t 检测了 c l-c a s pa se-3的表达量,发现扁桃酸显著提升 H1299细胞中c l-c a s pa se-3的表达。由此可以得出,扁桃酸促ba x信号轴的下游效应蛋白为c a spa se-3,即可促进ba x下游c a spa s e-3的活化。提示ba x/c a spa se-3信号轴是潜在的扁桃酸诱导H1299细胞 凋亡的作用通路之一。肿瘤细胞侵袭迁移能力变化也是评价潜在抗癌 药物的核心指标之一。本研究用划痕和Tr a nsw el l 实验证实扁 桃酸显著降低肺腺癌 H1299细胞 的侵袭迁移能力。研究表明,MMP-9发挥着降解 细胞外基质和降低细胞黏附力的功能，故被认为是 肿瘤细胞获得侵袭转移能力的起始因素之一。Vimen t in 蛋白是肿瘤细胞运动过程中的关键骨架蛋白,通过促进肿瘤细胞伪足形成，来提升肿瘤细胞的上1.00.500*5 10扁桃酸浓度20图5扁桃酸对stat3蛋白表达的影响A：West er n bl o t检测H1299细胞中磷酸化st a t 3和总st a t 3蛋白的 表达结果;B：磷酸化st a t 3与总st a t 3的蛋白表达比值;与0|ig/ml比 较：*P 0.05,*P 0.001皮-间质转化，继而提升其侵袭运动能力g。本研 究的结果证实扁桃酸降低肺腺癌H1299细胞中 MMP-9和Vimen t in蛋白的表达。鉴于MMP-9和 Vimen t in蛋白的功能，可以得出扁桃酸通过降低 MMP-9和Vimen t in蛋白的表达，抑制肿瘤细胞外基 质的降解和上皮间质转化，从而抑制H1299细胞的 侵袭迁移能力。综上所述，扁桃酸抑制st a t 3的活化是其降低 H1299细胞增殖的有效机制之一；扁桃酸诱导 H1299细胞凋亡与ba x/c a spa se-3信号轴的活化关 系密切;扁桃酸通过降低MMP-9和Vimen t in蛋白的 表达，与其抑制H1299细胞的侵袭转移能力密切相 关。参考文献1 Wa n L Q,Ta n Y,Jia n g M,et a l.Th e pr o g n o st ic impa c t o f t r a d it io na l Ch in ese med ic in e mo n o mer s o n t u mo r-a sso c ia t ed ma c r o ph a g es in n o n-sma l l c el l l u n g c a n c er J.Ch in J Na t Med,2019,17(10):729-37.2 李庭树，黄锁义.鸡骨草提取物体内抗肿瘤活性研究J.右江 民族医学院学报,2020,42(6)：690-7.3 许炜茹，韩 冬,樊庆胜，等.清气化痰丸治疗痰热壅肺型肺癌安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma 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io n J.Cel l s,2021,10(6)：1484.15 Na H H,Ry u J M,Kim K C.Kn o c k o u t o f Fo sB g en e c h a n g es d r u g sen sit iv it y a n d in v a sio n a c t iv it y via t h e r eg u l a t io n o f Bc l-2,E-c a d-h er in,p-c a t en in,a n d v imen t in ex pr essio n J.Bio c h em Bio ph y s Res Co mmu n,2021,567：131-7.Effect of mandelic acid on the proliferation,apoptosis and migration ability of lung adenocarcinoma H1299 cells and its mechanismLu Ha iq in g1,Li Ya n l i2,Hu a Zih a n1,Xia o Jia x in2,Lin g Bo1,Ye Gu a n g bin2(1 School of Pharmacy,2 School of Basic Medical Sciences,Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000)Abstract Obje c t ive Th e r esea r c h w a s a imed a t ex pl o r in g t h e ef f ec t s o f ma n d el ic a c id o n t h e pr o l if er a t io n,a po pt osis a n d mig r a t io n o f H1299 l u n g a d en o c a r c in o ma(LU AD)c el l s a n d t h e r el a t ed mo l ec u l a r mec h a n isms.Me t hods CCK-8 w a s u sed t o d et ec t c h a n g es in t h e pr o l if er a t io n a bil it y o f H1299 c el l s；Ho ec h st 33258/P I d o u bl e-st a in in g a ssa y w a s u sed t o a n a l y ze t h e a po pt o sis o f H1299 c el l s；Tr a n sw el l a n d mig r a t io n a ssa y s w er e u sed t o a n a l y ze c h a n g es in t h e in v a siv e a n d mig r a t io n a bil it y o f H1299 c el l s；West er n bl o t w a s u sed t o d et ec t t h e ex pr essio n o f pr o l if er a t io n,a po pt o sis a n d mig r a t io n-r el a t ed pa t h w a y pr o t ein s.Re sult s Dif f er en t c o n c en t r a t io n s o f ma n d el ic a c id in h ibit ed t h e pr o l if er a t io n v ia bil it y a n d in v a sio n a n d mig r a t io n a bil it y o f Hl299 c el l s(P 0 05)Ma n d el ic a c id in d u c ed h ig h expr essio n o f ba x a n d c l-c a spa se-3 a n d l o w ex pr essio n o f p-st a t 3 in pr o l if er a t io n a n d a po pt o sis pa t h w a y s(P 0.05).In a d d it io n,it in h ibit ed t h e ex pr essio n o f MMP-9 a n d Vimen t in pr o t ein s,w h ic h w er e r el a t ed t o in v a sio n a n d mig r at io n(P 0.01).Conc lusion Ma n d el ic a c id in h ibit ed t h e pr o l if er a t io n o f H1299 LUAD c el l s a n d el ev a t ed t h e l ev el o f a po pt o sis,a n d mo l ec u l a r bio l o g ic a l mec h a n ism mig h t be c l o sel y r el a t ed t o t h e d ec r ea sed a c t iv a t io n o f st a t 3 a n d a c t iv a t io n o f ba x/c a spa se-3 sig n a l in g a x is.Th e in h ibit io n o f in v a siv e a n d mig r a t io n a l a bil it y o f Hl299 c el l s ind u c ed by ma n d el ic a c id w a s a sso c ia t ed w it h t h e d ec r ea sed ex pr essio n o f MMP-9 a n d Vimen t in pr o t ein s.Key words l u n g a d en o c a r c in o ma；ma n d el ic a c id；pr o l if er a t io n；a po pt o sis；mig r a t io n