三原核生物的质粒市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

三、原核生物质粒三、原核生物质粒定义：定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋是一类小型闭合环状核外双螺旋DNADNA分子，能独立于细胞核分子，能独立于细胞核进行自主复制。进行自主复制。大小：大小：约为约为2100102100106 6DaltonDalton，上面携带有数个到数十个甚至上百，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。个基因。性质：性质：能够在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也能够能够在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也能够经过交换掺入染色体上，以经过交换掺入染色体上，以附加体（附加体（episomeepisome）形式存在；形式存在；质粒是一个质粒是一个复制子（复制子（repliconreplicon），依据自我复制能力不一样，可，依据自我复制能力不一样，可把质粒复制控制形式分为严紧型和松弛型两种，把质粒复制控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒严紧型质粒复制受复制受细胞核控制，与染色体细胞核控制，与染色体DNADNA复制相伴随复制相伴随,普通一个寄主细胞内只有少普通一个寄主细胞内只有少数几个（数几个（1515）个拷贝；）个拷贝；松弛型质粒松弛型质粒复制不受细胞核控制，在染色复制不受细胞核控制，在染色体体DNADNA复制停顿情况下仍能够进行复制，在细胞内数量能够到达复制停顿情况下仍能够进行复制，在细胞内数量能够到达1020010200个或更多。个或更多。第1页能够经过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到能够经过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒细胞；质粒转另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒细胞；质粒转移时，它能够单独转移，也能够携带着染色体（片段）一起移时，它能够单独转移，也能够携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程载体。进行转移，所以它可成为基因工程载体。对于细菌生存并不是必要对于细菌生存并不是必要功效多样化功效多样化三、原核生物质粒三、原核生物质粒第2页功效：功效：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功效等。毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功效等。重组：重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围存在范围：很多细菌如：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等、根癌土壤杆菌等制备：制备：包含增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和包含增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成份、去除蛋白质等成份、去除RNA和蛋白质等步骤。和蛋白质等步骤。判定：判定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法切图谱等方法三、原核生物质粒三、原核生物质粒第3页几个代表性质粒：几个代表性质粒：1.F因子（因子（fertility factor）：又称致育：又称致育因子或性因子，因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体相当于核染色体DNA2%环状双链环状双链DNA，足以编码，足以编码94个中等大小多肽，其中个中等大小多肽，其中1/3基因（基因（tra区）与接合作用相关。存在于区）与接合作用相关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。第4页Figure.Representative FERTILITY PLASMID.A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes.In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.第5页最初发觉于痢疾志贺氏菌（最初发觉于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），以后），以后发觉还存在于发觉还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和和Staphylococcus中。中。R因子由相连两个因子由相连两个DNA片段组成，即抗性转移因子片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和抗性决定）和抗性决定R因因子（子（r-determinant），），RTF为分子量约为为分子量约为11106Dalton，控制质粒，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素抗以上。其上带有其它抗生素抗性基因。性基因。R-因子在细胞内因子在细胞内copy数可从数可从12个到几十个，分为严紧个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达3000个个/细胞。细胞。2.R因子（因子（resistence factor）第6页产大肠杆菌素因子。产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由大肠杆菌素是由E.coli一些菌株所分泌细菌素，能经过抑一些菌株所分泌细菌素，能经过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素都。大肠杆菌素都是由是由Col因子编码。因子编码。Col因子可分为两类，分别以因子可分为两类，分别以ColE1和和ColIb为代表。为代表。ColE1分子量约为分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多，无接合作用，是多copy；ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 研究和用于体外复制系统上。研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为分子量约为80106Dalton，它与它与F因子相同，因子相同，含有经含有经过接合作用转移功效，属于严紧型控制，只有过接合作用转移功效，属于严紧型控制，只有12个个copy。凡带凡带Col因子菌株，因为质粒本身编码一个免疫蛋白，从因子菌株，因为质粒本身编码一个免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。3.Col因子（因子（colicinogenic factor）第7页v降解性质粒降解性质粒只在假单胞菌属中发觉。它们降解性质粒只在假单胞菌属中发觉。它们降解性质粒可为一系列能降解复杂物质酶编码，从而能可为一系列能降解复杂物质酶编码，从而能利用普通细菌所难以分解物质做碳源。这些利用普通细菌所难以分解物质做碳源。这些质粒以其所分解底物命名，比如有分解质粒以其所分解底物命名，比如有分解CAMCAM（樟脑）质粒，（樟脑）质粒，XYLXYL（二甲苯）质粒，（二甲苯）质粒，SALSAL（水杨酸）质粒，（水杨酸）质粒，MDLMDL（扁桃酸）质粒，（扁桃酸）质粒，NAPNAP（奈）质粒和（奈）质粒和TOLTOL（甲苯）质粒等。（甲苯）质粒等。4.降解性质粒降解性质粒第8页即诱癌质粒。即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中）中,可引发许多双子叶植物根癌可引发许多双子叶植物根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因释放到植物细胞中。这时，含有复制基因Ti质粒小质粒小片段与植物细胞中核染色体发生整合，破坏控制细胞分片段与植物细胞中核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂激素调整系统，从而使它转变成癌细胞。裂激素调整系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为质粒已成为植物遗传工程研究中主要载体。一些含有主要性状外源植物遗传工程研究中主要载体。一些含有主要性状外源基因可借基因可借DNA重组技术设法插入到重组技术设法插入到Ti质粒中，并深入使质粒中，并深入使之整合到植物染色体上，以改变该植物遗传性，到达培之整合到植物染色体上，以改变该植物遗传性，到达培育植物优良品种目标。育植物优良品种目标。5.Ti质质 粒粒（tumor inducing plasmid）第9页是近年来在是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发觉一（根瘤菌属）中发觉一个质粒，分子量为个质粒，分子量为200300106Dalton，比普通，比普通质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。有一系列固氮基因。6.6.巨大质粒（巨大质粒（mega质粒）质粒）第10页基基因因：能能够够表表示示和和产产生生基基因因产产物物（蛋蛋白白质质或或RNA）DNA序列。序列。原核生物基因系统：原核生物基因系统：开启子（基因）开启子（基因）操纵子操纵子 操纵子（基因）操纵子（基因）基因调控系统基因调控系统 结构基因结构基因 调整基因调整基因第11页细细胞胞水水平平：大大部部分分或或全全部部DNA都都集集中中于于细细胞胞核核或或核核质质体体中中，不不一一样样种种类类微微生生物物或或同同种种不不一一样样细细胞胞中中细细胞胞核核数数目目不不一一样样染色体水平：真核微生物每个细胞核内含有一定数量染色染色体水平：真核微生物每个细胞核内含有一定数量染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露、光学显微体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露、光学显微镜下不能看到环状染色体。镜下不能看到环状染色体。第12页一些真核生物和原核生物基因组比较一些真核生物和原核生物基因组比较生生 物物 单倍体分子量单倍体分子量 核苷酸核苷酸 已知染色体数已知染色体数 约数（约数（DaDa）对对数数 基因数基因数 人人 32 32 35 10 35 101212 57 10 57 109 9 4000 4000 黑腹果蝇黑腹果蝇 4 4 7.9 10 7.9 101010 8.0 10 8.0 107 7 50006000 50006000粗糙脉孢菌粗糙脉孢菌7 7 2.8 10 2.8 101010 4.5 10 4.5 107 7 500 500 大肠杆菌大肠杆菌1 1 2.5 10 2.5 109 9 3.8 10 3.8 106 6 1027 1027 噬菌体噬菌体T4T41 1 1.1 10 1.1 108 8 2.0 10 2.0 105 5 135 135 噬菌体噬菌体 1 1 3.2 3.2 10107 7 4.8 4.8 10104 4 35 35噬菌体噬菌体MS2MS21 1 1.1 10 1.1 106 6 3.5 10 3.5 103 3 3 3第13页遗传密码遗传密码：指：指DNA链上各个核苷酸特定排列次序链上各个核苷酸特定排列次序密码子（密码子（codencoden）：由：由3 3个核苷酸次序决定，负个核苷酸次序决定，负载遗传信息基本单位载遗传信息基本单位不对称转录不对称转录：只有：只有DNADNA双链一股才作为有意义双链一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子起始密码子：AUGAUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子终止密码子：UAAUAA、UGAUGA、UAGUAG第14页核外核外DNA种类种类核外染色核外染色体体真真核核生生物物“质粒质粒”原原核核生生物物质粒质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体（质体）（质体）中心体中心体动动 体体共生生物：共生生物：卡巴颗粒卡巴颗粒酵母菌酵母菌2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒第15页第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 突变（突变（突变（突变（mutationmutation ）：）：）：）：指生物体表型突然发生可遗传改变。指生物体表型突然发生可遗传改变。染色体畸变染色体畸变细胞学上能够看到染色体改变细胞学上能够看到染色体改变突变突变 基因突变基因突变细胞学上看不到遗传物质改变细胞学上看不到遗传物质改变突变体（突变体（mutant）：发生了突变微生物细胞或菌株：发生了突变微生物细胞或菌株野生型（野生型（wild type）：）：从自然界分离到任何微生物在其发生从自然界分离到任何微生物在其发生突变前原始菌株突变前原始菌株第16页依表型改变分为：依表型改变分为：形态突变型形态突变型营养缺点型营养缺点型因突变而丧失产生某种生物合成酶能力，因突变而丧失产生某种生物合成酶能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长突变类并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长突变类型。型。发酵突变型发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力突变型丧失产生某种生物合成酶能力突变型抗性突变型抗性突变型因突变而产生了对某种化学药品或致死物因突变而产生了对某种化学药品或致死物理因子抗性理因子抗性条件致死突变型条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖突变型而在另一条件下却无法生长繁殖突变型抗原突变型抗原突变型因突变而引发抗原结构发生改变因突变而引发抗原结构发生改变产量突变型产量突变型 （一）基因突变类型（一）基因突变类型第17页按是否比较轻易、快速地分离到发生突变细胞来分：按是否比较轻易、快速地分离到发生突变细胞来分：选择性突变株（选择性突变株（selective mutant）：）：含有选择标识（如营养含有选择标识（如营养缺点性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当环缺点性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当环境条件，如培养基、温度、境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较轻易检出和分离值等，就比较轻易检出和分离到。到。非选择性突变株（非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标识（如：无选择标识（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能判别这种突变产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能判别这种突变体惟一方法是检验大量菌落并找出差异。体惟一方法是检验大量菌落并找出差异。第18页第19页定义：定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变几率。每一细胞在每一世代中发生某一性状突变几率。突变率为突变率为101088是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也能够用每一单位群体在每一世代中产生次突变。突变率也能够用每一单位群体在每一世代中产生突变株（突变株（mutantmutant，即突变型）数目来表示。如一个含，即突变型）数目来表示。如一个含10108 8个细胞群体，当其分裂为个细胞群体，当其分裂为2102108 8个细胞时，即可平均发生个细胞时，即可平均发生一次突变突变率也是一次突变突变率也是101088 。突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数突变是突变是独立独立独立独立。某一基因发生突变。某一基因发生突变不会影响不会影响不会影响不会影响其它基因其它基因其它基因其它基因突变率。突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变几率是极低，因为在同一个细胞中同时发生两个基因突变几率是极低，因为双重突变型几率只是各个突变几率乘积。双重突变型几率只是各个突变几率乘积。因为突变几率普通都极低，所以，必须采取检出选择性突因为突变几率普通都极低，所以，必须采取检出选择性突变株伎俩，尤其是采取检出营养缺点型恢复突变株（变株伎俩，尤其是采取检出营养缺点型恢复突变株（back back mutantmutant或或reverse mutantreverse mutant）或抗性突变株尤其是抗药性突）或抗性突变株尤其是抗药性突变株方法来加以确定。变株方法来加以确定。（二）突变率（二）突变率第20页若干细菌某一性状自发突变率若干细菌某一性状自发突变率菌菌 名名 突变性状突变性状突变率突变率E.coliE.coli抗抗T1T1噬菌体噬菌体3 103 1088E.coliE.coli抗抗T3T3噬菌体噬菌体1 101 1077 E.coliE.coli不发酵乳糖不发酵乳糖1 101 101010E.coliE.coli 抗紫外线抗紫外线1 101 1055Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus 抗青霉素抗青霉素1 101 1077S.aureusS.aureus 抗链霉素抗链霉素1 101 1099 Salmonella typhiSalmonella typhi抗抗2525 g/Lg/L链霉素链霉素1 101 106 6 Bacillus megateriumBacillus megaterium 抗异烟肼抗异烟肼5 105 1055 第21页（三）突变特点（三）突变特点适合用于整个生物界，以细菌抗药性为例。适合用于整个生物界，以细菌抗药性为例。不对应性不对应性：突变性状与突变原因之间无直接对应关系。：突变性状与突变原因之间无直接对应关系。自自发发性性：突突变变能能够够在在没没有有些些人人为为诱诱变变原原因因处处理理下下自自发发地地产产生。生。稀有性稀有性：突变率低且稳定。：突变率低且稳定。独立性独立性：各种突变独立发生，不会相互影响。：各种突变独立发生，不会相互影响。可诱发性可诱发性：诱变剂可提升突变率。：诱变剂可提升突变率。稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。可逆性可逆性：从原始野生型基因到变异株突变称为正向突：从原始野生型基因到变异株突变称为正向突变变（forward mutation），从突变株回到野生型），从突变株回到野生型过程则称为过程则称为回复突变或回变（回复突变或回变（back mutation或或reverse mutation）。）。第22页（四）基因突变自发性和不对应性证实（四）基因突变自发性和不对应性证实在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生原因争论十分激烈。时间内对这种抗性产生原因争论十分激烈。一个观点认为，突变是经过适应而发生，即各种抗性是由其环境一个观点认为，突变是经过适应而发生，即各种抗性是由其环境（指其中所含抵抗对象）诱发出来，突变原因和突变性状间是相对（指其中所含抵抗对象）诱发出来，突变原因和突变性状间是相对应，并认为这就是应，并认为这就是“定向变异定向变异”，也有些人称它为，也有些人称它为“驯化驯化”或或“驯驯养养”。另一个看法则认为，基因突变是自发，且与环境是不相正确。因为另一个看法则认为，基因突变是自发，且与环境是不相正确。因为其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等各种原因错综在其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等各种原因错综在一起，所以难以探究问题实质。一起，所以难以探究问题实质。从从19431943年起，经过几个严密而巧妙试验设计，主要攻克了检出在接年起，经过几个严密而巧妙试验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生自发突变株难题，终于处理了这场纷争。触抗性因子前已产生自发突变株难题，终于处理了这场纷争。第23页变量试验变量试验又称波动又称波动试验或彷试验或彷徨试验。徨试验。19431943年，年，S.E.S.E.Luria Luria 和和M.M.Delbrck Delbrck 依据统计依据统计学原理，学原理，设计了左设计了左方试验。方试验。1.变量试验变量试验fluctuation test第24页2.涂布试验原理与变量试验相同，方法更为简便，原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。且可计算突变率。第25页涂布试验中突变率计算涂布试验中突变率计算初始接种量：初始接种量：5 105 104 4 个个/皿皿培养培养5 5小时，繁殖了小时，繁殖了12.312.3代，每个微菌落约含代，每个微菌落约含51005100个细菌个细菌这时，每个平皿上细胞数为：这时，每个平皿上细胞数为：5100 5 105100 5 104 4 2.6 10 2.6 108 8个个/皿皿在在6 6个平板上，比接种时增加细胞数为：个平板上，比接种时增加细胞数为：6 6（2.6 102.6 108 8 5 5 10 104 4）=15.6 10=15.6 108 8在未涂布平板上共发觉在未涂布平板上共发觉2828个突变，故个突变，故突变率突变率=28/15.6 10=28/15.6 108 8=1.8 10=1.8 10 8 8第26页3.平板影印培养试验（平板影印培养试验（replica plating）19521952年，年，J.LederbergJ.Lederberg夫妇论文平板影印培养法和细菌突夫妇论文平板影印培养法和细菌突变株间接选择，更加好地证实了微生物抗药性是在未接触变株间接选择，更加好地证实了微生物抗药性是在未接触药品前自发地产生，这一突变与对应药品环境毫不相干。药品前自发地产生，这一突变与对应药品环境毫不相干。平板影印培养法平板影印培养法，是一个能到达在，是一个能到达在一系列培养皿一系列培养皿相同位置上相同位置上出现出现相同遗传型菌落相同遗传型菌落接种培养方法：把长有许多菌落母种培接种培养方法：把长有许多菌落母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布木质圆柱印章上，使其沾上来自养皿倒置于包有灭菌丝绒布木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上菌落。然后可把这一平板上菌落。然后可把这一“印章印章”上菌落一一接种到不一上菌落一一接种到不一样选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同样选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上菌落作对比后，就可选出适当突变型菌株。据报道，位置上菌落作对比后，就可选出适当突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上用此法可把母平板上1020%1020%量细菌转移到丝绒布上，并可利量细菌转移到丝绒布上，并可利用这一用这一“印章印章”接种接种8 8个子培养皿。所以，经过影印培养法，个子培养皿。所以，经过影印培养法，就能够就能够从从从从在非选择性条件下生长细菌群体中，分离出各种类在非选择性条件下生长细菌群体中，分离出各种类型突变株。型突变株。第27页第28页平平板板影影印印培培养养法法在根本未接触过任何一点链霉素情况下，就能够筛选到大量抗链霉素在根本未接触过任何一点链霉素情况下，就能够筛选到大量抗链霉素突变株，充分说明了突变是自发产生，链霉素只是起到了一个检出作用。突变株，充分说明了突变是自发产生，链霉素只是起到了一个检出作用。平板影印培养不但在微生物遗传理论研究中有主要应用，而且在育种平板影印培养不但在微生物遗传理论研究中有主要应用，而且在育种时间和其它研究中都有应用，值得很好地领会。时间和其它研究中都有应用，值得很好地领会。第29页（五）基因突变机制（五）基因突变机制基因突变原因是各种多样，能够是自发或诱发，诱变又基因突变原因是各种多样，能够是自发或诱发，诱变又可分可分为点突变和畸变。详细类型为点突变和畸变。详细类型可归纳以下：可归纳以下：第30页