基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究毕业设计.doc

(此文档为此文档为 wordword 格式，下载后您可任意编辑修改！格式，下载后您可任意编辑修改！)基于脂蛋白纳米载体的小干扰基于脂蛋白纳米载体的小干扰 RNARNA 靶向靶向递送方法研究递送方法研究 摘要 RNA干扰作为一种治疗途径特别是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而，系统递送siRNA需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫B型1受体类(SR-B1)受体以清除HDL(HDL)粒子来维持其高生长水平。本文运用这种细胞特性来实现高效siRNA递送，通过siRNA偶联重组成HDL(rHDL)纳米粒子建立一种新型的siRNA制剂。这里,我们证实rHDL纳米粒子促进了siRNA体内高效递送。此外，概念证明治疗研究中,这些纳米粒可以有效沉默两种蛋白的表达，在原位卵巢和结肠直肠癌小鼠模型中，这两种蛋白是癌症生长和转移的关键(信号传感器和转录激活因子3以及粘着斑激酶)。这些数据表白，rHDL纳米粒是一种新型、高效的siRNA载体，因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法的基础。介绍 RNA干扰（RNAi）逐渐被认为是一种潜在，高效的治疗途径。这个概念根源于干扰RNA（例如，小分子干扰RNA）基因沉默的能力，传统治疗方法很难靶向这些基因，如抗体或小分子克制剂。即使干扰RNA靶向特定基因的确很有前景的，但需要体内高效和生物相容性的siRNA递送手段来实现其完整的治疗潜力。虽然一些使用脂质体或其它纳米粒子的跨膜转运方法也已经报道，但是因毒性和其他因素其治疗应用受到限制。因此，需要新型，更具有特定性的方法以系统递送siRNA。脂蛋白，特别是HDL，是脂质运送系统的必要成分。HDL在胆固醇逆转中起着举足轻重的作用，通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除（胆汁排泄或在肝肠循环使用）。关于内源性，HDL纳米粒是完全可生物降解的，并且也无引起免疫反映的相关报道。此外，众所周知，HDL纳米粒可以逃避网状内皮系统的吸取，比大多数药物制剂或其他脂蛋白，他们在循环中表现出更长的滞留时间。HDL纳米粒循环的核心部分就是摄取，通过清道夫受体B类1型（SR-B1）受体介导的机制，这种受体重要表达在肝脏和恶性肿瘤细胞。基于体积小，屏蔽疏水核心，受体介导的摄取能力等这些有效特性，HDL纳米粒是一种抱负的药物载体。重组HDL是由人的HDL合成得到的。该rHDL纳米粒的组成部分有磷脂酰胆碱，载脂蛋白A-1，胆固醇和胆甾醇酯（图1A）。rHDL纳米粒都很小，直径约12至18纳米。为了研究siRNA靶向输送途径，一些肿瘤细胞受体已被获知。SR-B1受体重要在肝脏中的表达，也在肾上腺或正常卵巢组织也较小限度表达。然而，在恶性肿瘤细胞中SR-B1非常显著表达。增长HDL摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。例如，乳腺癌细胞通过增长SR-B1的表达来增长胆固醇酯的摄取。因此，考虑到SR-B1在HDL中的作用，我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。siRNA基因沉默治疗非常有效，其他方法很难靶向这些基因。信号传感器和转录激活因子3 STAT3 都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反映。激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展（例如，细胞增殖，分化和存活）的关键过程。虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活，但是它在正常组织中表达，并且参与许多正常细胞过程。因此，使用小分子克制剂或其他非特异性靶向STAT3的手段也许会导致许多不必要的副作用，因此需要有效途径限制毒性。同样，粘着斑激酶（FAK）对于肿瘤细胞存活，转移，入侵也非常重要。在卵巢癌患者中，FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特性相关，这有助于弱势细胞生存。概念证明，我们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用r HDL纳米粒靶向STAT3和FAK治疗有效性。原料与方法 rHDL 纳米粒的制备和 siRNA 的偶联 siRNA 偶联到 rHDL 纳米粒，并储存在-20C。简朴地说，载脂蛋白 A-I ，是 rHDL 纳米粒的重要核蛋白，在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。然后，脂类混合物（胆固醇 C 胆固醇油酸 CE 蛋黄卵磷脂PC，摩尔比的1:5:1.3:115）在氮气流中干燥。5mg 的 siRNA 用25g 低聚赖氨酸（平均分子量为500-2023）在30预先孵育 30分钟，然后加入到脂质成分中。低聚赖氨酸 siRNA 混合物偶联脂质，分散在60l 的 DMSO 和1.4ml 的缓冲液（10mM Tris，0.1M KCl，1mM pH 为8.0的 EDTA）。胆酸钠，140L（100mgml 溶于为 PBS）形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:1.6。载脂蛋白 A-I（12.7mgml）溶于0.4mlPBS 加入到混合物中，终体积用 PBS 调整到2ml。4 孵育12h，接着用2L 的 PBS 透析 2天，换 3次透析缓冲液。制剂的稳定性凝胶排阻色谱中用的RiboGreen 检测。rHDL 靶向 siRNA 溶液用0.9 的生理盐水稀释到为0.2mgKg的 siRNA0.2ml rHDL 的溶液。此外，rHDL 纳米粒子的电位使用电位粒度分析仪检测。简朴地说，1ml 的纳米粒加入1ml 的比色皿中作 zeta 电势检测。透射电子显微镜法 在0.125M 乙酸铵，2.6 mM 的碳酸铵，0.26 mM 的 EDTA，pH 值7.4中透析后，rHDL 样品用 pH 值7.2的2磷钨酸钠并放在福尔瓦200目镍网支持膜包裹的碳涂层进行负染。颗粒明显可见（放大50000倍），通过使用 Zeiss 910透射型电子显微镜。得到的图片有所增强，粒径可通过 Adobe ImageCS2 软件检测。细胞系和培养条件 衍生和源于人体上皮卵巢癌细胞系的 HeyA8，SKOV3ip1，HeyA8-MDR细胞系在之前已有研究。人类大肠癌细胞株(HCT116)对于 Dr Lee Ellis。本篇文章中所用到所有细胞株都是德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心的，通过表征细胞线芯的研究得到认证。简朴地说,HeyA8和 SKOV3ip1细胞在添加15%胎牛血清和0.1%硫酸庆大霉素的 RPMI1640培养基中培养。HeyA8-MDR 细胞在添加有15%的 FBS 和300 ng ml 紫杉醇以及0.1%硫酸庆大霉素的 RPMI 1640培养基培养。HCT116细胞在添加10%的 FBS 和0.1%硫酸庆大霉素的改良伊格尔培养基中培养。所有的细胞都保存在37C，5%CO295%的孵箱中。体外基因沉默 STAT3（靶序列5-GCCUCUCUGCA GAAUUCAA-3），粘着斑激酶（靶序列5CCACCUGGGCCAGUAUUAU-3），和一个非定标性的控制序列（靶序列的5-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3）均购自 Sigma-Aldrich 公司，RNAiFect 转染试剂按照厂家建议使用。简朴地说，SKOV3ip1和 HeyA8-MDR卵巢癌细胞系在一式三份的六孔板用1.33g 特定 siRNA 孔进行转染，在70 处汇合。分别使用1:3.75的 siRNA 和转染试剂进行转染，对照 siRNA 和 STAT3 siRNA 组无血清培养基培养6 =50)在 SB-R1的表达可以用福尔马林固定石蜡包埋标本检测，这种方法源于德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心，是通过机构审查委员会批准。高表达或低表达都是由妇科病理学家使用下列程序来决定的:强度从1到3,分布是从1到4。TUNEL 染色 取新鲜冷冻的实验组(SKOV3ip1模型)肿瘤组织部分，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口尾部标记进行末端染色，再用1:10,000的 Hoechst进行复染。凋亡小体通过绿色荧光表达。Tunel 阳性细胞在10个200区域，每组分为5个部分进行计数，得到平均值。siRNA 选择性递送 SKOV3ip1雌性裸鼠用0.2mgKg 的荧光标记对照 siRNA 或无标记对照 siRNA（每组 n=3时）静脉注射或腹腔注射。48小时后，处死小鼠，收集肿瘤和器官（脑，心脏，肺，肝，肾，脾）并冷冻。荧光染色 取新鲜冰冻得原位卵巢癌模型（SKOV3ip1）的肿瘤组织，置于丙酮中，用 PBS 洗涤，并用 Hoechst（1:10,000）复染。荧光显微镜在400 的视野来分析幻灯片。每张幻灯片有十个高倍区域，取平均值。原位卵巢癌模型雌性裸鼠（1012周龄）购自美国美国国家癌症研究所。所有的实验都是由 MD 安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。体内 FAK 靶向 对于 FAK 靶向实验（SKOV3ip1模型），治疗组分为（每组 n=10）：1）空rHDL 纳米粒，2）对照 siRNA rHDL，3）FAK siRNA rHDL，4）对照 siRNA+多烯紫杉醇，5）FAK siRNA rHDL+多烯紫杉醇 体内 STAT3 靶向 STAT3基因沉默实验，根据以下各组（每组 n=10）进行实验：1）对照 siRNA rHDL，2）对照 siRNA rHDL+多烯紫杉醇，3）STAT3 siRNA rHDL，4）STAT3 siRNA rHDL+多烯紫杉醇。适合的肿瘤细胞来源于卵巢癌小鼠模型（HeyA8，SKOV3ip1和 HeyA8 MDR）用腹腔注射接种。小鼠随机饲养并在第7天后开始解决。约 HeyA8模型3周后或 SKOV3ip1和 HEYA8-MDR 5周后，解剖小鼠，收集肿瘤。大肠癌转移模型 对于大肠癌转移模型，HCT116细胞注入雌性裸鼠脾脏（治疗组 N=10）。两个星期后，按照前面描述的开始用奥沙利铂解决，根据图2C 所示。4周后，解剖小鼠，收集肿瘤 体内沉默 STAT3或 FAK 基因的有效剂量通过在 SKOV3ip1模型小鼠注入剂量范围为0.1 0.2mgKgSTAT3 siRNA rHDL 或 FAK siRNA rHDL 来测定。小鼠在第2，4或6天解剖。收集肿瘤组织，采用蛋白质印迹分析蛋白表达 记录分析 假如呈正态分布连续变量可以使用 t 检查(在两个组)或方差分析(所有组)进行比较。在非参数值中,连续变量使用曼-怀氏等级和检查或秩和检查(所有组)进行比较。rHDL 体内研究将治疗组每10只小鼠被随机分派。我们使用 SPSS 和GraphPadPrism 软件对所有结果进行处。我们认为 P 0.05就是显著差异。本研究中所有的数据使用双侧分析。结果 包含 RNAi 的 rHDL 纳米粒的制备 由于 RNAi 分子是高度离子化,重要是由于磷酸基团带负电荷，我们设计 了一个新奇制剂是将 siRNA 偶联到 rHDL 里。反义寡赖氨酸多肽具有大约40赖氨酸残基，这可使 siRNA 偶联到 rHDL。siRNA 偶联后，rHDL 纳米粒的直径约10 nm(图1，A 和 B)和带中性电荷(电位3.2 mV)。rHDL 纳米粒具有强大的有效载荷承载能力（最高至4mg siRNA ml)。此外，具有 siRNA 纳米粒是非常稳定的。由于样品储存两周并再次透析后 siRNA 没有从 rHDL 损失。SR-B1 表达在肿瘤细胞 在研究 rHDL 作为 siRNA 的有效递送系统之前，我们一方面分析了多个细胞系和人类肿瘤存在的 SR-B1受体。在50种人类卵巢上皮癌,96%的肿瘤细胞表达了 SR-B1受体(图1 C)。此外，我们检测在人类正常器官的 SR-B1表达并用RT-PCR 分析乳腺癌、直肠癌、胰腺癌和卵巢癌细胞系的表达(图 W1)。用 RT-PCR也检测了一些细胞系(图1 D)。所有的癌症细胞系测试证实了 SR-B1的高水平表达。在正常的组织里，只有肝脏 SR-B1高度表达，而其他组织很少表达。Figure 1.Characterization of rHDL nanoparticles.(A)Illustrations of rHDL nanoparticle composition.(B)Electron micrograph of rHDLnanoparticles containing control siRNA.(C)Expression of SR-B1 in epithelial ovarian cancer(IHC).(D)mRNA expression of SR-B1 in ovarian and colorectal cancer cell lines.在体内 rHDL 纳米粒的选择性输送 比起正常组织，考虑到 SR-B1受体在肿瘤细胞中的高度表达，我们接下来检测用 rHDL 纳米粒递送 siRNA 在体内的有效性。荧光标记(Alexa555)siRNA 被包入到 rHDL 纳米粒子，并进行 IV 或 IP(图2)。单剂量注射后，siRNA 均匀分布到约80%的特定肿瘤组织。我们进一步验证rHDL纳米粒的递送是否由受体介导。为了解决这个问题,，我们一方面分析了用 Alexa555标记 siRNA rHDL 纳米粒解决的小鼠器官(图 W2)。rHDL 纳米粒在肝脏中的吸取最高，而在大脑、心脏、肺、肾、或脾中吸取很少。静脉注射或腹腔注射 rHDL Alexa555后，肿瘤组织对 rHDL纳米粒的吸取无显著差异。用该方法进行长期治疗实验之前，我们下一个验证 STAT3 siRNA 偶联到rHDL 纳米颗粒(siRNA rHDL)在体内基因沉默的有效性。STAT3 siRNA 的有效性一方面在体外 SKOV3细胞上测试(图 W3A)，与对照组 siRNA 相比，5g 的STAT3 siRNA 导致 STAT3蛋白表达超过80%的减少。接下来，检测在体内沉默STAT3基因的有效剂量。在 SKOV3ip1小鼠模型中我们注射 STAT3 siRNA rHDL，剂量范围从0.1至0.2mgKg。第四天，单剂量注射0.2mgKg 的 siRNA，我们发现减少了88%STAT3蛋白水平(图 W3B)，在第6天，蛋白表达有些回升。根据这个实验，我们在后续实验中使用0.2mgKg 的剂量。另一个关于癌症生长和转移的关键基因，FAK 也具有类似的结果(图 W3C)。在 SKOV3ip1小鼠模型中单剂量注射FAK siRNA rHDL 纳米粒4天后，FAK 水平减少了87%。Figure 2.Systemic delivery of siRNA using rHDL nanoparticles.(A)Uptake of Alexa555-labeled siRNArHDL in SKOV3ip1 tumors.A single IV or IP injection of 0.2 mgkg of Alexa555 labeled or 0.2 mgkg of IV and IP injection of untagged siRNArHDL was administered in mice bearing SKOV3ip1 tumors,and 48 vivo efficacy of STAT3 siRNArHDL in chemosensitive(HeyA8 and SKOV3ip1)and chemoresistant(HeyA8-MDR)mouse models of ovarian carcinoma.*P.05 compared with controls.*P.05 compared with controls as well as docetaxel alone.(C)In vivo efficacy of STAT3 siRNArHDL in colorectal cancer model of liver metastases(HCT116).*P.05 compared with control siRNArHDL,*P.05 compared with STAT3 or oxaliplatin alone.In vivoefficacy of FAK siRNArHDL in the SKOV3ip1 ovarian cancer model.*P.05 compared with controls.*P.05 compared with controls as well as docetaxel alone.Error bars,SEM STAT3 或 FAK 基因沉默对肿瘤的生长和转移的影响 体内成功沉默 FAK 或 STAT3基因后(图 W3B），我们接下来测试了这种是否用多烯紫杉醇化疗药方法的治疗有效性。我们一方面用 STAT3 siRNA rHDL 靶向 STAT3(图2 B)。在三个原位卵巢癌小鼠模型中用单独 STAT3 siRNA rHDL 或偶联多烯紫杉醇进行治疗。在 HeyA8 模型中，单独给 STAT3 siRNA rHDL 或多烯紫杉醇减少了的62%的肿瘤重量(P 0.5年,两者)。与对照组比较，STAT3 siRNA rHDL 和多烯紫杉醇的联合治疗使肿瘤重量减少的最多(92%，P 0.05)。在 SKOV3ip1模型中结果类似(图2 B)。此外，当 STAT3 siRNA rHDL 有无多烯紫杉醇解决小鼠，HeyA8 和 SKOV3ip1卵巢癌模型中证实了肿瘤结数量的剧减。(图 W4A)考虑到 STAT3的耐药性，我们还进行了紫杉醇耐药 HeyA8-MDR 模型实验(图2 B)。正如预期，多烯紫杉醇对肿瘤的生长无显著影响。STAT3 siRNA rHDL 单药疗法使肿瘤生长减少了76%(P0.01)。多烯紫杉醇和 STAT3 siRNA rHDL 联合疗法使肿瘤细胞的增长减低的更多(比起对照组，91%，P 0.001；比起多烯紫杉醇，89%，P 0.1)。肿瘤节数量也有类似的效果（图2）。我们在每一个治疗组的动物的局部转移频率进行了分析。相比于对照组和多烯紫杉醇单药疗法，STAT3 siRNA rHDL 是否偶联多烯紫杉醇都能显著减少上腹部和薄壁肝组织的转移。接下来，我们研究在转移性结直肠癌小鼠模型（HCT116）研究 STAT3沉默基因的治疗效果，该模型使 SR-B1表达（图2C）。肿瘤细胞注射到脾脏后，转移扩散到肝脏。STAT3 siRNA rHDL 单独治疗导致在肿瘤的重量减少79（P 0.01）。对于这些实验，我们常用细胞毒性，奥沙利铂，偶联 STAT3 siRNA rHDL。奥沙利铂减少55 的肿瘤生长（P 0.01）。与对照组相比，奥沙利铂和 STAT3 siRNA rHDL 偶联治疗可使肿瘤重量（96，P 0.01）和肝脏中转移损坏数目（86，P 0.01）显着减少。为了评估 rHDL 纳米粒的安全性，我们评估用 rHDL 纳米粒解决小鼠的几个参数（图 W5）。在两个不同治疗组中，动物体重或肝功能测试（AST 和 ALT 比值）没有显着差异（图 W5，A和 B）。与对照组相比，治疗结果显示没有显着变化后，多个正常器官用苏木精和伊红（H E）染色（图 W5C）为了测试 rHDL 纳米粒对其他靶点的效用潜力,我们进行了 FAK siRNA rHDL 实验。我们在 SKOV3ip1原位卵巢癌模型中用 FAK siRNA rHDL 纳米粒靶向 FAK(图2 C)。FAK 或多烯紫杉醇单药治疗可使肿瘤重量减少62%和74%(两者 P 0.01)。联合治疗显著减少肿瘤重量(96%，P 0.01)，肿瘤节的数量(74%，P 0.05)。空 rHDL 纳米粒和对照 siRNA rHDL 解决的小鼠之间没有显著差异。STAT3 靶向肿瘤微环境的影响 为了了解 STAT3 rHDL 的生物效应，在药物敏感的(SKOV3ip1)和药物耐药(HeyA8-MDR)卵巢癌模型中进行一系列的体内体外实验。在 SKOV3ip1卵巢癌模型中(图3),STAT3基因沉默减少26%细胞增殖(P 0.05)，而多烯紫杉醇克制30%肿瘤细胞增殖(P 0.05)。与对照组比较，STAT3 siRNA rHDL 和多烯紫杉醇联合治疗可克制48%肿瘤细胞增殖(P 0.05)(图3)。在HeyA8-MDR卵巢癌模型中(图W6)，就多烯紫杉醇解决对于细胞增殖就没有效果，STAT3 siRNA rHDL 单药可减少19%细胞增殖。对照组比较，STAT3 siRNA rHDL 和多烯紫杉醇偶联治疗可显著减少细胞增殖(39%，P 0.05）。为了拟定 STAT3沉默对肿瘤相关血管生成的影响,我们从所有四个实验组取新鲜冷冻肿瘤组织的样品进行 CD31染色实验(图3和 W5)和检测 MVD。在 SKOV3ip1模型,STAT3 siRNA rHDL 或多烯紫杉醇单药治疗在 MVD(图3)产生66%至69%的减少(P 0.05)。比起对照组，STAT3 siRNA rHDL 和多烯紫杉醇偶联治疗在 MVD可减少88%(P 0.05)。同样,在 HeyA8-MDR 模型中，就多烯紫杉醇解决对 MVD 的减少没有影响，但多烯紫杉醇和 STAT3 siRNA rHDL 偶联治疗可显著减少(图W6)。众所周知，STAT3被认为是增长细胞存活和克制细胞凋亡。因此，我们在SKOV3ip1卵巢癌模型中用 TUNEL 染色法(图3)，在 HeyA8-MDR 模型活化型半胱天冬酶染色法(图 W6)研究了肿瘤细胞的凋亡效果。在 SKOV3ip1模型，与对照组比较，STAT3基因沉默或多烯紫杉醇治疗可增长8-12倍的细胞凋亡(P 0.05)。与对照组(P 0.05)相比，STAT3 siRNA rHDL 和多烯紫杉醇的联合治疗可增长30倍的肿瘤细胞凋亡。除此之外，在 HeyA8-MDR 模型中，就多烯紫杉醇解决不影响细胞凋亡，对照组 siRNA rHDL 相比，STAT3 siRNA rHDL 或 STAT3 siRNA rHDL 与多烯紫杉醇联合治疗可大幅增长(分别为61%和76%，两者 P 0.05)凋亡细胞(阳性活化型半胱天冬酶-3)(图 W6)Figure 3.Effect of rHDL-incorporated STAT3 siRNA on tumor microenvironment.Tissues (Ki-67),angiogenesis(CD 31),and apoptosis(TUNEL).For the TUNEL stain,five random fields per slide were examined with fluorescence microscopy,and the number of apoptotic bodies and nuclei is reported as average percent apoptotic cells(200).Error bars,SEM.卵巢癌细胞的 STAT3沉默的组织标记 为了辨认潜在组织标记对 STAT3基因沉默的响应,我们在卵巢癌细胞对对照和 STAT3 siRNA 进行基因组分析(图4，A 和 B)。这两组间有460个基因表达差异。生物数据指出，STAT3沉默后凋亡和修复是细胞生存的重要影响，我们重点研究这些途径的基因(表 W1)。从表中知，我们使用 RT-PCR 验证 STAT3基因沉默后最显著改变的12个基因(图4 C)。STAT3基因沉默的限度与两个模型保持一致。STAT3基因沉默大量减少了关键生存基因，这些基因重要用来调节 MAP 激酶和AKT 通路（图4）。这些基因可以作为响应靶向 STAT3疗法的重要组织标记基因。在 HeyA8-MDR 模型中也有类似的结果(数据未显示)。Figure 4.Effect of STAT3 silencing on gene expression profile of ovarian cancer cells.(A)STAT3 silencing modulates gene expression of apoptosis related genes.After STAT3 silencing with siRNA(in vitro),microarray analysis was performed.Heat map(A)represents the over all gene expression changes.Analysis of apoptosis-related(B)genes are shown.(C)Validation of microarray.Apoptosis-related genes that were differentially expressed between control siRNA and STAT3 siRNA treatment groups were validated with quantitative real-time RT-PCR.Average fold change is presented.Error bars,SEM.体外 STAT3 沉默对细胞凋亡的影响 为了拟定 STAT3基因沉默是否直接影响肿瘤细胞的凋亡，在卵巢癌细胞(SKOV3ip1和 HeyA8-MDR)的模型中，我们检测 STAT3 siRNA 是否具有多烯紫杉醇对细胞存活的影响(图5)。STAT3沉默用免疫印迹分析证实(图 W3A)。在SKOV3ip1细胞,STAT3 siRNA 或多烯紫杉醇单药治疗增长凋亡(分别是3 和5.2倍，两者 P 0.05)，而对照组相比，联合治疗增长7.7倍细胞凋亡(P 0.05)。与多烯紫杉醇治疗相比，STAT3 siRNA 可增高41%的细胞凋亡(P 0.05)，这表白在体内凋亡效应的的确受到直接影响(图5A)。此外，在 HeyA8-MDR 细胞多烯紫杉醇治疗没有产生显著凋亡(图5 b)然而,STAT3沉默后增长多烯紫杉醇，比对照组相比可增长175%(P 0.05)的细胞凋亡，与单独多烯紫杉醇治疗可增长98%的细胞凋亡(P 0.05)。Figure 5.Effect of STAT3 silencing on apoptosis.STAT3 was silenced using STAT3-specific siRNA in(A)SKOV3ip1 and(B)HeyA8-MDR cells with and without docetaxel treatment,and apoptosis was assessed using flow cytometry(annexin V).Average percent apoptosis(Annexin VPEpositive SKOV3 cells)and average percent apoptosis compared with control(annexin VPEpositive HeyA8-MDR cells)are reported.Error bars,SEM 讨论 本研究的关键发现就是在体内 rHDL 纳米粒能有效地传递 siRNA 以沉默基因，这些基因对癌症的增长和发育很重要。这个概念建立在多个肿瘤模型中，通过 siRNA 包入 rHDL 纳米粒以介导的高效 STAT3或 FAK 基因沉默。生物效果是通过减少肿瘤细胞增殖，减少减少血管生成，减少细胞生存率来评估。尽管干扰 RNA 是一个高度特定基因沉默的模式,源于在体内全身输送的障碍，目前其治疗应用受到限制。为了克服这些障碍,选择性生物相容性的运载系统是必要的。到目前为止,一些纳米粒系统已经具有潜在的治疗措施，然而,由于缺少组织特异性和体内广泛分布大部分这些系统也许在对正常组织产生毒性。因此,非特异性递送系统也许需要更高的剂量来达成有效性和连续的基因沉默。因此,比起其他方法，靶向性递送系统克服这些障碍更抱负。递送 siRNA 的 rHDL 传输系统具有许多的优点。例如，rHDL 核心成分的细胞摄取通过一个特定的受体(SR-B1)完毕。我们的数据表白，与正常组织相比，SR-B1受体在肿瘤细胞中的表达增长。这些表达差异也许有助于避免副作用。在目前研究中，rHDL 纳米粒的吸取重要局限于肿瘤和肝。这种吸取模式与 SR-B1表达分布完全一致。此外,我们的安全研究表白，对照组 siRNA 相比，STAT3 rHDL 在小鼠肝脏中吸取没有任何不良反映。概念验证，我们证实了多种临床前模型成功靶向两个关于癌症生长和增殖重要的基因。STAT3是一个良好的转录因子，涉及到肿瘤增殖和转移的许多关键过程。干扰 RNA 是一种有效的治疗策略，特别是对其他方法不易给药的靶点。即使 STAT3被广泛认为是一个重要的癌症启动子，传统治疗方法因其靶向性受到的限制。因此，所说的 siRNA 递送系统对于靶向 STAT3和恶性肿瘤增长促进剂是很重要的途径。减少血管生成的生物效应，继发于肿瘤细胞的 STAT3沉默，这点已经得到支持，是通过 STAT3激活剂来调节血管内皮生长因子的表达。在肿瘤细胞中激活 STAT3与血管内皮生长因子表达的增长是相关的。所以，药理干预靶向 STAT3对于这里描述的纳米技术是也许的。此外，其他实体瘤中，FAK 在直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺、前列腺癌上过度表达这一点也曾报道过。在卵巢癌患者中，FAK 的过度表达与肿瘤相关功能在所有存活者中并不明显。用脂质体或小分子克制剂系统性靶向 FAK 显示减少肿瘤生长和转移，但是，这种方法并非肿瘤特异性并且也许产生毒性。FAK siRNA rHDL 治疗方法具有高度肿瘤特异性，可以显著克制肿瘤的生长和转移并且对其他器官无明显副作用。总之，用 rHDL 纳米粒系统性递送 siRNA 为治疗人类恶性肿瘤开拓了新的视野。这个递送方法不仅高效的，并且具有选择性和生物相容性。因此,rHDL 纳米粒癌症管理中具有显著的应用。Figure W1.Expression of SR-B1 mRNA in different organs and tumors using RT-PCR.Actin is used as a loading control.Figure W2.Distribution of systemic delivery of fluorescent-labeled siRNArHDL.Alexa555-labeled control siRNArHDL or untagged siRNArHDL was injected(IV or IP),and 48 tissues were counterstained with Hoechst,and the level of fluorescent-labeled siRNA(red)was assessed with fluorescent microscopy.Average fluorescence uptake is represented by the graphs.*P.05 compared with untagged siRNArHDL.H&E represents the organ morphology Figure W3.STAT3 and FAK silencing with siRNArHDL.(A)STAT3 siRNA treatment(in vitro)in SKOV3ip1 ovarian cancer cells.(B)STAT3 siRNArHDL.(C)FAK siRNArHDL was injected in mice bearing SKOV3ip1 ovarian tumors.Western blot analysis demonstrates relative protein expression.Graphs represent mean expression intensity measured with densitometry Figure W4.In vivo effect of STAT3 siRNArHDL with and without docetaxel therapy on tumor nodules in(A)HeyA8 and SKOV3 and(B)HeyA8-MDR ovarian cancer models.The average number of tumor nodules is presented as a bar graph.Error bars,SEM.Three-dimensional graph depicts the distribution of ovarian tumor metastasis in HeyA8-MDR(Taxol-resistant)ovarian cancer model Figure W5.Safety of rHDL nanoparticles.(A)Body weights.(B)Liver function tests(LFTs)measured at the end of therapy experiment from all treatment groups are reported(for LFTs,AST and ALT ratio is presented).(C)Immunohistochemistry(IHC)performed on organs after a long-term therapy experiment.Representative images of IHC from each treatment group are presented Figure W6.Effect of rHDL-incorporated STAT3 siRNA on tumor microenvironment.Tissues cancer mouse model were subjected to immunohistochemistry for markers of proliferation(Ki-67),angiogenesis(CD 31),and apoptosis(cleaved caspase-3).For the analysis,five random fields per slide were examined with light microscopy and number of average number of microvessels(MVD)or the number of cells positive(Ki-67 and cleaved caspase-3)and nuclei are reported as average percent positive cells(200).Error bars,SEM.以下免费送您一百个优秀毕业论文题目，供参考。1.公司集团激励与绩效评价问题研究 2.XXX 地区中小公司财务管理现状问题研究 3.XXX 地区上市公司赚钱质量实证研究 4.XXX 地区公司集团整合过程中的财务问题研究 5.XXX 地区中小公司的信用担保体系问题研究 6.XXX 地区上市公司财务预警问题研究 7.公司并购前后财务状况变化问题研究 8.以平衡计分卡为核心的绩效评价体系研究 9.EVA 在公司绩效评价中的作用研究 10.关于我区中小公司引入风险投资问题研究 11.我国上市公司经营目的的实证分析 12.对内含报酬率法的再思考 13.运用平衡计分卡贯彻战略的案例分析 14.基于 EVA 的公司业绩评价指标体系的构建与实行研究 15.基于不同发展周期的公司财务战略选择研究 16.集团公司全面预算目的的制定与分解 17.钞票流量折现法在评估公司战略中的应用分析 18.财务指标与非财务指标在评估管理者业绩中的应用拟合 19.我国公司财务管理目的的现实选择 20.财务管理目的与公司财务核心能力问题研究 21.公司财务管理中运用税收筹划的探讨 22.建立以财务管理为核心的资源配置制度 23.财务预警系统在财务管理中应用评价 24.基于 Excel 的财务预警模型研究 25.中西部地区中小公司财务战略选择问题研究 2