名校必备基于固相载体可逆化固定法SPRI提取质粒DNA的机理研究.doc

天兵下北荒，胡马欲南饮。横戈从百战，直为衔恩甚。握雪海上餐，拂沙陇头寝。何当破月氏，然后方高枕基于固相载体可逆化固定法（SPRI）提取质粒DNA的机理研究生物科学 2003级 余泓漾指导教师 杨婉身 教 授 单 志 助 教（硕士）摘要：本文就质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面的可逆化吸附行为做了相应的试验研究和理论探讨。分别考察了不同PEG浓度梯度对SPRI法和PEG静置沉降法提取质粒DNA的影响。通过比较发现，质粒DNA在纳米磁性粒子表面的吸附受PEG浓度的影响很大；当PEG浓度高于9%时，质粒DNA在粒子表面大量吸附，而对于PEG静置沉降法，此临界浓度为11%，说明质粒DNA在羧基粒子表面的可逆化吸附行为与DNA脱水有关,并受表面羧基的影响。羧基与带负电荷的DNA之间可能通过Na+形成静电桥而相互吸引，使得质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面大量吸附。关键词： SPRI, PEG, 质粒DNA, 固相载体, 静置沉降法 The Mechanism Study of Plasmid DNA abstraction based on SPRI YU Hong-yang Biological Science,Grade2003Directed by YANG Wan-shen(Prof.Ph.D)Abstract: In this article, we studied the mechanism of plasmid DNA reversible adsorption on the surface of carboxyl-group functionalized magnetic nanoparticles. The effect of PEG concentration on both SPRI method and precipitation method was compared and we found that the PEG concentration have a strong influence on the adsorption of plasmid DNA on the magnetic nanoparticles. The critical point of PEG concentration for the precipitation method was 9%, otherwise, the valid concentration for SPRI was 11%. This implyed that the reversible adsorption of plasmid DNA to the surface of magnetic nanoparticle relyed on DNA dehydration and affected by the presence of the carboxy-group surface. A possible explanation was Na+ which induced the static attraction between carboxyl group and negatively charged plasmid DNA. Key words: SPRI, PEG, Plasmid DNA, Solid phase, Precipitation method 细胞及各种生命大分子如核酸、蛋白质和多肽等的分离纯化是生命科学各研究领域必不可少的环节。分离纯化技术的高低对整个生物科学的发展有着举足轻重的作用。细胞裂解后经离心所得到的质粒DNA粗提液，一般来说，不能直接供分析使用，而需要经过一定的纯化步骤，以得到相对较纯的质粒DNA。传统的DNA纯化方法多基于层析和离心沉降，特别是当今众多的商业化DNA提取试剂盒，将该特点发挥到了极至。但传统的方法需要层析柱、有毒试剂（如苯酚）和昂贵的离心机，费力、费时，投入大而且不利于简化操作。利用磁性载体分离纯化质粒DNA近几年来得到各国科研人员的重视。与传统方法相比，磁性载体法具有很大优势：首先，对离心机依赖程度大大降低，甚至可以免去离心；其次，操作简单，有时可集所有操作于一只离心管中完成，中间只涉及到几种试剂的添加；第三，可实现微量分析要求，且得到的质粒DNA可不经洗脱而直接用于PCR1。此外，磁分离法操作缓和，有利于保证DNA完整性。 由于磁性载体的表面性质不同，其分离纯化原理也不一样。其中基于固相载体可逆化固定2（solid phase reversible immobilization，SPRI）的分离纯化方法得到了广泛的研究和应用3-5（如dynal和agencourt公司的DNA磁性粒子，HGP测序任务的三分之一都是借助agencourt的产品完成的）。在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁性微球的表面，该吸附过程是可逆的，在适当的条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。6-8 然而，羧基高分子表面结合DNA的原理至今还不甚清楚，关于这方面研究也鲜见文献报道。本研究通过设置一系列的PEG浓度梯度，以研究质粒DNA在羧基化纳米磁性粒子表面的吸附状况。吸附多少以质粒DNA的产量来表示。作为对照，在不添加该磁性粒子的条件下，研究了不同PEG浓度梯度下静置沉降法910对质粒DNA提取量的影响。并对静置沉降法和SPRI法中PEG的浓度变化对质粒DNA回收的影响做了比较和理论探讨。1.材料与方法1.1试剂与仪器 大肠杆菌JM109（携带pET15b质粒，大小5407bp），LB液体培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0，高温灭菌后补加氨卞青霉素到50ug/ml）；LB固体培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母抽提物，2%琼脂，1%NaCl，pH7.0，高温灭菌后补加氨卞青霉素到50ug/ml，制成斜面），Solution A(pH8.0)：50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA (pH8.0)， 400ug/ml RNase，4保存，Solution B；200mM NaCl，1%SDS；Solution C(pH5.5)；3M kOAc，4保存，结合液（多种浓度PEG和NaCl的混合溶液，NaCl浓度为1.5M，PEG浓度梯度分别为9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%（W/V），25mg/ml羧基磁性纳米粒子分散液（自制，悬浮于pH7.2 TE溶液中），5TBE(Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2H2O 4.65g，加dd H2O至1000ml，高压湿热灭菌，4保存备用)；6loading buffer(0.25%溴酚蓝，0。25%二甲苯氰FF，40%（W/V）蔗糖水溶液)；70%乙醇；pH8.0 TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)；pH7.2 TE (100mM Tris-HCl，10mM EDTA)；Goldview，DNA分子量标准（marker），琼脂糖。 蛋白核酸检测仪（273 BR 02396），DYY-6B稳压稳流电泳仪，DYC型水平电泳槽，Gel DocTMXR凝胶成像系统（BIO-RAD），HM-02B磁分离架，BS210S电子天平，HZQ-F全温震荡培养箱，SW-CJ-2FD洁净工作台，Microlite RF高速冷冻离心机（Thermo electron），TGL-16G台式离心机， YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器，制冰机，碎冰机，Finnpipette移液器（10ul，50ul，200ul，1ml），各种常用玻璃器皿如三角瓶、量筒、容量瓶、烧杯、培养皿、玻璃棒、EP管等分子生物学耗材。1.2菌种活化挑选一环冷冻保存的JM109菌种，接种于含50ug/ml氨卞青霉素的LB固体平板上，37培养过夜。挑取活化以后的单菌落接种于含50ug/ml氨卞青霉素的LB固体斜面上过夜培养，并冷冻保存。1.3细菌增殖从斜面上挑取一环细菌，加入到含50ug/ml的氨卞青霉素的LB液体培养基中，于37200rpm摇床中培养12小时。1.4菌体裂解取1.5ml培养液于一无菌离心管中，室温下10000rpm离心1min，弃上清。将细菌沉淀重悬于100ul预冷的Solution A中，移液枪吹打使菌体分散。再加入200ul新鲜配制的Solution B，枪头缓和搅动2周混匀，随后冰浴3分钟，溶液变黏稠。随后加入150ul预冷的Solution C，枪头缓和搅动数周混匀，直到见白色絮状沉淀，并冰浴3min。接下来10000rpm冷冻离心5分钟。将离心所得的粗提液（共18管。每管约360400ul）转移到一10ml离心管中，混合混匀。1.5静置沉降法最适条件的优化1.5.1静置时间质粒DNA产量的影响在1.5ml EP管中加入400ul粗提液和400ul PEG(16%)/NaCl（1.5M）溶液，4孵育。孵育时间分别为30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h。（每组2管，取平均值），待孵育完成，将EP管置于冷冻离心机中10000rpm（0），离心10min，得到质粒DNA沉淀。小心用枪头吸掉上清液。加入750ul 70%乙醇洗涤1min，小心吸出乙醇，室温放置5min，待乙醇挥发完毕。加入50ulTE溶解质粒DNA。取部分样品分别做电泳和吸光度鉴定。1.5.2 离心时间对质粒DNA产量的影响在1.5ml EP管中加入400ul粗提液和400ul PEG(16%)/NaCl（1.5M）溶液， 4孵育。孵育完成后，10000rpm冷冻离心，离心时间分别为1、5、8、10、12和15min（每组2管，取平均值）。 离心完毕，用枪头小心吸出上清液，再加入70%乙醇750ul，洗涤1min并吸出乙醇。室温放置5min。待乙醇完全挥发后加入50ul TE溶解质粒DNA。取部分样品作琼脂糖凝胶电泳和吸光度检定。1.6 PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响在1.5ml EP管中加入粗提液400ul和400ul PEG/NaCl溶液（NaCl浓度为1.5M，PEG浓度梯度为9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%（W/V）在4冰箱中孵育。孵育完成后10000rpm冷冻离心，得到质粒DNA沉淀。小心用枪头吸出上清液，再加入70%乙醇750ul洗涤1min，小心吸出乙醇，室温放置5min，待乙醇挥发完全。加50ul TE溶解质粒DNA。取部分样品作琼脂糖凝胶电泳和吸光度检验。1.7 PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响在1.5ml EP管中加入粗提液400ul和400ul PEG/NaCl溶液（浓度梯度与静置沉降法相同），以及1/10体积（40ul）的纳米磁性粒子分散液（每组2管，取平均值，以减小试验误差），混匀。在室温下孵育3min后磁分离，吸掉离心管中的上清液。此时，DNA/纳米粒子复合物紧贴在管壁上。用750ul 70% 乙醇清洗1min，磁分离后吸出乙醇溶液。室温下放置5min，待乙醇挥发完毕后在该EP管中加入50ul TE（pH7.2）溶液，在室温下洗脱1min，此时DNA溶解到TE溶液中。磁分离，将DNA溶液转移到另一洁净离心管中，取部分样品分别做电泳和吸光度鉴定。 1.8不添加磁性粒子时PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响 方法同PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响一样，只不过提取过程中不添加自制的羧基纳米磁性粒子。1.9琼脂糖凝胶电泳和吸光度测定取2 ul样品做电泳检测，胶的质量分数为0.7%，缓冲液为0.5TBE。吸光度在蛋白核酸检测仪上测定，分别测定样品在260nm和280nm下的吸光度，并计算A260/A280比值。2结果与分析2.1静置时间对沉降法提取质粒DNA产量的影响沉降时间在很大程度上决定了DNA沉淀情况。研究表明，要使DNA沉淀量达到90以上，一般至少需要20h9。为了尽可能用较短的时间达到较大的DNA沉淀量，我们考察了不同沉降时间下的质粒DNA产量。从图1中可以看出，电泳条带的亮度随孵育时间的增加而变亮，表明质粒DNA的回收率随孵育时间的增加而提高。较长的时间有利于获得较高的DNA沉淀量，但当孵育时间达到6小时，DNA沉淀量已基本接近最大值，孵育时间在6小时到12小时之内，DNA产量变化不大。为节约时间起见，选定6小时为后期研究的静置孵育时间。图1 不同沉降时间对质粒DNA回收量的影响Figure 1 Effect of different precipitation time on recovery of plasmid DNA（从marker起，每2个泳道一个实验因素，2道之间是平行关系，1、2泳道为30min，3、4泳道为1h,5、6泳道为2h,7、8泳道为4h,9、10泳道为6h,11、12泳道为8h,13、14泳道为10h）2.2离心时间对静置沉降法提取质粒DNA产量的影响离心时间对静置沉降法提取质粒DNA产量的影响如图2和表1所示。从中可以看出，离心时间在1min到10min之间，质粒DNA的回收率随离心时间的增加而提高，在离心时间为10min之时，DNA回收率最高。但当离心时间超过10min后回收率反而有所下降，其具体原因有待进一步研究。因此，为提高效率和质粒DNA收率起见，选定10min为后期研究的离心时间。图2 静置沉降法提取质粒DNA不同离心时间回收DNA的电泳图Figure 2 Recovery of DNA under different centrifugal time based on the precipitation method（marker两边为一组平行实验，从1号泳道至6号泳道，离心时间分别为1min 5min 8min 10min 12min 15min）表1 静置沉降法提取质粒DNA不同离心时间回收DNA的分光光度结果Table 1 spectrophotometric analysis of purified DNA under different centrifugal time based on the precipitation method离心时间(min)A260A280A260/A28010.1120.0631.795450.1840.1061.746280.2180.1281.7023100.5250.2941.7872120.2680.1581.6946150.1060.0581.842123 PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响在上述选定的最适条件下（沉降时间6h，离心时间10min），我们考察了PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA的影响，其结果如图3所示。从图4可以看出，在给定的PEG浓度范围内(9%-16%)，质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大，在PEG浓度10%和11% 之间的变化尤其明显，11%PEG下的回收率远远高于10%PEG下的回收率，也就是说质粒DNA沉淀量在11时出现了一个跃迁。其后随着PEG浓度的增高，DNA产量趋于恒定。图3 在不同PEG浓度下由静置沉降法提取质粒DNA电泳图Figure 3 Electrophoresis of purified DNA under different PEG concentrations based on the precipitation method（marker两边为一组平行实验，从1号泳道至8号泳道，PEG浓度分别为9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%（W/V）24 PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响 为了探究SPRI法中质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面可逆化吸附的驱动力，进一考察了PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响。结果如图4和表2所示。从中可以看出，在9%到15%的PEG浓度范围内，质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大，在9%和10%的PEG浓度之间变化尤其明显，10%PEG下的回收率远远高于9%PEG下的回收率，即DNA产量在PEG浓度为10出现了一个跃迁。但PEG浓度超过14后，伴随着PEG浓度的增高，DNA产量反而有所下降。紫外分光光度结果也支持此结论。A260从0.084跃迁到1.184，充分说明了这两个浓度之间存在着DNA收率跃迁。图4 PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA，回收DNA后的电泳图Figure 4 Electrophoresis of purified DNA under different PEG concentrations based on SPRI method（marker两边为一组平行实验，从1号泳道至8号泳道，PEG浓度分别为9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%（W/V）表2 在不同PEG浓度下静置沉降法提取质粒DNA分光光度结果Table 2 spectrophotometric analysis of purified DNA under different PEG concentrations based on SPRI methodPEG浓度（W/V）A260A280A260/A2809%0.0840.0511.660610%1.1840.6681.772511%1.2520.7031.781612%1.4220.8211.732513%1.5000.8551.755614%1.6150.9301.737515%1.6000.9201.740316%1.5870.9161.7293 2.5不添加磁性粒子时PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响图5 PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA，回收DNA后的电泳图Figure 5 Electrophoresis of purified DNA under different PEG concentrations based on SPRI method without introduction of magnetic nanoparticles为了确定SPRI法提取质粒DNA时DNA是否吸附到EP管壁上，特设计不添加磁性粒子时PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响实验。结果如图5所示。从电泳图中可以看出，在给定的PEG浓度范围内，没有条带存在，说明质粒DNA不能吸附到EP管表面而被回收。3讨论31静置沉降法中孵育时间和离心时间的确定关于静置沉降法，9John T.Lis等的研究结果表明，DNA的分子量大小和浓度、PEG浓度、盐离子浓度、以及孵育时间和离心时间对DNA的回收都具有重要影响，其中PEG浓度是决定性因素。其它条件满足时，对于一定分子量的DNA来说，只有当PEG浓度达到某一定值（沉淀临界点）以上，DNA才能显著沉淀。DNA浓度越高、孵育时间和离心时间越长，则DNA沉淀量越大。高离液序列盐如NaCl、MgCl2、盐酸胍等有利于促成DNA沉淀11。如Na+，具有很强的水化能力，在DNA溶液里面，Na+能竞争跟水结合，破坏DNA表面的水化层，中和其电荷，使DNA的胶体学稳定性遭到破坏。考虑到本实验质粒DNA均来自同一菌种并用同样的方法裂解粗提，大小和浓度相同，为了获得较大的DNA回收量，应当首先确定合适的孵育时间和离心时间，最后再确定PEG浓度对该质粒DNA回收的影响（为减小工作量，本文所用Na离子浓度定为一较高浓度值，1.5M12）。由于PEG溶液具有相当的粘稠度，所以与DNA粗提液的充分混合及作用需要一定的时间过程。从实验结果2.1看出，对于3.4 Kb的质粒DNA来说，6小时的孵育时间足以沉淀大部分DNA，延长时间无益于提高DNA回收率。不同的片段大小的DNA，其离心时所受到的离心力不同，较充分的沉淀DNA所需要的时间需要由实验进一步确定。经过长时间的孵育处理，DNA物理性质改变而易于沉降。较强的离心力场有利于DNA在粘稠的PEG溶液里沉淀聚集。实验结果表明，此最佳条件为12000g的离心力场下离心10min。 32 PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响及机理本实验为避免NaCl的干扰，采用较高的NaCl浓度（1.5M12）。PEG浓度对DNA回收的影响如图4所示。在PEG浓度11-16%范围内，质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大,但在PEG浓度1011%之间出现了一个跃迁，PEG浓度为11%下的回收率远远高于10%下的回收率，说明DNA收率在PEG浓度11时出现一个临界值。静止沉降法临界点的出现，是DNA在PEG影响下沉淀状态的反应。在溶液中，DNA的存在状态与PEG的浓度存在一定关系。在低盐和低PEG混合溶液中，DNA分子构象为B型，以无规则卷曲存在；但当PEG浓度达到一定临界值时，DNA分子突然压缩，流体力学性质发生改变，而易于在离心力场下沉淀711。33 PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响及机理PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA和静置沉降法的影响基本一致，也出现一相似的规律。从电泳图4中可以看出，在9%到15%的浓度范围内，SPRI法提取质粒DNA的回收率随PEG浓度的增加而增大，在PEG浓度10%时DNA收率明显出现一个突越，即10%PEG是影响DNA收率的临界点。这说明在SPRI法提取质粒DNA时，PEG对DNA在溶液中存在状态的影响是相同的，即：在低盐和低PEG混合溶液中，DNA分子呈伸展的链状存在，但当条件改变时，DNA会折叠成紧凑的螺旋状结构。11V. V. Vasilevskaya研究表明，当PEG浓度达到某一临界值是，会发生DNA构象非连续的突变，发生凝聚。DNA构象的改变，能使整个DNA水溶液系统的能量处于最低，从而达到稳定状态。6Gerd Kleideiter等研究表明，DNA的电荷量，DNA的弯曲，以及溶液中相关正离子的变动是引起DNA构象变化的主要原因。当DNA上所带的电荷有90%被中和时，这种非连续性的构象变化会突然发生，流体力学性质也因此发生改变，而这种变化与PEG和NaCl的浓度有关13-15。但PEG浓度对两种提取方法的影响存在两个异同点。首先，临界点的出现SPRI法中不再是11%，而是有所降低，为10；其次，在16%的PEG浓度下，DNA的回收量有所降低。DNA的回收量降低的原因很容易得到解释：其一，随着PEG浓度增加，溶液黏性增强，粒子扩散受阻，在较短的时间内，造成吸附不充分；其二，PEG黏性的增强也导致在磁场下粒子的回收率有所下降，而降低DNA产量。关于临界点的改变，我们认为，与体系中纳米磁性粒子的存在有关，磁性粒子的存在是导致PEG临界点降低的主要原因。在高离液序列盐的存在下，DNA分子可特异性吸附到Silica膜(主要成分为SiO2)上，当今众多的商业化DNA提取试剂盒就是基于这一原理设计的。SiO2经活化后可在表面产生大量的羟基，这些功能基团对DNA分子特异性吸附是必不可少的。目前普遍认为，带正电荷的Na+或Mg+等离子在带负电荷的DNA和表面羟基之间充当了“电桥”角色7，使DNA在表面特异吸附而得以分离纯化。高分子表面的羧基与Silica膜羟基表面具有类似性质，在一定条件下都带负电荷。因此，基于SPRI法中PEG临界点变小和DNA只能在羧基磁性粒子表面吸附而不能在EP管吸附这两点出发，我们认为，羧基高分子表面吸附DNA原理同Silica相似：较高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去，胶体学稳定性破坏，构象也随之改变，带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面；带负电荷的磷酸基团通过Na+与羧基形成“电桥”，使得DNA被特异吸附到羧基高分子表面，其示意图如图6所。Cation bridgeNaCl / PEGCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHFe3O4Fe3O4DNACOO-COO-1COO-HCOO-COO-Fe3O4图6 羧基高分子表面与DNA结合示意图Figure 6 schematic diagram for the adsorption of DNA on the carboxylated surface羧基修饰的高分子磁性微球表面对DNA特异吸附是可逆的，当高浓度的PEG和高离液序列盐除去后，DNA构象及其它物理学性质又得以回复，因而使得DNA洗脱成为可能。当然，羧基高分子表面结合DNA的原理还需要其它试验进一步证实，因为DNA在溶液里面不仅要与PEG和盐离子发生作用，还要同羧基高分子表面发生作用，具有相当的复杂性。比如，调整溶液的pH以调节羧基的电离状态，使羧基的带电量发生变化，来研究其吸附DNA能力变化情况。参考文献：1Deggerdal A,Larsen F.Rapid isolution of PCR-ready DNA from blood,bone marrow and cultured cells,based on paramagnetic beadsJ.Biotechniques,1997,22(3):554-5572Hawkins T L, OConner-Morin,Roy1A et al.DNA Purification and isolation using a solid-phaseJ. Nucleic Acid Res,1994,22,4543-4544Part I.3张志超，袁翠等.磁性二氧化硅微球的表面修饰及其在植物基因组核酸纯化中的应用J.分析化学研究报告.2007年1月，35卷，31-36.4李文兵,周蓬蓬,余龙江等.生物相容Fe304磁性纳米颗粒的合成及应用J.现代化工,2006年7月,第26卷增刊5单志,杨婉身，张旭等.正交实验法优化羧基纳米磁性粒子的合成条件J.绵阳师范学院报，2006，25（2）：56-596Gerd Kleideiter, Eckhard Nordmeier.Poly(ethylene glycol)-induced DNA condensation in aqueous/methanolcontaining low-molecular-weight electrolyte solutionsJ.Theoretical considerations.40 (1999) 401340237Victor A. Bloomfield. DNA Condensation by Multivalent CationsJ. Nucleic Acid Science, Submitted September, 19978Jana Krzovaa, Alena Spanovaa, Bohuslav Ritticha,et.al. Magnetic hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres for genomic DNA isolationJ. Journal of Chromatography A, 1064 (2005) 2472539John T.Lis Fractionation of DNA Fragments by Polyethylene Glycol Induced PrecipitationJ. Methods in enzymology,VOL,65,1980,347-35310陈晓东，陶志华，王忠永等. PEG沉淀提取法在提取HBV DNA中的应用J.临床检验杂志,2002 年第4期：21911 V. V. Vasilevskayaa. 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