缺血性卒中静脉溶栓后出血转化发生机制的研究进展.pdf

右江医学 2 0 2 4 年第 52 卷第 4 期Chinese Youjiang Medical Journal 2024,Vol.52 No.4专家论坛.289.缺血性卒中静脉溶栓后出血转化发生机制的研究进展戴玥,刘羽一（暨南大学珠海临床医学院暨珠海市人民医院脑血管病科，广东珠海5190 50)【专家介绍 刘羽,医学博士，美国哈佛医学院附属麻省总医院博士后，副主任医师，副教授，暨南大学硕士研究生导师，珠海市英才计划高层次人才，南粤青年好医生，珠海市欧美同学会副会长。同时担任珠海市人民医院脑血管病诊疗中心副主任，兼任培训科主任，以及学科建设办公室主任。学术兼职：中国卒中学会睡眠专业委员会委员，广东省医学会脑血管病学分会委员，广东省卒中学会理事，广东省医学教育协会医学模拟教育专业委员会常务委员，珠海市医学会理事，珠海市医师协会脑血管医师分会常务委员，珠海市医师协会介入医师分会常务委员。主要研究领域是脑血管疾病的临床及基础研究，专注于脑梗死后神经康复的病理生理学机制及治疗方法。近五年在StrokeJo u r n a l o f Ne u r o c h e mi s t r y 等SCI期刊上发表了2 0 余篇论文，参与编著了5部专著，主持国家级和省部级课题各一项，还获得了一项发明专利和一项省科学技术二等奖。【摘要】出血转化(HT)是缺血再灌注后导致的梗死区域自发性脑出血和采取相应治疗措施如使用组织型纤溶酶原激活剂(tPA)等后导致的继发性出血。静脉溶栓后 HT的发生率与多种因素有关,如急性缺血性卒中(AIS）患者的 NIHSS 评分、高血压、高血糖、心房颤动和使用抗凝药物等。神经炎症反应被认为是介导缺血再灌注损伤的重要组成部分，与HT的发生和发展密切相关。tPA-APC通路在缺血再灌注损伤中起到关键作用,活化蛋白C（A PC）主要作用于蛋白酶激活受体（PAR-1）,通过抑制NF-kB介导的基质金属蛋白酶9(MMP-9)通路降低tPA溶栓后HT的发生。综述AIS 静脉溶栓后出血转化的发生机制和预防措施，将有助于明确治疗靶点,开发靶向特异性的神经保护药物，以及通过生物标志物对HT进行早期预测，不断提高缺血性卒中静脉溶栓治疗的临床安全性,改善患者预后。【关键词】急性缺血性卒中;出血转化;组织型纤溶酶原激活剂;血脑屏障中图分类号：R743.3文献标志码：AAdvances in the mechanism of hemorrhagic transformationafter intravenous thrombolysis in ischemic strokeD0I:10.3969/j.issn.1003-1383.2024.04.001DAI Yue,LIU Yu-(Department of Cerebrovascular Disease,Zhuhai Clinical Medical College of JinanUniversity-Zhuhai Peoples Hospital,Zhuhai 519050,Guangdong,China)Abstract Hemorrhagic transformation(HT)is spontaneous cerebral hemorrhage in the infarct area caused by ischemia-reperfusionand secondary hemorrhage caused by taking corresponding treatment measures such as tissue plasminogen activator(tPA),etc.The inci-dence of HT after intravenous thrombolysis is related to multiple factors such as NIHSS score,hypertension,hyperglycemia,atrial fibrlla-基金项目：广州市科技计划项目（2 0 2 4A03J0450）第一作者简介：戴玥,女，住院医师，医学学士，在读硕士研究生，研究方向：缺血再灌注后出血转化。E-mail:通信作者：刘羽。E-mail:【本文引用格式 戴玥，刘羽.缺血性卒中静脉溶栓后出血转化发生机制的研究进展J.右江医学,2 0 2 4,52（4)：2 8 9-2 95.290tion and the use of anticoagulant drugs in patients with acute ischemic stroke(AIS).Neuroinflammatory response is considered to be animportant component in mediating ischemia-reperfusion injury and is closely related to the occurrence and development of HT.tPA-APCpathway plays a key role in ischemia-reperfusion injury.Activated protein C(APC)mainly acts on protease-activated receptor(PAR-1)and reduces tPA dissolution by inhibiting the NF-kB-mediatedmatrix metalloproteinase 9(MMP-9)pathway.Reviewing the mechanismsand preventive measures of hemorrhagic transformation after intravenous thrombolysis in AIS will help to clarify treatment targets,developtarget-specific neuroprotective drugs,and early predict HT through biomarkers,and continuously improve ischemic risk,so as to continu-ously improve the clinical safety of intravenous thrombolysis for ischemic stroke and improve patient prognosis.KeywordsI acute ischemic stroke(AIS);hemorrhagic transformation;tissue plasminogen activator(tPA);blood-brain barrier右江医学 2 0 2 4 年第 52 卷第 4 期Chinese Youjiang Medical Journal 2024,Vol.52 No.4卒中是全球第二大致死原因，因其较高的发病率和致残率，给患者及其家庭乃至整个社会都带来了较为沉重的负担,并且随着人口结构的改变,这一现象将日趋严重。其中,缺血性卒中约占卒中总发病率的8 7%。急性缺血性卒中（acute ischemicstroke，A I S)是由于大脑动脉粥样硬化导致血管狭窄甚至闭塞,以及远处栓子阻塞血流引起大脑血液供应突然中断,导致供血区域脑组织缺血缺氧坏死的一类疾病。静脉溶栓疗法是常见的早期恢复血管再通的主要措施之一,并且组织型纤溶酶原激活剂（t i s s u e p l a s mi n o g e n a c t i v a t o r，t PA）是唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA)批准用于治疗AIS的有效药物2 。但tPA静脉溶栓面临着治疗时间窗狭窄的严格适应证和出血转化（hemorrhagic transforma-tion,HT)一这一最常见且严重并发症的风险。HT可加重AIS患者局灶性神经功能缺损，甚至引起患者早期死亡。研究发现,只有不到5%的脑卒中患者能够从中受益3。因此，明确AIS静脉溶栓后HT的发病机制,对于提高溶栓安全性和改善患者预后至关重要。1HT的定义及分类HT是指缺血再灌注后导致的梗死区域自发性脑出血和采取相应治疗措施后如使用tPA溶栓药物等导致的继发性出血,出血部位既可以在梗死灶内，也可以在梗死灶远隔部位。静脉溶栓后HT的发生率与多种因素有关,如 AIS 患者的 NIHSS 评分、高血压、高血糖、心房颤动和使用抗凝药物等4。目前多采用ECASS标准对HT进行影像学分型,即根据有无血肿占位效应将HT分为出血性梗死(hemorrhagic infarction,HI）和脑实质血肿（paren-chymal hematoma,PH)两种。临床上又基于有无神经功能缺损加重（常用NIHSS评分增加4分定义）将 HT分为症状性 HT 和无症状性 HT。流行病学调查结果显示，溶栓治疗后HT的发生率高达10%48%,其中症状性 HT发生率为2%7%5。重要的是,症状性HT是缺血性卒中静脉溶栓后3个月内死亡的独立危险因素,给AIS患者生命健康构成重大威胁6 2HT发生的病理生理机制静脉溶栓引起HT发生的病理生理机制是一个动态且复杂的过程，至今仍尚未明确。目前的研究共识是再灌注使缺血受损的血脑屏障（blood-brainbarrier,BBB)完整性进一步被破坏。完整的BBB是由血管内皮细胞、星形胶质细胞末端足突、周细胞和完整的基膜等神经血管单元紧密连接构成，是调节神经元稳态和保护中枢神经系统免受外来有害物质攻击的有力屏障。静脉溶栓引起的缺血再灌注可通过一系列基质蛋白水解、氧化应激反应、神经炎症及tPA自身神经毒性所介导的相关信号通路等分子机制,导致 BBB损伤和 HT。2.1基质蛋白降解基质蛋白降解被认为是HT发生的中间环节,其中基质金属蛋白酶（matrix met-alloproteinase,MMP）被研究得最为广泛。MMPs是锌和钙依赖性肽内切酶,可以降解内皮细胞间紧密连接和几乎所有的细胞外基质。研究表明,MMP-2、MMP-3、M M P-9等可在氧化应激和炎症因子等作用下在缺血脑组织中表达上调,介导胶原蛋白、层黏连蛋白等结构蛋白的降解,使BBB通透性增加,最终导致脑水肿和HT不良事件的发生7 。其中MMP-9在诱导BBB的破坏中最为关键，使用MMP-9抑制剂可显著降低tPA诱导的再灌注模型小鼠的脑水肿和脑出血体积,提高小鼠生存率和神经行为改善能力8 。实验研究发现，亚低温和tPA联合治疗可抑制脑组织中MMP-9产生，减轻再灌注损伤,并且亚低温治疗能在不提高溶栓并发症的同时扩大溶栓时间窗 。因此,抑制MMP-9活化可能是治疗AIS静右江医学 2 0 2 4 年第 52 卷第 4 期 Chinese Youjiang Medical Journal 2024,Vol.52 No.4脉溶栓患者发生HT的有效治疗策略。然而,由于MMP-9抑制剂特异性较低,迄今为止临床上尚未批准针对 MMP-9 的功能性药物应用于HT治疗中。在最近的一项研究中,JI等10 开发了针对MMP-9的全人源单克隆抗体L13实现靶向抑制，结果显示，L13抗体对野生型小鼠的神经保护效应与MMP-9基因缺失小鼠相当,显著改善了卒中小鼠血肿体积和神经行为能力,该研究也为早日实现临床转化提供了一种可行的方法。重要的是,AIS超急性期血浆中MMP-9含量已被大量研究证明可作为溶栓后HT的独立预测因子,其水平高低也与BBB损伤程度相关1。在另一项研究中,LIU等12 发现再灌注过程中大量活化的MMP-2可以下调小窝蛋白（C a v e o lin-1,C a v-1）的表达,继而引起封闭蛋白-5（c la u d in-5)及紧密连接相关蛋白occludin在血管内皮细胞中再分布,导致BBB早期开放。此外,有研究发现血清和梗死部位低水平的Cav-1可预测溶栓后HT的发生,并且与tPA给药无关13。因此,以MMPs为核心介导的基质蛋白降解是BBB损伤的关键环节,而针对 MMPs靶向特异性抑制剂药物的开发和它们在体内的药物代谢动力学很可能成为下一步研究的热点。2.2氧化应激反应氧化应激是指体内微环境改变，引起氧化系统和抗氧化系统之间调节失衡，最终导致细胞或组织损伤的病理过程，被认为是造成缺血再灌注后HT发生的关键环节。缺血再灌注可诱导氧化磷酸化蛋白的翻译后修饰过度活跃，从而产生高线粒体膜电位，导致过量自由基产生14。自由基主要是指活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）,RNS 包括一氧化氮(NO)及过氧化硝酸盐（ONOO-）等。高水平的自由基可引起蛋白质变性、DNA及RNA损伤、酶失活和脂质过氧化等,诱导细胞死亡和破坏BBB,进而导致HT发生。静脉溶栓后过量产生的RNS可以通过RNS/Cav-1/MMP信号级联反应加剧BBB破坏15。另外有研究发现,高迁移率族蛋白B1（h i g hmobility group box 1 protein,HMGB1)是 MMP-9 表达上调的激活剂，ONOO-可通过激活HMGB1/TLR2/MMP-9信号传导促进HT,而给予HMGB1抑制剂甘草酸可减弱ONO0-介导的缺血再灌注损伤16 。在动物实验中也已经证明,对于晚期溶栓的MCAO小鼠,给予抗HMCB1抗体可以减少HT发生17 。这也为超过溶栓治疗时间窗的 AIS 患者提供了一种治.291疗选择。12/15-脂氧合酶(12/15-LO0X）作为脂质过氧化途径的关键代谢酶,在再灌注后表达上调,可以直接攻击线粒体膜造成其功能障碍,并进一步释放ROS介导神经元氧化应激损伤18 。近年来还有研究发现12/15-LOX参与铁死亡通路介导溶栓后再灌注损伤19。此外,在药物干预方面,LIU等2 0 开发了一种新型高选择性的12/15-LOX抑制剂：ML351,结果提示它能够在纳摩尔浓度级别降低大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型溶栓后的梗死体积和HT发生率。然而,12/15-LOX介导溶栓后HT发生的潜在机制和具体途径尚不明确，还有待进一步研究。以上研究表明,氧化应激与溶栓介导HT的发生发展有着密切联系，然而，氧化应激途径涉及的分子较为广泛，我们还需更加详细了解和量化参与AIS静脉溶栓处理后氧化还原信号传递的物种和其介导的信号传递，这对针对HT治疗靶点的药物开发至关重要。2.3神经炎症反应神经炎症反应被认为是介导缺血再灌注损伤的重要组成部分，与HT的发生和发展密切相关。卒中发生早期，小胶质细胞等神经炎症细胞在缺血缺氧微环境下被强烈激活，释放大量的趋化因子和促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-（T NF-）、白细胞介素-1(IL-1）等,造成神经元坏死和凋亡2 1。此外,小胶质细胞还可产生MMPs和众多炎症介质一起介导BBB的破坏2 2 。外周免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等在炎症趋化作用下,黏附并穿过受损的BBB涌入发炎的脑实质中,通过炎症级联反应进一步活化星形胶质细胞和小胶质细胞，正反馈促进神经元损伤。重要的是，缺血再灌注过程可加剧这种神经炎症反应。动物实验表明,外源性tPA处理可促进小胶质细胞募集，由M2抗炎型向M1促炎型转化，同时释放MMP-3,促进 BBB损伤和 HT发生2 3。早期研究表明,中性粒细胞在短暂性大脑中动脉闭塞模型中的浸润程度明显高于永久性动脉闭塞模型，且浸润达峰时间提前2 4。最近的临床研究也证实了这一观点,在接受静脉溶栓治疗后出现不良预后的 AIS 患者中,他们体内的单核细胞计数明显高于预后良好患者2 5。需要指出的是，中性粒细胞作为最早被招募到梗死区域的外周炎性细胞,是卒中发生后脑组织内产生MMP-9的重要来源。此外,中性粒细胞还可产生过量的 ROS 介导细胞膜脂质过氧化,破坏 BBB26。有趣的是,研究发现 tPA也与中性粒细胞向病灶处的292募集和活化有关。在应用tPA治疗的AIS 患者中，给药后30 分钟即可观察到中性粒细胞脱粒高峰2 7 。系统评价分析了涉及17 2 32 名AIS患者的52项临床研究,提示中性粒细胞和淋巴细胞比值与3个月后预后不良和HT相关2 8 。较高的嗜酸性粒细胞计数也可预测HT发生2 9。这些发现表明,炎症细胞浸润是溶栓再灌注诱导HT的重要因素,针对免疫细胞在 AIS 发生后的缺血和再灌注阶段的病理生理途径进行靶向性的治疗可能对预防HT发生有效。2.4tPA 的作用tPA是丝氨酸蛋白酶的一种,可将不溶性的纤维蛋白原转变为可溶性的纤维蛋白，从而使阻塞的血管再通。然而,有研究证明tPA除了其血栓溶解作用外,还具有潜在的神经毒性,应用tPA可使AIS患者发生HT的风险增加10 倍30-31。以下简要介绍tPA激活的几种信号通路介导HT发生机制。2.4.1tPA-LRP通路低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)是一种可介导内吞作用的跨膜脂蛋白受体,广泛表达于神经元及血管周围星形胶质细胞表面，可与包括tPA在内的多种配体相互作用,调节细胞信号传导32 。tPA通过BBB的方式有LRP依赖性和非依赖性两种形式,而这主要取决于BBB的损伤程度33。然后,进入脑实质中的tPA可以进一步剪切小胶质细胞表面的LRP,通过激活转录因子NF-kB途径促进 MMPs 基因表达,从而导致脑水肿和 HT发生34。此外,tPA还可以通过LRP-1/Akt通路诱导中性粒细胞在缺血脑组织浸润，介导再灌注损伤35。在另一项基础研究中发现,缺血条件下,tPA能够通过LRP-1激活中性粒细胞胞外陷阱（NETs)形成的关键酶PAD4，随后大量释放入脑组织的NETs进一步激活小胶质细胞中的DNA感受器Cgas-STING,介导 BBB 破坏和 HT 发生3。该实验也为我们提高tPA溶栓治疗的安全性提供了新的靶标。并且,LRP还被证明与tPA介导的谷氨酸兴奋性毒性有关37 。以上研究表明 LRP在参与tPA介导的脑损伤,尤其是神经炎症方面具有重要作用。2.4.2tPA-APC通路活化蛋白C（a c t i v a t e d p r o-tein C,APC)是一种具有抑制血栓形成、抗炎和抗调亡活性的内源性蛋白,具有直接的血管和神经保护作用38 。LIU等39 研究发现,tPA可以激活介导细胞调亡信号传导路径的关键启动因子caspase-8,从右江医学 2 0 2 4 年第 52 卷第 4 期Chinese Youjiang Medical Journal 2024,Vol.52 No.4而促进缺血缺氧状态下的脑内皮细胞和神经元坏死调亡,而APC可以抑制该信号途径阻断tPA的神经血管毒性。CHENG等40 在2 0 0 6 年首次发现,在卒中体内和体外模型中,APC主要作用于蛋白酶激活受体（protease-activated receptor 1,PAR-1),通过抑制NF-kB介导的MMP-9通路降低tPA溶栓后HT的发生。WANG等41 研究发现,在大鼠脑缺血再灌注模型中,APC可以抑制 NF-kB的活化和NF-kB下游炎症因子的激活,从而降低梗死体积并改善BBB通透性。此外,在一项涉及 110 名 AIS 患者的多中心随机、双盲、安慰剂对照期试验中，结果显示采用APC类似物3K3A-APC联合治疗的溶栓患者,其HT发生率大大降低，较单纯tPA治疗更加安全、有效42 。需要指出的是,在体外实验中已经证明治疗浓度下的3K3A-APC对tPA的血栓溶解功能并无影响43。以上研究表明,APC 有望成为tPA溶栓的常规辅助疗法广泛应用于临床实践中。2.4.3tPA-PDGF通路血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）在调控细胞分裂、增殖、趋化和血管收缩等生理功能方面具有重要作用。早期研究表明,tPA能够与活化血管周围星形胶质细胞上的PDCFR-相结合，促进Rho激酶途径的高表达,进而破坏BBB,而使用PDGFR-拮抗剂伊马替尼可降低BBB通透性和tPA引起的HT4。在另一项研究中,SHEN 等45发现PDGFR-高度特异性表达于周细胞和血管平滑肌细胞中,它在缺血缺氧微环境中表达上调,通过促进转化生长因子-1（T G F-）的表达发挥神经保护效应。YANG等46 通过实验研究发现,外源性的tPA可通过抑制周细胞中PDGFR-/TGF-/p-Smad2/3信号传导，促进周细胞中炎症因子产生破坏BBB。此外,SU等47 通过体外和体内试验证明了LRP1和小胶质细胞上表达的整合素Mac-1与促进tPA诱导的PDCF-CC高效激活有关。HE等48 发现,在大鼠电凝血栓栓塞模型中,在给予tPA之前预先进行短期缺血处理可以抑制PDGF-CC/PDGFR通路活化,减轻tPA导致的BBB破坏,并作为AIS患者溶栓治疗的一种辅助疗法。2.4.4tPA-NMDAR通路N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NM D A R）是一种受谷氨酸激活的离子通道蛋白,参与调控突触可塑性、神经网络活动和认知功能等。大量释放的兴奋性递质即谷氨酸过度激活NMDARs，促进Ca2内流，右江医学 2 0 2 4 年第 52 卷第 4 期 Chinese Youjiang Medical Journal 2024,Vol.52 No.4致使神经元内钙超载,触发一系列如钙蛋白酶激活、氧化应激、线粒体损伤等兴奋性毒性级联反应，造成神经元坏死凋亡和BBB破坏49。据报道，tPA可以以独立于纤溶酶原激活发生的方式激活NMDAR信号转导,同时剪切并结合NMDAR的NR1亚基,增强NMDAR介导的神经兴奋性毒性50 由此可见，tPA可以激活多个信号分子造成神经元和BBB损伤,极大增加HT的风险。而靶向阻止这些信号通路的激活有望为HT的治疗提供新的思路和方向。3小结HT是AIS患者静脉溶栓后的常见并发症,可加重患者神经功能缺损症状,带来更差的临床预后,甚至造成患者死亡。HT的发生机制十分复杂,是多种分子机制协同交叉作用的结果,其病理生理学基础是BBB的崩解。缺血缺氧发生后,血管壁内皮细胞等功能细胞受到损伤,出现能量代谢紊乱、白细胞浸润、炎症激活等多项病理过程,造成细胞毒性水肿和BBB通透性异常增高;随即进行的溶栓再通过程使恢复的血流大量挤入受到损伤且异常通透的血管床内,在挽救缺血半暗带的同时激活一系列复杂瀑布级联反应,如基质蛋白降解、过量自由基蓄积、离子失衡、炎症反应和tPA介导的神经毒性效应等,最终上述机制共同作用导致完整的BBB损伤，发生HT、脑水肿、梗死面积扩大等预后不良事件。因此,不断深人探索静脉溶栓引起HT的分子机制,将有助于我们明确治疗靶点，从而开发靶向特异性的神经保护药物,还可以通过生物标志物对HT进行早期预测,不断提高缺血性卒中静脉溶栓治疗的临床安全性，显著改善患者预后,提高患者生存质量并降低全社会经济负担。参考文献1KLEINDORFER D O,TOWFIGHI A,CHATURVEDIS,et al.2021 guideline for the prevention of stroke inpatients with stroke and transient ischemic attack:aguideline from the American heart association/americanstroke associationJ.Stroke,2021,52(7):e364-e467.2 TSIVGOULIS G,KATSANOS A H,SANDSET E C,etal.Thrombolysis for acute ischaemic stroke:current sta-tus and future perspectives J.Lancet Neurol,2023,22(5):418-429.3 HASANTF,HASANH,KELLEYRE.Overview of293acute ischemic stroke evaluation and 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