三痹颗粒治疗类风湿性关节炎的临床观察及网络药理学研究.pdf

中医药信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024基金项目：湖南省中医药管理局项目（编号：202122）作者简介：邹滔（1985.12-），男，湖南娄底人，本科，主管药师，主要从事中药制剂研究通讯作者：梁权兵（1978.6-），男，湖南娄底人，本科，副主任医师，主要从事中医药防治类风湿性关节炎的基础和临床研究三痹颗粒治疗类风湿性关节炎的临床观察及网络药理学研究邹 滔1袁谢湘雄1袁禹勇军1袁梁权兵2渊娄底市中医医院药学部1袁针灸康复中心2袁湖南 娄底417000冤摘要院目的观察三痹颗粒治疗类风湿性关节炎渊RA冤的临床疗效袁并采用网络药理学对其作用机制进行初探遥方法选取2021年1月-2022年12月娄底市中医医院收治的RA患者96例袁随机分为研究组渊48例冤和对照组渊48例冤袁对照组给予常规药物治疗袁研究组在此基础上给予三痹颗粒治疗袁比较两组治疗2个月后临床疗效及血清指标红细胞沉降率渊ESR冤尧C-反应蛋白渊CRP冤尧类风湿因子渊RF冤尧抗环瓜氨酸肽抗体渊ACPA冤及白细胞介素-6渊IL-6冤遥另基于网络药理学方法袁首先利用TCMSP数据库数据库筛选三痹颗粒的有效成分和作用靶点袁将结果在Gene Cards数据库中检索抗RA相关靶点袁求交集获得关键核心靶点曰其次袁借助STRING数据库进行蛋白互作分析袁通过DAVID数据库进行基因本体论渊GO冤功能和基因组百科全书渊KEGG冤通路富集分析曰最后袁利用Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白互作和野活性成分-靶点-通路冶网络遥结果治疗组总有效率为96.50%袁高于对照组的68.75%渊 约0.05冤曰治疗组治疗后2个月后ESR尧CRP尧RF尧ACPA尧IL-6水平优于对照组渊 约0.05冤遥网络药理学研究分析得到21个关键活性成分和27个潜在靶点袁主要通过10条关键信号通路发挥抗RA作用遥结论三痹颗粒治疗RA具有多成分尧多靶点尧多通路的协同干预作用特点袁能有效改善RA患者临床症状袁临床效果确切遥关键词院三痹颗粒曰类风湿性关节炎曰网络药理学中图分类号院R593.22文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.003文章编号院1006-1959渊2024冤04-0014-07Clinical Observation and Network Pharmacology Study on the Treatment of Rheumatoid Arthritiswith Sanbi GranuleZOU Tao1,XIE Xiang-xiong1,YU Yong-jun1,LIANG Quan-bing2(Department of Pharmacy1,Acupuncture Rehabilitation Center2,Loudi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Loudi 417000,Hunan,China)Abstract：Objective To observe the clinical efficacy of Sanbi Granules in the treatment of rheumatoid arthritis(RA),and to explore its mechanism ofaction by network pharmacology.Methods A total of 96 patients with RA treated in the Loudi Hospital of Traditional Chinese Medicine from January2021 to December 2022 were selected and randomly divided into study group(48 patients)and control group(48 patients).The control group wasgiven conventional drug treatment,and the research group was given Sanbi granules on the basis of this treatment.The clinical efficacy and serumindexes erythrocyte sedimentation rate(ESR),C-reactive protein(CRP),rheumatoid factor(RF),anti-cyclic citrullinated peptide antibody(ACPA)and interleukin-6(IL-6)were compared between the two groups after 2 months of treatment.Based on the network pharmacological method,first,theeffective components and targets of Sanbi granules were screened with TCMSP database,the key core targets were obtained by intersection of theresults and the anti-RA related targets retrieved from Gene Cards databases.Secondly,STRING database was used for protein interaction analysis,protein interaction and active components-targets-pathway network was constructed by Cytoscape 3.6.1.Finally,gene ontology(GO)function andKEGG pathway enrichment analysis were performed by DAVID database,and the above results were verified by molecular docking technique.Results The total effective rate of the treatment group was 96.50%,which was higher than 68.75%of the control group(0.05).The levels of ESR,CRP,RF,ACPA and IL-6 in the treatment group were better than those in the control group 2 months after treatment(0.05），资料均衡可比。本研究已经得到医院伦理委员会的批准，并得到患者的知情同意，同时也签署了知情同意书。1.1.2 诊断标准 所有入选患者均符合 2010 年美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）/欧洲抗风湿联盟（European League AgainstRheumatism，EULAR）发布的 RA 西医分类标准。中医诊断标准与 中药新药临床研究指导原则 RA 寒湿痹阻证的辨证标准一致，其主要证候：关节胀痛、遇冷痛剧、清晨僵直、屈伸不畅、局部喜温凉；次症：乏力、口不渴、寒冷和天气变化增加、四肢沉重等；舌脉：舌质淡、苔薄，脉弦细、浮或沉7。1.1.3 纳入及排除标准 纳入标准：符合上述诊断标准，患者 1 个月内未使用非甾体类抗炎药等抗风湿药物。排除标准：合并有其它风湿病的患者；疾病晚期，关节严重畸形或并发症严重；妊娠及哺乳期女性；有严重基础疾病的患者，如严重心肺功能不全、肝肾功能严重受损等；正在参与其它药物临床试验者；过敏体质者。1.1.4 治疗方法 对照组患者口服甲氨蝶呤片（上海上药信谊药厂有限公司，国药准字 H31020644，规格：2.5 mg/片），10 mg/次，1 次/周。研究组在对照组服药基础上加用三痹颗粒（本院制剂室生产，组成：黄芪 30 g、人参 3 g、续断 15 g、细辛 3 g、杜仲 15 g、防风 10 g、肉桂 5 g、茯苓 15 g、白芍 15 g、炙甘草10 g、生地 15 g、川芎 10 g、川牛膝 15 g、红花 10 g、伸筋草 15 g、当归 15 g），温水冲服，2 次/d。1.1.5 观察指标 治疗 2 个月后，比较两组临床疗效及血清指标。临床疗效：根据病情的严重程度，证候积分可以被分类为无、轻、中、重度。主要症状的评分分别是 0、2、4、6 分，而次要症状的评分则是 0、1、2、3 分。显效为明显改善了患者的中医临床症状和体征，同时证候积分减少不少于 70%；有效为改善了患者的中医临床症状和体征，证候积分减少在30%70%；无效为没有改善或者加重了患者的中医临床症状和体征，证候积分减少小于 30%。血清指标：采用魏氏法检测红细胞沉降率（erythrocytesedimentation rate，ESR）；采用胶乳增强免疫比浊法检测类风湿因子（rheumatoid factor，RF）和 C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）；采用 ELISA 法检测抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptideantibody，ACPA）和白细胞介素-6（IL-6）。1.1.6 统计学方法 采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，采用 检验分析计量资料，以（依）表示，采用2检验分析计数资料，以（，%）表示，其中约0.05为差异有统计学意义。1.2 网络药理学分析1.2.1 三痹颗粒化学成分和作用靶点筛选通过TCMSP 数据库对三痹颗粒处方中的化合物进行检索，在“Related Targets”页面导入化合物的编号，获得其靶标蛋白。在 Uniport 数据库（https:/www.u原niprot.org/）中导入获取的化合物靶点资料，采用STRING（https:/string-db.org/）中 Multiple proteins 和UniProt（http:/www.uniprot.org/）中 UniProtKB 搜索功能，进行标准化得到结果。从 Gene Cards 数据库（https:/www.genecards.org/）检索类风湿性关节炎的相关靶点并将其结果引入 Excel 中，与处方成分靶15中医药信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024点共同引入 Venny 2.1.0 数据库（https:/b.csic.es/tools/venny/）映射，记录两者的交集部分，并绘制韦恩图。1.2.2 蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将上述筛选所得到潜在靶点输入 STRING 数据库（https:/ 0.09，获取交集靶点的 PPI 网络图，并利用 Cytoscape 3.9.1 软件中CytoNCA 插件对网络图进行绘制。1.2.3 靶点基因功能与靶点通路富集分析 将筛选出的三痹颗粒潜在靶点导入 DAVID（https:/david.ncifcrf.gov/）数据库，设定物种条件为“Homo sapi原ens”，采取基因本体论（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设定阈值约0.05，再用GraphPad Prism 8.0 将结果可视化。1.2.4“活性成分-靶点网络-通路”网络的构建 利用Cytoscape 3.9.1 软件，构建处方“成分-靶点-通路”网络，分析化合物和靶点间的度（degree）值关系，其中节点代表化学成分、靶点和信号通路，边用来连接化学成分、靶点和信号通路。2结果2.1 临床观察结果2.1.1 两组临床疗效比较 治疗 2 个月后，研究组临床总有效率高于对照组（约0.05），见表 1。2.1.2 两组治疗前后血清指标比较 治疗 2 个月后，两组 ESR、CRP、RF、ACPA、IL-6 水平优于治疗前，且研究组优于对照组（约0.05），见表 2。组别研究组对照组4848显效1814有效2419无效615总有效率87.50*68.75表1两组临床疗效比较渊 袁%冤注：*与对照组比较，2=4.937，约0.05组别研究组对照组4848时间治疗前治疗后治疗前治疗后ESR（mm/h）17.82依6.427.14依2.13绎17.91依6.3310.42依2.91绎吟CRP（mg/L）12.74依3.415.12依3.37绎12.63依3.128.48依3.94绎吟RF（IU/ml）26.23依5.3612.82依2.64绎26.14依5.5117.52依2.92绎吟ACPA（RU/ml）30.48依3.9316.04依3.72绎30.53依3.8720.23依4.11绎吟IL-6（pg/ml）14.52依6.422.91依1.82绎14.77依6.824.63依1.92绎吟表2两组治疗前后血清指标比较渊 依 冤注：与同组治疗前比较，绎约0.05；与研究组比较，吟约0.052.2 网络药理学研究结果2.2.1 三痹颗粒化学成分及其作用靶点的搜集 通过TCMSP 获取三痹颗粒处方 332 个无重复靶点，通过Gene Cards 查询获得抗 RA 作用靶点 2787 个无重复靶点。通过在线韦恩图可知，处方中化合物与抗 RA作用的交集基因有 191 个，分别为 IL6、TNF、CRP等，借助 Venny 2.1.0 将结果可视化，结果见图 1。2.2.2 PPI 网络图的构建及核心靶点筛选 将上述韦恩图结果中的交集靶点输入到 STRING 数据库，获取靶点相互作用的网络关系数据，随后将其导入Cytoscape 3.9.1 软件，建立 PPI 蛋白网络图（图 2），网络含有 157 个节点和 778 条边（剔除 5 个游离靶点）。利用 Cytoscape 3.9.1 软件中 CytoNCA 插件对网络图进行分析，获取处方治疗湿疹的核心靶点，degree 值排名前 10 的核心靶点分别是 AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、MAPK14、ESR1、FOS、IL6。2.2.3 GO 功能和 KEGG 通路富集分析 通过 GO 功能富集分析，共获得 GO 条目 387 个，包括生物过程（biological process）条目 315 个，涉及 RNA 聚合酶域启动子转录的正调控、基因表达的正调控、DNA 转录的正调控等；细胞组成（cellular component）条目20 个，涉及核质、细胞质、细胞溶胶等；分子功能图1三痹颗粒和RA交集靶点韦恩图16中医药信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024（molecular function）条目 52 个，涉及酶结合、蛋白结合、转录因子等，见图 3。通过 KEGG 通路富集分析，共获得 143 条信号通路，涉及 MAPK、Dectin-1、TNF、IL-17、Toll 样受体信号通路等，排名前 10 个通路的气泡图见图 4。2.2.4 处方“成分-靶点-通路”网络的构建 该网络由 58 个节点（包含 21 种活性成分、27 个靶点、10 个关键通路节点）和 183 条边，其中化学成分槲皮素、汉黄芩素、木犀草素等节点较大，提示这些成分可能是三痹颗粒的主要活性成分，另外 MAPK14、AKT1、RELA 等靶点节点较大，提示这些靶点可能是三痹颗粒发挥治疗作用的关键靶点，见图 5。图2交集基因PPI图图3三痹颗粒治疗RA的GO富集分析17中医药信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024图4三痹颗粒治疗RA的KEGG信号通路分析注：“菱形”代表通路，“长方形”代表化学成分，“椭圆形”代表作用靶点图5三痹颗粒活性成分-靶点-通路网络图18中医药信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.20243讨论RA 是以关节损伤为主的慢性自身免疫性疾病之一，其病因和发病机制尚不十分清楚，临床治疗主要是控制症状和延缓病情。中医学把 RA 归属痹症范畴，治以温经散寒、祛风除湿。三痹颗粒是娄底市中医院临床验方，本方以人参、黄芪补气为君药，当归、川芎、白芍、红花补血活血为臣药，佐以防风、细辛、茯苓等伸筋草之类以祛风除湿，肉桂、续断、牛膝以补肾散寒，使以炙甘草与诸药调和，诸药配伍共奏温经散寒、祛风除湿之功效。临床上通常采用 RF 和 ACPA 对 RA 进行诊断分类，CRP 和 ESR 水平是判断 RA 病情活动度和评价治疗效果的重要指标，促炎因子 IL-6 与 RA 的疾病活动、发展变化和治疗效果密切相关。本临床研究结果显示，研究组治疗 2 个月后总有效率高于对照组（约0.05）；研究组和对照组治疗 2 个月后 RF、ACPA、ESR、CRP、IL-6 水平均低于治疗前，且研究组优于对照组（约0.05），提示寒湿痹阻型 RA 患者通过服用三痹颗粒能够有效改善其临床症状，同时可降低 ESR、CRP、RF、ACPA 及 IL-6 水平，延缓病情进展。此外，本研究通过网络药理学方法筛选三痹颗粒中活性成分靶点，发现槲皮素、汉黄芩素、木犀草素连接的靶点较多，是治疗 RA 的潜在关键药效成分，且这三种成分均为黄酮类化合物，这可能与黄酮类化合物抗炎和抗氧化的作用机制有密切关系8，9。槲皮素广泛分布于植物的各个部位，且生物学活性多样化，如消除炎症及微生物、抗过敏和防止糖尿病并发症等10，11。研究表明12，槲皮素能降低 RA实验模型炎症，表现出对肝脏的保护作用；同时，其能有效降低 RA 成纤维滑膜细胞炎症因子和基质金属蛋白酶表达，其作用机制可能与抑制 NF-资B 表达有关13。汉黄芩素常用于治疗一些过敏性和炎症性疾病14。研究发现15，汉黄芩素能抑制氧化应激和炎症因子的侵袭，对 RA 有预防作用。而木犀草素可通过抑制滑膜中炎性细胞因子和基质水解酶的表达发挥 RA 的治疗作用16。另外，本研究中三痹颗粒治疗 RA 靶点 PPI 网络显示，AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、MAPK14、ESR1、FOS、IL6 等 27 个靶点是三痹颗粒治疗 RA 的关键靶点。各种炎性细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳生成、及骨组织损伤是 RA 的主要病理特点17。有研究显示18，AKT 在 RA 滑膜细胞中高表达，故认为 AKT 与 RA 成纤维样滑膜细胞过度增殖可能呈正相关。TP53 在 RA 滑膜来源的间充质干细胞中表达下调19，TP53 能显著减轻佐剂诱导的关节炎大鼠滑膜炎，降低 IL-6 水平20。IL-6 在免疫应答、造血和中枢神经系统中都扮演着关键角色，RA 患者血清和滑膜腔内 IL-6 的浓度与其疾病的活跃性紧密相连21-23。本研究通过 GO 富集分析及 KEGG 通路富集分析，初步得到三痹颗粒主要通过 MAPK、C-type lectin receptor、TNF 等途径来对 RA 进行治疗的。TNF 是经典细胞因子通路之一，可调控 RA 患者的破骨细胞、成骨细胞和滑膜细胞的功能，通过激发炎性细胞因子生成、滑膜增殖、血管翳生成，以及破坏骨和软骨，从而导致 RA 的产生，因此它是治疗RA 的关键目标路径之一24-27。综上所述，三痹颗粒能够有效改善寒湿痹阻型RA 患者的临床症状及体征，其治疗 RA 的关键药效物质为槲皮素、汉黄芩素、木犀草素，抗 RA 的作用机制与 MAPK、C-type lectin receptor、TNF 通路相关。参考文献院1Radu AF,Bungau SG.Management of Rheumatoid Arthritis:An OverviewJ.Cells,2021,10(11):2857.2Huang J,Fu X,Chen X,et al.Promising Therapeutic Targetsfor Treatment of Rheumatoid ArthritisJ.Front Immunol,2021,12:686155.3Smith MH,Berman JR.What Is Rheumatoid Arthritis?J.JA鄄MA,2022,327(12):1194.4杨梅玉,王莒生,谢幼红,等.中药治疗类风湿关节炎的有效性与安全性评价J.北京中医药,2009,28(7):497-500.5牛明,张斯琴,张博,等.叶网络药理学评价方法指南曳解读J.中草药,2021,52(14):4119-4129.6Zhang YG,Liu XX,Zong JC,et al.Investigation driven bynetwork pharmacology on potential components and mechanismof DGS,a natural vasoprotective combination,for the phy鄄totherapy of coronary artery diseaseJ.Molecules,2022,27:4075.7葛瑞彩.附桂愈痹汤治疗类风湿性关节炎临床观察J.山西中医,2023,39(1):24-26.8Sun YW,Bao Y,Yu H,et al.Anti-rheumatoid arthritis effectsof flavonoids from Daphne genkwaJ.Int Immunopharmacol,2020,83:106384.9Nayely LL,Erick GG,Dulce AP,et al.Flavonoids as cytokinemodulators:A possible therapy for inflammation-related diseases19中医药信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024J.Int J Mol Sci,2016,17(6):921.10Babaei F,Mirzababaei M,Nassiri AM.Quercetin in food:pos鄄sible mechanisms of its effect on memory J.J Food Sci,2018,83(9):2280-2287.11Ferenczyova K,Kalocayova B,Bartekova M.Potential Impli鄄cations of Quercetin and its Derivatives in CardioprotectionJ.JInt J Mol Sci,2020,21(5):1585.12de Figueiredo Costa AC,de Sousa LM,Dos Santos Alves JM,etal.Anti-inflammatoryandhepatoprotectiveeffectsofquercetin in an experimental model of rheumatoid arthritisJ.In鄄flammation,2021,44(5):2033-2043.13贾庆运,王拥军,梁倩倩,等.槲皮素对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞炎症因子和基质金属蛋白酶的表达的影响J.中国骨质疏松杂志,2019,25(6):738-741.14Ahmed QU,Sarian MN,Mat Soad SZ,et al.Methylation andacetylation enhanced the antidiabetic activity of some selectedflavonoids:In vitro,molecular modelling and structure activityrelationship-based studyJ.Biomolecules,2018,8(4):149.15Huang Y,Guo L,Chitti R,et al.Wogonin ameliorate com鄄plete Freund爷s adjuvant induced rheumatoid arthritis via target鄄ing NF-kappaB/MAPK signaling pathwayJ.Biofactors,2020,46(2):283-291.16Hou YN,Wu JC,et al.Luteolin inhibits proliferation and af鄄fects the function of stimulated rat synovial fibroblastsJ.Cell Bi鄄ol Int,2009,33(2):135-147.17Reddy V,Cohen S.Role of Janus Kinase inhibitors inrheumatoid arthritis treatment J.Current Opinion in Rheuma鄄tology,2021,33(3):300-306.18徐宁,王栋,庄俊华,等.敲减Akt表达对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响J.实用医学杂志,2012,28(11):1753-1755.19Hou J,Ouyang Y,Deng H,et al.Whole-genome expressionanalysis and signal pathway screening of synovium-derived mes鄄enchymal stromal cells in rheumatoid arthritis J.Stem Cells Int,2016,2016:1375031.20Zhang T,Li H,Shi J,et al.p53 predominantly regulates IL-6production and suppresses synovial inflammation in fibroblast-like synoviocytes and adjuvant-induced arthritis J.Arthritis ResTher,2016,18(1):271.21Schinnerling K,Aguill佼n JC,Catal佗n D,et al.The role of in鄄terleukin-6 signalling and its therapeutic blockage in skewingthe T cell balance in rheumatoid arthritis J.Clin Exp Immunol,2017,189(1):12-20.22PandolfiF,FranzaL,CarusiV,etal.Interleukin-6inRheumatoid ArthritisJ.Int J Mol Sci,2020,21(15):5238.23Kondo N,Kuroda T,Kobayashi D.Cytokine Networks in thePathogenesis of Rheumatoid Arthritis J.Int J Mol Sci,2021,22(20):10922.24Du H,Zhang X,Zeng Y,et al.A Novel Phytochemical,DIM,Inhibits Proliferation,Migration,Invasion and TNF-琢 InducedInflammatory Cytokine Production of Synovial Fibroblasts FromRheumatoid Arthritis Patients by Targeting MAPK and AKT/mTOR Signal PathwayJ.Front Immunol,2019,10:1620.25CheungTT,McinnesIB.Futuretherapeutictargetsinrheumatoid arthritis?J.Semin Immunopathol,2017,39(4):487-500援26Osta B,Benedetti G,Miossec P.Classical and paradoxical ef鄄fects of TNF-琢 on bone homeostasisJ.Front Immunol,2014,5:48援27Sujitha S,Rasool M.microRNAs and bioactive compoundson TLR/MAPK signaling in rheumatoid arthritis J.ClinicaChimica Acta,2017,473:106-115援收稿日期：2023-04-12；修回日期：2023-04-25编辑/杜帆20