基于网络药理学的白术-菟丝子药对治疗多囊卵巢综合征的分子机制研究.pdf

中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种在青少年和生育阶段妇女中较为普遍的一种妇科内分泌疾患，其发生率为 5%17%，并且在逐年增加，主要与遗传和环境等因素相关1。PCOS的主要症状有无排卵、雄激素过多、胰岛素抵抗、内分泌失调、糖脂代谢紊乱、月经紊乱、肥胖、痤疮等。目前的西医治疗方法是调整月经周期、抗雄激素、胰岛素增敏剂、促排卵药等。在中医学上，肾虚、脾虚是基金项目：第五批全国中医临床优秀人才研修项目（编号：国中医药人教函 2022 1 号）作者简介：范彩莲（1997.11-），女，江苏宿迁人，硕士研究生，主要从事中医妇科常见病研究通讯作者：徐传花（1977.1-），女，江苏常州人，硕士，主任中医师，硕士生导师，主要从事不孕症、复发性流产及多囊等方向研究基于网络药理学的白术-菟丝子药对治疗多囊卵巢综合征的分子机制研究范彩莲1袁徐传花2渊1.南京中医药大学研究生院袁江苏 南京210023曰2.南京中医药大学附属医院常州市中医医院妇科袁江苏 常州213004冤摘要院目的通过网络药理学方法袁探讨中药白术-菟丝子在治疗多囊卵巢综合征渊PCOS冤中的作用机理袁为开发新药和应用古典方剂提供依据遥方法利用医学药物信息与分析平台渊TCMSP冤的数据库获取白术尧菟丝子的主要化学成份和作用靶标袁利用ADME对白术尧菟丝子进行有效成分的选择曰通过Gencards尧PharmGkb尧DisGeNET尧DRUGBANK等多个不同的数据库获取PCOS作用靶点袁通过String平台对PCOS进行蛋白交互作用的研究袁建立PPI网络结构袁并对可能的蛋白结构进行深入的挖掘遥利用Metascape技术对野药-成分-靶点冶进行研究袁并利用Cytoscape3.7.1软件建立野白术-菟丝子-PCOS-途径冶遥结果筛选出白术-菟丝子药对有效活性成分15个袁作用于198个预测靶点曰筛选出疾病靶点2200个曰韦恩图得到共同靶点136个曰白术-菟丝子药对对PCOS的调节通路起着调节内分泌尧卵巢功能等作用袁其作用途径包括AGE-RAGE信号通路尧IL-17信号通路尧MAPK信号通路等遥结论白术-菟丝子在治疗PCOS中可能通过参与调节AGE-RAGE信号通路尧IL-17信号通路尧MAPK信号通路等作用于AKT1尧JUN尧CASP3尧MAPK8等靶点调节内分泌及卵巢功能袁为白术-菟丝子药对的临床开发利用提供基础遥关键词院白术曰菟丝子曰网络药理学曰多囊卵巢综合征曰靶点预测中图分类号院R285.6文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2024.02.008文章编号院1006-1959渊2024冤02-0047-08Molecular Mechanism of Baizhu-Tusizi Drugs in the Treatment of Polycystic Ovary SyndromeBased on Network PharmacologyFAN Cai-lian1,XU Chuan-hua2(1.Graduate School of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu,China;2.Department of Gynecology,Changzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Hospital of Nanjing Universityof Chinese Medicine,Changzhou 213004,Jiangsu,China)Abstract：Objective To study the mechanism of Chinese medicine Baizhu-Tusizi in the treatment of polycystic ovary syndrome(PCOS)based onnetwork pharmacology,in order to provide a basis for the development of new drugs and the application of classical formulas.Methods The database ofTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Platform(TCMSP)was used to obtain the main chemical components and targets of Baizhu andTusizi,and ADME was used to select the active ingredients of Baizhu and Tusizi;PCOS targets were obtained through Gencards,PharmGkb,DisGeNET,DRUGBANK and other different databases,and protein interaction was studied on PCOS through the String platform,PPI network structurewas established,and possible protein structures were deeply explored.The drug-ingredient-target was studied using Metascape technology,and the Baizhu-Tusizi-PCOS-pathway was established using Cytoscape 3.7.1 software.Rseults A total of 15 active ingredients were screened for Baizhu-Tusizi drugs,which acted on 198 predicted targets;2200 disease targets were screened;Wayne diagram obtained 136 common targets;Baizhu-Tusizidrugs played a regulatory role in regulating endocrine and ovarian function on the regulatory pathway of PCOS,including AGE-RAGE signalingpathway,IL-17 signaling pathway,MAPK signaling pathway,etc.Conclusion In the treatment of PCOS,Baizhu-Tusizi may regulate endocrine andovarian function by participating in the regulation of AGE-RAGE signaling pathway,IL-17 signaling pathway,MAPK signaling pathway,etc.on AKT1,JUN,CASP3,MAPK8 and other targets,providing a basis for the clinical development and utilization of Baizhu-Tusizi drug pairs.Key words：Baizhu;Tusizi;Network pharmacology;Polycystic ovary syndrome;Targets prediction窑中医药信息学窑47中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024其发病原因，治疗以补肾健脾为主要思路，改善脾肾亏虚型 PCOS 患者中医症状体征2。医学信息技术是通过计算机技术和计算机技术建立药物成分、靶点和疾病之间的联系3，分析药物的有效成分与药物靶点之间的联系。整体观念和辨证论治是中医的根本特征，符合中医网络化、系统化的特征。目前，利用网路药物的方法，已经发现了断续-桑寄生4、当归-菟丝子对5、半夏-苍术-香附6对多囊性卵巢综合征的疗效机理进行了系统的探讨。利用数据挖掘技术从中药中抽取中药应用网络药理学的方法对白术-菟丝子进行中药成分的分析，有利于为临床治疗 PCOS 提供参考7。本研究通过对中药化学成分、靶点和途径的研究，从总体上阐明其对 PCOS 的影响机理，为 PCOS 的临床防治奠定基础。1资料与方法1.1 白术-菟丝子化学成分的获取和筛选 从 TCMSP（http:/ 2 种中草药的化学组成成份，并按照现有的研究报告对尚未预见到的有效物质的目标进行研究。在完成了对蛋白靶点的规范化之后，将其功能的蛋白靶点整合到 Uniprot 蛋白数据库（https:/www.u原niprot.org）。1.2 PCOS靶标的选择 以“polycystic ovary syndrome”作为关键字，对 GeneCards（https:/）、DisGeNET（https:/www.disgenet.org）、PharmGKB（https:/www.pharmgkb.org）、DrugB（https:/go.drug原）等数据库中 PCOS 可能的靶标进行深入的研究。在 GeneCards 数据库中，更高的 Score 数值表示这个目标与疾病有很大的关系。从实践来看，如果靶点太多，那么将 PCOS 的潜在靶位设置成Score跃中位的靶标，将 4 个病灶的数据进行整合，将其移出 PCOS 的靶位。1.3 PCOS 靶点 PPI 网络的建立 通过 Venny2.1.0（https:/b.csic.es）将两者靶点取交汇，并绘出韦恩图，以阐明其与 PCOS 靶点间的关系。然后，将交集靶点通过 STRING11.0（https:/string-db.org）的蛋白交互作用（PPI）网络模式8，将生物物种选为“Homosapiens”，最少交互活动阈值设为“highest confidence”（跃0.9），将单独的目标隐藏起来，其它均为缺省设置。1.4 PCOS 靶点功能与通路的富集分析Metascape平台（http:/metascape.org/gp/index.html）具有完整的注释能力，而且每个月都会有关于遗传标注的数据信息9。将白术-菟丝子治疗 PCOS 的目标基因导入Metascape，设定约0.01，通过 Metascape 平台对其主要生理过程和代谢途径进行 GO 分析，包括 GO Bi原ological Processes、GO MolecularFunctions、GO Cel原luar Components 及 KEGG 分析，并将 GO 分析的富集结果导入微生信在线作图平台（http:/www援bioin原formatics援com援cn/）中进行可视化展示。1.5 PCOS 靶点-通路网络图的构建采用 CytoScape3.7.1 建立了“白术-菟丝子”组分-PCOS 靶-路径网络，通过 CytoScape3.7.1 的内部软件对其有效成份和靶位进行了分析，其中包含了连通度、介度和紧密度等因素，通过网络拓扑学的参量来判定药物的核心作用。2结果2.1 白术-菟丝子活性成分靶点的获取 初步提取白术化学成分 55 种、菟丝子化学成分 29 种，经 ADME筛选后共获得白术 5 种、菟丝子 10 种活性成分，包括 a-谷甾醇、山奈酚、苦参碱、槲皮素等，见表 1。白术成分作用靶点 20 个、菟丝子成分作用靶点 198个，合并后删除重复值共得到靶点 198 个。2.2 PCOS 相关靶点的获取 从 Genecards 数据库获得 PCOS 靶点 2783 个,根据经验设定 Score跃中位数的目标靶点为 PCOS 的潜在靶点，如通过 GeneCards所得 PCOS 靶点 Score 最大值为 277.7，最小值为0.19，中位数为 6.97，故设定 Score跃6.97 的靶点为高血脂症的潜在靶点。结合 DisGeNET、PharmGKB、DruBank 数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到 2200 个 PCOS 相关靶点。2.3 白术-菟丝子成分-PCOS 靶点 PPI 网络的构建白术-菟丝子药对成分靶点与疾病靶点取交集，并用Venny2.1.0（https:/b.csic.es/tools/venny/），获得 137 个白术-菟丝子组合物-PCOS 靶点，见图 1。最后将该靶标递交给 STRING11.5，获得了白术-菟丝子靶向 PPI 的结构，见图 2。因为在 PPI 网络中，蛋白质起着互相影响的功能，因此一般将其归入无向图。PPI 的复合网中，局部高浓度的区域叫做Module。Module 是 PPI 的一个潜在的子网，它的子网连线密度高，局部连接的数量很小，所以 Module 被看作是一个有重要的生物群，它包含 2 个含义：一为蛋白质复合体，它是由多种蛋白构成的复合物，从而起到生物的作用；一是功能模组，例如在相同路径上的蛋白之间的交互作用更为紧密。因此，为了更准确48中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024图1白术-菟丝子药对-PCOS靶点韦恩图表1白术-菟丝子药对主要成分OB（%）63.3710.3936.2354.0735.9546.4339.2549.6036.91DL0.300.750.780.220.210.280.760.300.75药物白术菟丝子标记bz1bz2bz3bz4bz5tsz1tsz2tsz3tsz4MOLIDMOL000022MOL000026MOL000033MOL000049MOL000072MOL000098MOL000184MOL000354MOL000358主要活性成分14-乙酰基-12-千里光酰基-2E,8Z,10E-顺式白术三醇豆甾-22E-烯-3茁-醇(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-(2R,5S)-5-丙烷-2-yloctan-2-yl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二水-1H-环戊二烯琢菲酚-3-ol3茁-白术乙酰基8茁-白术乙氧基芋槲皮素NSC63551异鼠李素茁-谷甾醇41.8837.8756.5537.5843.7863.770.240.680.830.710.760.25菟丝子tsz5tsz6tsz7tsz8tsz9tsz10MOL000422MOL000953MOL001558MOL005043MOL005440MOL005944山奈酚CLR芝麻素环磷酸腺苷丁酸脂异氟固醇苦参碱地研究其对 PCOS 的影响机理，需要对其进行深入的研究。在获得 PPI 网络后，利用 CytoScape3.7.1 中的MCODE 插件，通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，从而获得 Module，见图 3。按照数值，将 PPI 网络和 Module 中的 3 个最优的分生物过程对其进行功能描述，见表 2。2.4 靶点功能与通路的富集分析 利用 Metascape 的数据平台，通过微生信（http:/)，对其进行了信号途径的解析，白术-菟丝子药对-PCOS 靶点通路富集结果见表 3。从研究的结果可以看出，多个目标的作用与 PCOS 的发生密切相关。白术-菟丝子药物对机体作用的主要生理作用有外伤反应、无机物质反应、凋亡信号途径、细胞增殖的负向调节作用、细胞对氮的反应，相关靶点调节 PCOS的功能主要富集于蛋白激酶结合、蛋白域特异性结合、蛋白质同二聚化活性、氧化还原酶活性、蛋白激酶活性等，见图 4A；参与的通路主要有糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路以及TNF 信号通路等，见图 4B。2.5 白术-菟丝子成分-PCOS 靶点-通路网络图的构建利 用 CytoScape3.7.1 中 的 NetworkAnalyzer 对PCOS 进行了研究，获得了其主要组成和主要的药理靶标。Cytoscape 网络的结果显示，槲皮素结合度（Degree）为 74，而中度（Betweenness Centrality）为0.6059，而在致密程度（Closeness Centrality）为0.6059；槲皮素（结合度 24，介度 0.0675，紧密度0.4256)、异鼠李素（结合度 2416，介度 0.0239，紧密度 0.3880）、茁-谷甾醇（结合度 13，中度 0.0295，紧密度 0.3980)，参见表 4。AKT1 在网络中的连接度为20，介度为 0.0260，紧密度为 0.5104，预测 AKT1 为白术-菟丝子调治 PCOS 的最主要靶点。JUN、CASP3、MAPK8、TNFIL6、MAPK1、CCND1、TP53、MAPK14 亦为相对重要的靶点，见表 5。49中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024GOhsa05200hsa05161hsa05169hsa04933DescriptionPathways in cancerHepatitis BEpstein-Barr virus infectionAGE-RAGE signaling pathway in diabetic complicationsCout39302827Log10（P）-39.21-37.22-27.22-38.57HitsAKT1,BIRC5,AR,BAX,etc.AKT1,BIRC5,BAX,CCND1,etc.AKT1,BAX,CCND1,BCL2,etc.AKT1,BAX,CCND1,BCL2,etc.表3白术-菟丝子药对-PCOS靶点通路富集结果图2白术-菟丝子药对-PCOS主要靶点PPI网络图3白术-菟丝子药对-PCOS靶点PPI网络中的ModuleGOGO:0009611GO:0010035GO:0097190Descriptionresponse to woundingresponse to inorganic substance0097190:apoptotic signaling pathwayLog10（P）-37.76-37.05-36.8表2白术-菟丝子药对-PCOS靶点PPI网络功能描述50中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024A注：A：GO 富集 BP、CC、MF 三合一；B：KEGG 通路分析图4白术-菟丝子药对-PCOS主要成分潜在靶点的富集分析BGOhsa05418hsa05160hsa05205hsa04151hsa05166hsa04668hsa05162hsa05152hsa04657hsa05164hsa01522hsa05206hsa05142hsa05224hsa04932hsa04010DescriptionFluid shear stress and atherosclerosisHepatitis CProteoglycans in cancerPI3K-Akt signaling pathwayHTLV-I infectionTNF signaling pathwayMeaslesTuberculosisIL-17 signaling pathwayInfluenza AEndocrine resistanceMicroRNAs in cancerChagas disease(American trypanosomiasis)Breast cancerNon-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)MAPK signaling pathwayCout27272625222121212020202019191919Log10（P）-34.37-32.71-28.03-20.47-20.53-26.71-23.65-21.81-26.78-20.82-26.68-16.31-23.93-20.34-19.98-16.58HitsAKT1,BCL2,CAV1,MAPK14,etc.AKT1,BAX,CCND1,CASP3,etc.AKT1,CCND1,CASP3,CAV1,etc.AKT1,CCND1,BCL2,BCL2L1,etc.AKT1,BAX,CCND1,BCL2L1,etc.AKT1,CASP3,CASP8,MAPK14,etc.AKT1,BAX,CCND1,BCL2,etc.AKT1,BAX,BCL2,CASP3,etc.CASP3,CASP8,MAPK14,FOS,etc.AKT1,CASP9,MAPK14,FASN,etc.AKT1,BAX,CCND1,BCL2,etc.CCND1,BCL2,CASP3,CD44,etc.AKT1,CASP8,MAPK14,FASN,etc.AKT1,BAX,CCND1,CDKN1A,etc.AKT1,BAX,CASP3,CASP8,etc.AKT1,CASP3,MAPK14,EGFR,etc.表3渊续冤51中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024注：圆形节点为不同药物的活性成分，矩形为靶点，倒三角为通路图5白术-菟丝子药对-PCOS靶点-通路网络图MOLIDMOL000049MOL000098MOL000354MOL000358MOL000422MOL001558MOL005944名称3茁-白术乙酰基槲皮素异鼠李素茁-谷甾醇山奈酚芝麻素苦参碱连接度37416132468介度0.000 2890.344 4210.023 8570.029 5070.067 5340.004 750.005 417紧密度0.333 333 30.605 911 30.388 012 60.398 058 30.425 605 50.362 831 90.360 703 8表4白术-菟丝子药对主要活性成分网络节点特征参数靶点AKT1JUNCASP3MAPK8TNF连接度2018171717介度0.025 9990.022 8080.021 0430.013 4510.019 816紧密度0.510 3730.497 9760.486 1660.471 2640.493 976靶点IL6MAPK1CCND1TP53MAPK14连接度1616141414介度0.014 6920.014 3210.015 7450.012 6740.010 482紧密度0.460 6740.482 3530.482 3530.482 3530.440 86表5白术-菟丝子药对主要活性成分靶点网络节点特征参数52中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.20243讨论PCOS 是一种比较常见的妇科内分泌系统病症，也是导致女性排卵困难的主要原因。中医治疗PCOS 的效果并不逊于西医，特别是对该病的潜在治疗效果。郭灵娜10经临床实验证明，加用白术-菟丝子对的补肾化痰方与二甲双胍联合应用具有明显的疗效，能明显改善患者的胰岛素耐受性和临床症状，并能明显提高患者的排卵和受孕率，具有较好的安全性。刘畅11研究发现采用白术-菟丝子配伍的补肾健脾方剂可以明显改善 PCOS 的临床表现，使PCOS 不育患者获得优质胚胎数、优质胚胎率、临床妊娠数和临床妊娠率，使 PCOS 不育患者的 BMP-15蛋白含量明显增高。有动物试验结果显示12，白术多糖可显著提高 db/db2 型糖尿病模型大鼠的胰岛素敏感度，提高其糖耐量、减少空腹和血浆中的胰岛素含量，提高其对胰岛素的敏感度。柯江维等13认为，菟丝子可以增加下视丘-垂体促性腺的作用，增加其对促性腺激素分泌的响应能力，促进卵泡的生长，增加 HCG/LH 的数量和作用，同时还可以使其产生类似于雌激素的作用。可见，白术-菟丝子在很大范围内起到了补肾健胃的功效。本研究采用网络药物分析技术，对 PCOS 有效组份进行了初步的筛选。有关研究显示14，槲皮素可能会降低 CYP17A1 的表达，进而降低雄性荷尔蒙的含量。槲皮素能提高 PCOS 大鼠 PCOS 患者的P-AMPK、SIRT-1 蛋白的表达，能使 PCOS 患者出现不同程度的病理改变，同时还能提高其对胰岛素的敏感度，从而提高 PCOS 患者的治疗效果15。在体外培育绵羊次级卵泡时，山萘酚可以维持绵羊卵泡存活，增加绵羊体内的线粒体活力，并能诱导 PI3K 信号途径16，从而促进卵泡的发育，从而改善 PCOS 的生育机能。异鼠李素能提高 GLUT4 在低水平下的代谢途径中的 GLUT4 转位，提高其对血糖的吸收，为 PCOS 患者的胰岛素耐受提供了新的途径17。茁-谷甾醇可以提高 P-AKT、P-PIK3CA 的表达，并使其增强颗粒细胞的增生，并使 Caspase-3 蛋白的表达减少，从而对其凋亡有一定的影响18。因此，白术-菟丝子的作用很大可能通过槲皮素、山柰酚、异鼠李素、茁-谷甾醇等治疗 PCOS。AKT1 的结合性是 20，介度是 0.0260，紧密度是 0.5104，推测 AKT1 是治疗 PCOS 的重要目标。另外，JUN、CASP3、MAPK8、TNFIL6、MAPK1、CCND1、TP53、MAPK14 也是比较有意义的研究对象。由表 5 可知，白术-菟丝子对 PCOS 的作用主要是AKT1，JUN 也是其作用的一个重要靶标。高雄激素是 PCOS 患者的一种典型临床表现，高雄激素PCOS 患者中 AKT1 基因的表达较高，且与 AKT1含量有显著关系19，能明显地降低 AKT1 的磷酸化20，并能有效地降低高雄激素的分泌，进而降低卵巢状况及高雄激素的症状。中国汉族患者胰腺和周围组织 AKT1 的缺失，会造成高葡萄糖血症和高血糖21，22，AKT1 的半衰期可以使 AKT2 缺乏的小鼠产生轻微的胰岛素抵抗，从而发展成 2 型糖尿病。白术-菟丝子是脾肾亏虚型 PCOS 患者的主要 药 物，包 括 AGE-RAGE（hsa04933）、IL-17（hsa04657）和 TNF（hsa04668）。有研究表明23，通过抑制 AGE-RAGE 的讯息途径，能有效地抑制葡萄糖饲用者的葡萄糖耐受；缺乏 RAGE 的老鼠，其胰岛素敏感度及血清脂联素含量均高于野生组。在2型糖尿病患者的脂肪中，AGE-RAGE 轴向的表达也有一定的作用。目前，已有学者提出24，25，IL-17是一种重要的促炎性物质，它可以提高 T 淋巴细胞的活力，并促进多种促进炎性介质的分泌，如IL-1、IL-6、TNF-a、NOS-2、Metal PCOS（TNF-a）、NOS-2、MMP-2、B 等多种促炎因子的作用，从而减轻炎症的发生。因此，认为白术-菟丝子对缓解炎症的作用，可以通过阻断 AGE-RAGE 的通路途径，促进 IL-17 和 TNF 的通路途径，进而改善胰岛素的耐受性。本研究显示，白术-菟丝子可以通过调节多个靶点来调节 PCOS 中的多种生理机制和信号通路，但相同的药物可以调节多个靶点，显示出多途径多靶点的协同效应。因此，可以利用白术-菟丝子作为药物对 PCOS 的有效控制，从而为进一步探索其可能和机理奠定基础。由于中药网的限制，以及中药中的有效成份在体内产生了一种复合的化学作用，本研究的缺点在于没有深入分析有效成分在人体中的作用机制。本研究对白术-菟丝子药对的潜在治疗作用进行了浅显的讨论，为临床运用白术-菟丝子药对治疗 PCOS 提供了初步的证据，仍需进一步的相关实验研究进行验证，进而明确白术-菟丝子药对主要调控的蛋白靶点。参考文献院1Neves LPP,Marcondes RR,Maffazioli GN,et al.Nutritional53中医药信息学第 37 卷第 2 期医学信息Vol.37 No.22024 年 1 月Journal of Medical InformationJan.2024and dietary aspects in polycystic ovary syndrome:insights intothe biology of nutritional interventions J.Gynecol Endocrinol,2020,36(12):1047-1050.2曹梦娣.补肾健脾法改善PCOS慢性低度炎症状态的疗效及其与肥胖相关性的研究D.南京:南京中医药大学,2021.3Hopkins AL.Network pharmacology:The next paradigm indrug discoveryJ.Nature Chemical 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