BMP2-PLGA_Doxy-PLGA纳米微球联合CS_β-GP复合温敏水凝胶的制备及性质检测.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.288牙周炎会导致牙槽骨吸收、牙齿松动直至脱落1。如何促进炎症环境下牙槽骨再生 2，是牙周炎治疗的难点。目前用材料携带生长因子是再生研究的主要方向之一，但如何延长生长因子的作用，是其在临床起作用的关键。因此缓释系统被引入再生研究，生长因子与载体结合后能在合适位置长期释放并保持活性3。骨再生研究中骨形成蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）诱导骨形成能力强，被广泛应用4。因为炎症的存在，促成骨的同时可考虑应用抗炎药物，四环素族抗炎功能强，骨定向性好，可以减轻牙周组织破坏5，其中多西环BMP2-PLGA/Doxy-PLGA纳米微球联合CS/-GP复合温敏水凝胶的制备及性质检测邓易君 杨森 赵芳玮 胡颖 董蕊【摘要】目的 制备 BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 纳米微球混合 CS/-GP 复合温敏水凝胶，并检测其性质。方法 复乳法分别制备 BMP2-PLGA、Doxy-PLGA 纳米微球，通过扫描电镜、粒度仪、重量变化测定其表征、粒径、降解率。交联法制备 CS/-GP 温敏水凝胶，通过倒置法、重量变化测定凝胶时间及降解率。所获的纳米微球与水凝胶混合获得复合水凝胶，分 8 组：BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例各为 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA 水凝胶、PLGA 水凝胶。Elisa 和紫外分光法测定释药曲线。各组分别与MC3T3 细胞共培养后 CCK8 法检测细胞毒性。TNF-营造炎性环境，正常营养环境与炎性环境下与 MC3T3 细胞共培养后，qRT-PCR 检测成骨基因 ALP 和 OCN 的表达。结果 空白 PLGA、BMP2-PLGA、Doxy-PLGA 均无细胞毒性，平均粒径无统计学差异。BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 复合水凝胶 37 下 4 min 内形成凝胶，体外缓释BMP2 达 49 天、Doxy 达 56 天，无细胞毒性。炎性及非炎性环境下与 MC3T3 细胞共培养 1 天后，BMP2-PLGA 与Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶组细胞 ALP、OCN 表达水平相比对照组明显增加，其余各组间无统计学差异，共培养 3、7 天后，各组表达水平相比对照组都明显增加，其中 BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶组的表达水平最高，具有统计学差异。结论 BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 混合 CS/-GP 水凝胶可以获得无细胞毒性缓释效果好的复合温敏水凝胶，该材料可以显著促进炎性环境下细胞的体外成骨分化。【关键词】BMP2；多西环素；缓释；成骨分化【中图号】R783.1【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.02.003Preparation and property of CS/-GP composite thermosensitive hydrogel mixed with BMP2-PLGA/doxycycline-PLGA nano-microsphere DENG Yi-jun,YANG Sen,ZHAO Fang-wei,HU Ying,DONG Rui.Beijing Institute of Dental Research,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To prepare CS/-GP composite thermosensitive hydrogel mixed with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA nano-microsphere and test their properties.Methods BMP2-PLGA and Doxy-PLGA nano-microsphere were prepared by double emulsification technology.The surface morphology,particle size of nano-microsphere were determined by SEM and particle size analyzer.CS/-GP thermosensitive hydrogel was prepared by physical cross-linking method.Then nano-microsphere and CS/-GP thermosensitive hydrogel were mixed to obtain composite hydrogel.Then release curve of hydrogel was measured by Elisa and UV spectrophotometry.After co-cultured with MC3T3 cells in vitro,the cytotoxicity was detected by CCK8.After co-cultured with MC3T3 cells in non-inflammatory environment and inflammatory environment,the expression of osteogenesis genes ALP and OCN was examined by qRT-PCR.Results The blank PLGA,BMP2-PLGA,Doxy-PLGA had no cytotoxicity.CS/-GP thermosensitive hydrogel mixed with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA formed gel within 4 min at 37.After MC3T3 cells were co-cultured with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA composite hydrogel for 1 day in non-inflammatory and inflammatory environments,ALP and OCN expression in 1:1 mixed group cells increased compared with the control group.Conclusions BMP2-PLGA/Doxy-PLGA hybrid CS/-GP hydrogel can obtain a compound thermosensitive hydrogel with cytotoxic free and slow release effect.The composite hydrogel with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA ratio of 1:1 can significantly promote the osteoblastic differentiation of cells in inflammatory environment in vitro.【Key words】BMP2；Doxycycline；Sustained release；Osteogenic differentiation 基金项目：2019 年北京市东城区优秀人才作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所（邓易君、杨森、赵芳玮、胡颖），教育处（董蕊）通信作者：董蕊，E-mail：，电话：[phone]北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.289素（Doxycycline，Doxy）抗炎功能强于四环素，对成骨细胞无毒6。因此将 BMP2 及 Doxy 联合应用使其缓慢释放则需要合适的缓释系统。目前聚乳酸-乙醇酸共聚物 poly（D,L-lactide-co-glycolide），PLGA 是常用的缓释材料7,但研究发现 PLGA 微球在前 48 h 释放超过 19的药物后再进入缓释阶段8，造成浪费，即突释效应，壳聚糖（chitosan，CS）/-甘油磷酸钠（-glycerophosphate，-GP）温敏水凝胶免疫原性低，可在 37下迅速形成凝胶，便于操作9。如将 CS/-GP 水凝胶复合PLGA 微球后可以减少突释，便于给药10。因此，本研究先构建 Doxy-PLGA、BMP2-PLGA纳米微球，再将其与 CS/-GP 水凝胶联合应用制备复合温敏水凝胶，对其性质及体外促成骨分化作用进行检测，为进一步体内实验提供依据。材料和方法1.主要仪器与试剂Doxy（Bioruler，美国）；PLGA（Sigma，美国）；CS（展云，中国）；-GP（Innochem，中国）；BMP2，BMP2Elisa 试剂盒，CCK8 试剂盒（Abcolonal，中国）；RNA 提取试剂盒，逆转录试剂盒（CWbio，中国）。紫外测量仪（Thermo，美国）；超声破碎仪（之信，中国）；扫描电镜（Hitachi，日本）；粒度分析仪（NanoBrook，美国）；荧光定量 PCR 仪（BioRad，美国）；酶标仪（Spectramax，美国）。2.纳米微球制备及检测纳米微球制备：BMP2-PLGA：1 g BMP2 溶于50 l DPBS，加入 0.5 ml 100 mg/ml PLGA 的 CH2Cl2溶液中，冰浴下超声破碎仪 60 W 脉冲超声 30 次获得初乳液，将其加入 5 ml 2聚乙烯醇水溶液，冰浴下 80 W 脉冲超声 60 次获得复乳液后置于通风橱内 800 r/min 磁力搅拌 8 h。收集混悬液 10000 r/min 离心 15 min，ddH2O 洗 2 次，混匀，60 W 超声 45 次分散。所得悬浮液-80过夜后冻干，即获得 BMP2-PLGA 纳米微球。Doxy-PLGA：5 mg Doxy 溶于 50 l DPBS，其余步骤同 BMP2-PLGA 制备。包封率测定：ELISA 和紫外分光法测定离心后上清中未包封 BMP2、Doxy 的含量，计算包封率。性质检测:分 3 组：PLGA、BMP2-PLGA、Doxy-PLGA，每组 3 个样本。分别稀释为 1 mg/ml 混悬液滴到硅片上室温晾干后喷金，扫描电子显微镜观察表面形貌；粒径分析仪分别测定粒径；将 1 ml 20 mg/ml 的 3 组微球 PBS 溶液 37恒温孵育，每周冻干称重，检测 8 w，计算未降解比例。3.CS/-GP 水凝胶、复合水凝胶的制备及检测水凝胶制备:CS 高压蒸汽灭菌，0.1 mol/L 乙酸配置 0.022 g/ml CS 溶液。配置 0.56 g/ml-GP 水溶液，过滤除菌；-GP 溶液以 1:3 体积比加入CS 溶液,冰浴搅拌 15 min，调 pH 到 7.4。性质检测:分 10 组：Doxy 水凝胶（5 mg/ml）、BMP2 水凝胶（1g/ml）、8 组微球水凝胶（20 mg/ml）：PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例各为 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶，每组 3个样本。各取 0.5 ml 加入 Ep 管中 37水浴，观察管内溶液是否流动，至不流动记为凝胶形成时间。各组取 0.5 ml 37下形成凝胶后加入 1 ml PBS，37孵育，每周全部冻干称重后，重新加入 1 ml PBS 37孵育，检测 8 w，计算未降解比例。4.纳米微球及复合水凝胶的体外释药曲线纳米微球分组:分 3 组：PLGA、Doxy-PLGA、BMP2-PLGA，每组 3 个样本。各组配置 1 ml 20 mg/ml的微球 PBS 溶液。复合水凝胶分组:分 9 组：Doxy 水凝胶、BMP2水凝胶、Doxy-PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例各为 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶，每组 3 个样本。各组取 1 ml 37下形成凝胶后加入 1 ml PBS。释药量检测:各组 37孵育，分别于 1、2、3、4、6、8、10、12、14 d 吸取各组各 50 l 上清液检测0 d 到该时间点释放的 BMP2、Doxy 浓度，之后每周检测，共 8 w。原样本吸取待测液后再加入 50 l PBS 使总体积不变。5.细胞毒性检测纳米微球分组:分 3 组：PLGA、Doxy-PLGA、BMP2-PLGA，每组 3 个样本。各取 100 l 20 mg/ml微球培养基溶液过滤除菌后分别加入 96 孔板中。复合水凝胶分组:分 6 组：空白水凝胶、Doxy水凝胶、BMP2 水凝胶、PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶，每组 3 个样本。各组分别取 100 l 加入 96 孔板中，37下形成凝胶。细胞毒性检测:向各组中每孔各加入 100 l 北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.290-MEM 培 养 基 以 及 104个 MC3T3 细 胞（ATTC，美国），共培养 24、48 h 后加入 20 l CCK8 溶液混匀，孵育 4 h 后于 450 nm 波长处检测 OD 值，计算细胞相对存活率。6.qRT-PCR 检测细胞 ALP 和 OCN 的体外表达正常培养环境:分 8 组：BMP2-PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA 水 凝 胶、BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA比例各为 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶及 PLGA 水凝胶对照，每组 3 个样本。各组分别取100 l 加入 24 孔板中，37下凝胶后每孔加入 105个MC3T3 细胞及 100 l-MEM 培养基，共培养 1、3、7 d，RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA。逆转录试剂盒将 mRNA 逆转录成 cDNA，以 GAPDH 作为标准化内参对照，利用 2-CT法得到各组 ALP、OCN 相对表达量。相关引物序列见表 1。炎性环境:根据文献12，在培养基中添加10 ng/ml的 TNF-营造炎性环境，分 4 组：PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶，每组 3 个样本。各组分别与 MC3T3 细胞共培养 1、3、7 d，其余步骤同非炎性环境。7.统计学分析应用 SPSS26.0 软件，通过独立样本 t 检验及单因素方差分析（ANOVA）对各组结果进行统计分析，P 0.05）（图 1）。8 w 时 PLGA、Doxy-PLGA、BMP2-PLGA 分别剩余（20.821.29）、（18.461.46）、（18.970.59）未降解，组间无统计学差异（P 0.05）。2.CS/-GP 水凝胶及复合水凝胶性状各组水凝胶室温下均为液态，37下 Doxy水凝胶形成凝胶时间为（41616）s，高于其他组（P 0.05）。8 w 时空白水凝胶、Doxy 水凝胶、BMP2 水凝胶分别剩余（16.331.06）、（14.840.25）、（13.260.94）未降解，水凝胶降解率与 PLGA 纳米微球较为匹配，8 w时BMP2-PLGA/Doxy-PLGA比例各为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶分别剩余（15.731.41）、（15.252.79）、（15.331.2）、（14.682.12）、（14.931.87），组间无统计学差异（P 0.05）。3.纳米微球及复合水凝胶的释药曲线BMP2 释放曲线中，BMP2 水凝胶 2 w 释放总量最大，而后迅速下降；BMP2-PLGA 2 d 内突释，2 d 后释放总量低于 BMP2 水凝胶，在 5 w 时释放总量最大，而后迅速下降；BMP2-PLGA 水凝胶释放曲线平缓，7 w 时释放总量最大，而后缓慢下降。复合水凝胶中，当 BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 比例为 1:1、2:1、3:1 时，BMP2 释放总量高，1:2、1:3两组 BMP2 释放总量低（图 2A、B）。Doxy 释放曲线中，Doxy 水凝胶 3 w 时释放总量最大，而后下降；Doxy-PLGA2 d 内突释，2 d 后释药总量低于 Doxy 水凝胶组，5 w 时释放总量最大，而后下降；Doxy-PLGA 水凝胶组释药曲线平缓，在 8 w 时依旧释药。复合水凝胶中，BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 比例为 1:2、1:3 时，Doxy 释放总量高，1:1 组 Doxy 释放总量低于 1:2、1:3 组，2:1、3:1 组Doxy 释放总量最低（图 2C、D）。4.复合水凝胶对细胞的作用各组分别与 MC3T3 细胞共培养 24、48 h 后，表 1 引物序列基因上游引物下游引物GADPHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGGGGTCGTTGATGGCAACAOCNAGACTCCGGCGCTACCTTGGCGGTCTTCAAGCCATACTGGTCTGALPCACGGCGTCCATGAGCAGAACCAGGCACAGTGGTCAAGGTTGG图 1 纳米微球表征 扫描电镜结果显示 A：PLGA；B：Doxy-PLGA；C：BMP2-PLGA 均呈球状，粒径分析结果显示；D：纳米微球粒径分布均一ABCD北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.291各组细胞与对照组间相对存活率无统计学差异，各组材料均无细胞毒性（P 0.05）。正常培养环境下与 MC3T3 细胞共培养 1 d 后，BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶组细胞 ALP、OCN 表达水平最高（P 0.01），其余组与对照组无统计学差异；3、7 d 后，各组表达水平均高于对照组，1:1 组表达水平最高，2:1、3:1 两组表达水平低于 1:1 组，高于其他组，Doxy-PLGA 水凝胶组表达水平最 低（P 0.05）（图 3A、B）。炎性环境下共培养 1 d 后，1:1组细胞 ALP、OCN 表达水平最高（P 0.01），其余组及对照组间无统计学差异；3、7 d 后，各组表达水平均高于对照组，1:1 组表达水平最高，BMP-PLGA 水凝胶组表达水平最低，Doxy-PLGA 水凝胶组表达水平高于 BMP-PLGA 水凝胶组（P 0.01）。炎性环境下各时间点各组的表达水平相比非炎性环境下空白对照组均降低，1:1 组的降低程度最小，Doxy-PLGA 水凝胶组降低程度低于 BMP-PLGA水凝胶组（P 0.05）（图 3C、D）。讨 论临床上期望在控制炎症的同时实现骨再生，以修复牙周组织。BMP2 在骨再生中起重要作用，而 Doxy 有着良好的抗炎效果和骨定向性4,5，因此本实验制备了 BMP2-PLGA、Doxy-PLGA 纳米微球来缓释 BMP2、Doxy，二者联合应用可能有助于牙周炎下的骨再生。但本实验发现所获纳米微球存在突释效应，已有研究表明水凝胶复合微球可以避免该现象，同时便于给药，延长缓释时间12。其中 CS/-GP 在 37 下迅速形成凝胶、免疫原性低8，且凝胶复合生长因子微球比直接复合生长因子更能促进成骨分化13。本研究制备了降解率与 PLGA 纳米微球相匹配的 CS/-GP 水图 2 PLGA、水凝胶及复合水凝胶的 BMP2、Doxy 释药曲线 A、B：BMP2 释药曲线；C、D：Doxy 释药曲线ABCD注：*：P 0.05；*：P 0.01图 3 共培养后细胞 ALP、OCN 表达水平 A、B：非炎性环境下 ALP、OCN 表达水平；C、D：炎性环境下 ALP、OCN 表达水平ABCD北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.292凝胶，将 BMP2-PLGA 及 Doxy-PLGA 与 CS/-GP联合应用获得复合水凝胶，结果表明各组复合水凝胶 37 下均在 4 min 内形成凝胶状态。但 Doxy 水凝胶形成凝胶时间达 6 min，可能是酸性的 Doxy 影响了 CS 与-GP 之间的中和，造成了时间延长8。而 Doxy-PLGA 复合水凝胶组仍在 4 min 内形成凝胶，说明复合水凝胶很好地控制了药物释放速度。进一步检测各组释药曲线结果表明复合水凝胶比单独应用能更持久地缓释药物，且无突释现象。说明本实验获得的复合水凝胶是一种优良的缓释系统。研究表明炎症环境下抗炎与促成骨联合应用后细胞成骨分化效果要优于单独应用14，本实验制备能同时释放 BMP2、Doxy 的复合水凝胶，释药曲线表明 BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例为 2:1、3:1组 BMP2 释放量高,Doxy 释放量低。1:1 组 BMP2 释放量与 2:1、3:1 组相同，Doxy 释放量低于 1:2、1:3组，高于 2:1、3:1 组。1:2、1:3 组 BMP2 释放量低，Doxy 释放量高。已有研究发现 Doxy 不影响 BMP2的生成及作用6，因此各组 BMP2 释放量不同的可能原因是 1:1、1:2、1:3 组 BMP2 含量达到水凝胶释药极限15。而各组 Doxy 的释放量差异与 Doxy 含量有关。本实验所获 BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA比例为 1:1 的复合水凝胶能同时缓释 BMP2 及 Doxy并维持较高的浓度，因此选择该组进行下一步研究。以往研究证明 PLGA 及 CS/-GP 均无细胞毒性7,8,本实验细胞共培养结果表明各组材料无细胞毒性，与以往研究结果一致。继而利用成骨相关指标探究各组材料对细胞成骨的影响。成骨分化相关指标中，ALP 及 OCN 是反映骨形成的特异性生化指标，ALP、OCN 表达水平升高反映细胞成骨分化趋势增强16。本实验结果表明 BMP2-PLGA 与Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶组细胞在炎性及正常环境下 ALP、OCN 表达水平都较高，可能是该组 BMP2 释放量在各组中最高，Doxy 释放量也较高，BMP2、Doxy 联合应用更好地促进了细胞体外成骨分化17。由此可见,该组在炎性及正常环境下能很好地促细胞成骨分化且无细胞毒性。本实验结果可初步证实 BMP2-PLGA 及 Doxy-PLGA 纳米微球复合 CS/-GP 温敏水凝胶能促进炎性和正常环境下 MC3T3 细胞体外成骨分化，BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶体外促成骨分化效果好，为深入探究复合水凝胶促进牙周炎下成骨的体内实验提供实验依据。参 考 文 献 1 马赫,陈瑶,刘桂红.牙周炎患者外周血Th1、Th2、Th17表达及与牙龈组织IL-17、IFN-水平的相关性研究.北京口腔医学,2021,29(4):213-217.2 Bench TJ,Jeremias A,Brown DL.Matrix metalloproteinase inhibition with tetracyclines for the treatment of coronary artery 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