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PCR 技术种类及其应用

1 PCR 技术基本原理
PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在条件下，依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)酶促合成反映。其详细反映分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一种循环， 每一循环产物DNA又可以作为下一种循环模板，数小时后，介于两个引物之间目DNA得到了大量复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。
2　PCR技术种类
2.1 反向PCR( Inverse PCR，IPCR)技术
原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列一种办法．重要原理是用一种在已知序列中无切点限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合引物，扩增夹在中间未知序列。该扩增产物是线性DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部酶切位点分布状况。用不同限制性内切酶消化，可以得到大小不同模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段 。
该办法局限性是：①需要从许多酶中选取限制酶，或者说必要选取一种适当酶进行酶切才干得到合理大小DNA片段。这种选取不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组具有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到探针就有也许与各种基因序列杂交。
2.2　锚定PCR(Anchored PCR，APCR)技术
用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR。
应用：它可用于扩增未知或全知序列，如未知cDNA制备及低丰度cDNA文库构建。
2.3　不对称PCR(asymmetric PCR)技术
两种引物浓度比例相差较大PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同引物浓度，惯用50～100÷1比例。在最初10～15个循环中重要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导PCR反映就会产生大量单链DNA。
应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交探针。
2.4　反转录PCR(reverse transcription，RT- PCR)技术
当扩增模板为RNA时，需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才干进行扩增。RT - PCR应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检查等都经常采用。
2.5　修饰引物PCR技术
为达到某些特殊应用目，如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等 。
2.6　巢式PCR(NEST PCR)技术
先用一对靶序列外引物扩增以提高模板量，然后再用一对内引物扩增以得到特异PCR带，此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR操作环节可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少，同步在第一次PCR时采用较高退火温度而第二次采用较低退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，通过若干次循环，待外引物基本消耗尽，无需取出第一次PCR产物，只需减少退火即可直接进行PCR扩增。这不但减少操作环节，同步也减少了交叉污染机会。这种PCR称半途进退式PCR( drop-in，drop-out PCR)。上述三种办法重要用于很少量DNA模板扩增。
2.7　等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR，ASPCR)技术
ASPCR依赖于引物3’- 端一种碱基错配,不但减少多聚酶延伸效率,并且减少引物-模板复合物热稳定性。这样有点突变模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。
2.8　单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR，SSCPPCR)技术
SSCP- PCR是依照形成不同构象等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度关于外,更重要取决于DNA单链所形成空间构象，相似长度单链DNA因其顺序不同或单个碱基差别所形成构象就会不同,PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处在一定位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会浮现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。
2. 9　低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR，LSSP- PCR)技术
LSSP - PCR 是建立在PCR 基本上又一种新型基因突变检测技术。规定是“二高一低”，高浓度单链引物( 5’- 端/ 3’- 端引物均可),约4. 8Lmol,高浓度Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) ，低退火温度( 30℃),所用模板必要是纯化DNA片段。在这种低严格条件下，引物与模板间发生不同限度错配，形成各种大小不同扩增产物，经电泳分离后形成不同带型。对同一目基因而言，所形成带型是固定，因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定迅速敏感办法。
2.10　复合PCR(multiplex PCR)技术
在同一反映中用多组引物同步扩增几种基因片段,如果基因某一区段有缺失,则相应电泳谱上这一区带就会消失。复合PCR重要用于同一病原体分型及同步检测各种病原体、各种点突变分子病诊断。
2.11　重组PCR技术
重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中，两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反映,产生一种包括两个不同基因杂合基因。
2.12　随机引物扩增技术(arbitrary primedPCR，AP- PCR)
AP-PCR技术通过随意设计或选取一种非特异性引物,在PCR反映体系中,一方面在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经Taq酶作用使引物延伸而发生DNA片段扩增，经一至数轮不严格条件下PCR循环后,再于严格条件下进行扩增。扩增产物经DNA测序凝胶电泳分离后,经放射性自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图。AP-PCR用于肿瘤抑制基因、癌基因分离；菌种、菌株及不同物种鉴定；遗传作图；不同分化限度或某些不同状态下组织基因表达差别等方面研究。
2.13 　差示PCR (differential PCR，d -PCR)技术
d-PCR可以定量检测标本靶基因拷贝数。它是将目基因和一种单拷贝参照基因置于一种试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带,比较两条区带丰度,或在引物5’- 端标记上放射性核素后,通过检测两条区带放射性强度即可测出目基因拷贝数。
2.14　定量PCR(quantitative PCR，qPCR)技术
qPCR技术是用合成RNA作为内标来检测PCR扩增目mRNA量,涉及目mRNA和内标用相似引物共同扩增,但扩增出不同大小片段产物,可容易地电泳分离。一种内标可用于定量各种不同目mRNA。qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平变化,在癌症、代谢紊乱及自身免疫性疾病诊断和分析中很有价值。
2.15 　竞争性PCR(competitive PCR，c-PCR)技术
c-PCR技术是竞争cDNA模板与目cDNA 同步扩增,使用同样引物,但一经扩增后，能从这些目cDNA区别开来。普通使用突变性竞争cDNA模板,其序列与目cDNA序列相似,但是模板中仅有一种新内切位点或缺少内切位点,突变性cDNA 模板可用恰当内切酶水解,并用分光计测定其浓度。cDNA目序列和竞争模板相相应含量,可用溴化乙锭染色,电泳胶直接扫描进行测定,或掺入放射性同位素标记办法测定。竞争模板开始时浓度是已知,则cDNA目序列最初浓度就能测定。这种办法能精准测定mRNA中cDNA靶序列,可用于几种到10个细胞中mRNA 定量。
2.16　半定量PCR(semiquantitative PCR,sq- PCR)技术
sq-PCR不同于c-PCR是参照物ERCC-2PCR产物与目DNAPCR产物相似,并分别在试管中扩增。sq- PCR流程为样品和内参照RNA分别经反转录为cDNA,然后样品cDNA和一系列不同量参照cDNA分别在不同管进行扩增，PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳拍照,光密度计扫描,作出原则曲线,通过回归公式便可定量表达基因量。虽然管与管之间扩增效率难以控制,但由PCR扩增所有样本和参照物在不同实验中差别很小。这种敏感技术可用于其她低表达基因定量
2.17　原位PCR( in situ PCR)技术
原位PCR综合了PCR 和原位杂交( Insitu hybridization，ISH) 长处,是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定DNA或RNA进行扩增,再用特异性探针原位杂交检测。原位PCR标本普通需先经化学固定,以保持组织细胞良好形态构造。细胞膜和核膜有一定通透性,PCR扩增所需各种成分可进入细胞内或核内,在原位对特定DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织，不易透过细胞膜向外弥散，故保存在原位。这样就很容易应用ISH将其检出,同步还可对目DNA序列组织细胞进行形态学分析。
2.18　免疫PCR(immuno PCR)技术
抗原-抗体反映与PCR技术结合产生了免疫PCR，是当前为止最为敏感检测办法,理论上可测到一种抗原分子存在。通过用一种具备对DNA和抗体双重结合活性连接分子,使作为标记物DNA分子特异地结合到Ag- Ab复合物上，从而形成Ag- Ab- DNA复合物，附着DNA标记物可用适当引物进行PCR扩增。特异性PCR产物存在证明DNA标记物分子特异地附着于Ag - Ab复合物上，进而证明有Ag存在。吴自荣等将Ab通过化学交联剂直接连接到分子上构建成Ab-DNA探针,构成免疫PCR检测新模式，具备高度敏捷和特异性。免疫PCR可对流行性传染病( 如肝炎、爱滋病等)进行检测，检测体液中致癌基因和癌基因表达微量蛋白等。
2.19　长片段PCR(long-PCR)技术
长片段PCR是用高质量模板DNA保证其完整性,引物应较长( 21～34bp)，使用高退火温度及错配率更低酶，将无3’-5’外切酶活性DNA聚合酶和低浓度有3’- 5’外切酶活性DNA聚合酶组合使用，缓冲体系通过提高Tris浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，并调高体系pH。热循环参数总来说需增长延伸时间，普通1kb/ min，同步采用热启动。长片段PCR在限制性片段多态性及单体型分析、染色体基因步移、DNA序列分析及基因突变鉴定等方面得到应用。
3 PCR技术应用
3.1 PCR技术在农业中应用
3.1.1 PCR在转基因产品检测中应用
当前，有关研究人员已经运用PCR技术成功建立了检测转基因马铃薯、大豆和玉米技术路线，对转基因大豆和玉米检测低限分别到达了1％和0.1％。
3.1.2 PCR在研究植作物生长发育方面作用
植物生长、发育、分化和衰老都涉及许多基因时空顺序表达，因而研究这个过程中基因表达变化是揭示生长发育机理重要手段。定量RT-PCR是研究植物基因表达水平变化一项重要技术。通过研究不同植物或批准植物不同发育时期基因表达水平来揭示植物生长发育机理。
3.1.3 PCR在作物抗病性基因分析、定位中应用
在作物病害研究中，作物抗病性及其机制研究始终是当今作物病理学和作物抗病育种中热点和焦点问题。而咱们当前已经懂得作物对病原物抗性是由相对基因所控制，即被广泛承认基因对基因理论。因而，寻找与作物抗病性紧密连锁基因标记，即将抗病性基因进行定位研究中具备十分重要理论意义和实践意义。运用PCR和RAPD技术可以找到与抗性紧密连锁分子标记，并将其进行定位。
3.2 PCR技术在食品科学中应用
PCR技术在食品科学中重要用于对食品中微生物含量检测。应用PCR技术，只需数小时，就可以用电泳法检测出来0.1mgDNA中仅含数个拷贝模板序列；用PCR扩增细菌中保守DNA片段，还可对那些人工无法培养微生物进行检测。
3.3 PCR技术在医学中应用
当前，全世界运用PCR技术诊断感染性疾病每年达几千万人次，可见其巨大市场潜力。PCR技术重要用于肿瘤、遗传病和感染性疾病诊断。
3.3.1 PCR在肿瘤诊断上应用
遗传学变化重要是引起癌基因激活和抑癌基因失活，使基因发生突变、缺失、增长和易位等而导致了细胞癌变。PCR不但能有效地检测基因突变、重排、易位等，并且能精确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤初期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估等。当前用于肿瘤检测PCR重要有定量RT-PCR，它在肿瘤诊断、治疗和微转移以及微小残留病灶检测等方面具备广泛应用价值。
3.3.2 PCR在遗传病诊断上应用
十几年来，该技术在遗传病诊断临床应用方面获得了极大成功，如地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆性x综合症、苯丙酮尿怔等这些遗传病都可以通过PCR技术对患者基因进行扩增，然后运用基因分析直接检测出突变位点，
3.3.3 PCR在痘染性疾病方面应用
当前PCR在医学检查中对感染性疾病诊断极具突出，只要核酸序列是清晰，就可以检测到任何有限病原体，从而判断疾病与否处在隐性或亚临床状态、现症感染或既往感染。