黄酮化合物对巨噬细胞中白细胞介素介导的TLR4_MyD88_NF-κB信号转导通路的调节作用.pdf

黄酮化合物对巨噬细胞中白细胞介素介导的/信号转导通路的调节作用冯逸佳李庆芳董壮壮张圆琳乔元彪李青山(山西中医药大学中药与食品工程学院基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室晋中)摘 要 目的 利用巨噬细胞评价黄酮类化合物(华良姜素和木犀草素)对促炎、抗炎白细胞介素()因子表达以及 样受体 /髓样分化因子/核因子(/)信号转导的调节作用 方法采用脂多糖()诱导小鼠单核巨噬细胞.黄酮设低、中、高浓度组分别与 共处理建立细胞炎症和抗炎模型 利用酶联免疫吸附法测定培养液中一氧化氮()和 表达 沉默 用反转录聚合酶链反应法检测/沉默 检测/变化 蛋白免疫印迹法检测 样受体()、磷酸化()、髓样分化因子()、磷酸化()蛋白 结果华良姜素、木犀草素抑制 半数抑制浓度()分别为.和.诱导可降低抗炎因子、表达并且提高促炎因子、和 表达(.)与 组比较黄酮分别处理可剂量依赖地中和促炎因子上调和抗炎因子的下调作用(.或.)沉默 上调/在空白对照组、诱导和 黄酮组细胞中表达沉默 下调/表达(.或.)与空白对照组比较 诱导激活细胞表达、蛋白而经黄酮处理后蛋白表达均被抑制(.或.)结论 种黄酮类化合物均具有抗炎活性可中和巨噬细胞的促炎、抗炎 因子 反向调节/正向调节/巨噬细胞的双重 中和作用通过抑制/信号通路来实现关键词 黄酮化合物华良姜素木犀草素白细胞介素核因子中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()/()()/()/.().().()/()/.().(.).(.).(.).(.)./.医药导报 年 月第 卷第 期 脂多糖()是革兰阴性菌细菌壁的主要成分诱导巨噬细胞发生炎症反应 样受体()是 在巨噬细胞传导炎性信号的膜转运受体 通过与 结合、激活核因子()信号通路导致炎症递质合成和释放启动并放大炎症反应 是一种靶向炎性基因的核转录调节因子正常情况下上游信号 抑制使得 处于非活性状态 当细胞受到 刺激时 通过 和 个亚基单元复合物的激活作用促使磷酸化修饰 活力将不再受到抑制 此时 与 分离导致 活化并迁移至细胞核诱导炎症递质的活化和表达白细胞介素()因子在免疫细胞(如巨噬细胞)中通过调节炎症反应和参与免疫响应有效杀死细菌或去除肿瘤然而过量分泌会诱发类风湿关节炎、癌症和炎症性肠病等系统性疾病 有促炎和抗炎 种类型其中和疗法被认为是预防系统性疾病发生或干预这类疾病的重要策略 因子的成员众多功能重叠形成复杂的调节关系 天然黄酮属于潜在的抗炎活性化合物已有众多的研究报道 华良姜素是从丁香、黄芪及甘草等中药中提取的一种黄酮化合物与木犀草素结构相似 华良姜素可诱导人卵巢癌细胞、肝癌细胞凋亡抑制巨噬细胞的交替活化 木犀草素通过体内外抑制信号通路发挥抗炎活性但是该化合物调节 因子的作用研究较少 笔者以 诱导.巨噬细胞建立炎症模型研究华良姜素和木犀草素调节 因子、表达互调以及对 信号转导的抑制作用 材料与方法.仪器与设备 型二氧化碳()培养箱(新加坡 公司)、型化学发光荧光酶标仪(美国 公司)、.型高速冷冻离心机(上海 公司)、型收稿日期 修回日期 基金项 目 山 西 省 医 学 科 技 创 新 团 队 领 军 项 目()山西中医药大学博士科研启动基金资助项目()作者简介 冯逸佳()女山西吕梁人硕士研究方向:中药/天然药物化学:通信作者 乔元彪()男山西吕梁人教授博士研究 方 向:中 药/天 然 药 物 化 学:通信作者 李青山()男湖南衡阳人教授博士研究方向:中药/天然药物化学实时荧光定量聚合酶链式反应仪(美国 公司)、型 孔梯度 仪、型半干转膜仪(美国 公司).药物与试剂 华良姜素(上海麦克林生化科技股份有限公司批号:含量)木犀草素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司批号:含量)小鼠单核巨噬细胞(.中国科学院上海细胞库)胎牛血清()赛澳美细胞技术(北京)有限公司批号:.二甲亚砜()(索莱宝生物科技有限公司批号:)达尔伯克必需基本培养基()高糖培养基粉末(公司批号:)噻唑蓝()、(索莱宝生物科技有限公司批号分别为、)一氧化氮()试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司批号:)、酶联免疫吸附测定()试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司批号分 别 为、)、髓样分化因子()兔一抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司批号分别为、)、兔一抗(公司 批号分别为、)、兔一抗(沈阳万类生物科技有限公司批号分别为、)兔一抗(武汉赛维尔生物科技有限公司批号:)辣根过氧化物酶()羊抗兔(武汉博士德生物工程有限公司批号:)、宝日医生物技术(北京)有限公司批号分别为、)、(通 用 生 物 安 徽 股 份 有 限 生 物 批 号:)转染试剂(上海碧云天生物技术有限公司批号:.).药物与 配制 华良姜素、木犀草素储备液用 配制浓度.置于 保存使用液 含量.溶于无菌磷酸盐缓冲液()中用孔径.微孔滤膜滤过配制成浓度 母液分装保存使用前用培养基稀释为相应浓度.细胞培养.细胞采用 高糖培养基(其中含 和 双抗)在 、细胞培养箱中培养隔天换液以 比例传代培养.法检测细胞活力取生长状态良好、且达到 融合程度的.细胞用含 和 双抗的 高糖培养基吹散制备单细胞悬液调整密度为每孔 接种于 孔板中培养 分别设置.、.、.、华良姜素组以及.、.、木犀草素组另设空白对照组每组 个复孔 待细胞充分贴壁后弃掉孔内液体空白对照组加入培养液 给药组加入含相应药物浓度的培养液继续培养 弃掉孔内液体每孔加入 溶液()和 培养基 继续培养 用酶标仪于波长 检测各孔吸光度()值以空白对照组为参照计算各组细胞的相对存活率 相对存活率()(实验组 值/空白对照组 值).法测定 和 细胞以每孔 个接种 孔板 实验分 组:空白对照组、模型对照组和华良姜素或木犀草素低、中、高浓度组给药 后加入含相应药物浓度的 继续培养 收集细胞上清液参照 试剂盒说明书检测各组细胞上清液中 和、.细胞 转染和 基因沉默 分别用 和 的 组 转染细胞序列见表 转染实验前以每孔 个细胞接种在 孔板中每孔加入培养液 铺板 分别取()和 各 用 培养基 稀释室温静置 然后再用培养基 稀释轻轻混匀室温再静置 将其加入 孔板中十字混匀加入 培养基.将 孔板放入孵育箱中继续培养 提取细胞总 设计引物序列(表)、扩增 反转录聚合酶链反应()法检测各组、对细胞的转染效率沉默 基因选择转染率最高的 序列 实验分组为:阴性对照()组、组、华良姜素(.)组、木犀草素()组、组、组、华良姜素组、木犀草素组 每组 个复孔转染 提取各组的总 检测、类似地沉默 检测、.蛋白免疫印迹()法测定细胞中 信号通路相关蛋白表达将细胞以每孔 个接种在 孔板培养回收培养物采用 裂解表 和 序列.名称序列():阴性对照:.表 引物序列.引物名称序列()引物大小/鼠 鼠 鼠 鼠 鼠 鼠 鼠 鼠 液提取总蛋白二喹啉甲酸()总蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳()分离蛋白再将目的条带转移至 膜上用 脱脂牛奶封闭 洗膜一抗 孵育过夜次日 洗膜加二抗(羊抗兔)孵育 增强化学发光法显色并在显影仪上显影曝光.统计学方法 采用 版软件进行图形绘制两组间数据比较采用 检验多组间比较应用单因素方差分析 以.为差异有统计学意义 结果.黄酮化合物对细胞存活率调节作用 与空白对照组比较华良姜素在 浓度范围内对.细胞存活率无明显影响 华良姜素组细胞存活率显著降低(.)见图 华良姜素的浓度求对数对其抑制.诱导的变化结果采用 数学统计回归分析后得到半数抑制浓度()为.因此实验设定华良姜素低、中、高浓医药导报 年 月第 卷第 期度分别为.、.、.木犀草素在 浓度范围内对.细胞存活率无显著影响当浓度在 以上时细胞存活率显著降低(.)见图 木犀草素抑制 的 为.实验中设定.、为木犀草素低、中、高浓度组 是评价巨噬细胞炎症程度的一个重要指标通过比较 抑制的 表明华良姜素和木犀草素具有抗炎活性并且华良姜素活力更高 与空白对照组比较.图 华良姜素对.细胞存活率和 诱导 变化的影响().().华良姜素、木犀草素对 诱导.细胞 调节作用 测定 的方法评价结果见表 该法线性范围大检测限和定量限低统计相关系数和加标回收率高且相对偏差小 依据该法测定的 结果见图 与空白对照组比较.诱导细胞培养的上清液中促炎因子、分泌量均显著增加(.)而抗炎因子、分泌量均显著减少(.)华良姜素与木犀草素对.巨噬细胞中促炎因子的分泌均有显著抑制作用(.或.)同时显著促进抗炎因子分泌并呈较好的剂量依赖性 与空白对照组比较.、.图 木犀草素对.细胞存活率和 诱导 变化的影响().().转染细胞及其对 定向调节 和 各 组 转染.细胞 均有沉默相应基因转录的作用(图)其中 和 转染细胞后对、和 的沉默效率最大 采用 和 作为转染试剂对/与/调节作用见图 和图 与 组比较沉默 显著上调 和 分别在空白对照组、组、华良姜素组或 木犀草素组细胞中表达(.)反之沉默 显著下调 和 在空白对照组、组、华良姜素组或 木犀草素组细胞中表达(.或.)结果表明 负向调节 和 表达而 正向调节、.华良姜素、木犀草素对 通路相关信号蛋白调节作用 刺激巨噬细胞显著提高 和表 的测定方法评价.参数线性范围检测限定量限()截距斜率相关系数加入量检出量()相对偏差回收量.空白对照组.模型对照组.华良姜素低浓度组.华良姜素中浓度组.华良姜素高浓度组.木犀草素低浓度组.木犀草素中浓度组.木犀草素高浓度组 与空白对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较 .图 华良姜素和木犀草素对.细胞中 的影响().()表达量同时 和 磷酸化翻译后修饰水平也显著提高(.)华良姜素和木犀草素均能够剂量依赖地抑制 和 表达降低 和 见图、结果表明黄酮化合物通过/信号通路发挥调节 表达的作用 与空白对照组比较.、.图 与 转染细胞中相应 表达 .()组.()组.()华良姜 素(.)组.()木 犀 草 素()组.组.组.华良姜素(.)组.木犀草素()组 与()组比较.、.与()组比较 .、.与()华良姜素(.)组比较.、.与 ()木 犀 草 素()组比较.、.图 华良姜素、木犀草素对、表达的影响.(.).().(.).().(.).().医药导报 年 月第 卷第 期 .()组.()组.()华良姜素(.)组.()木犀草素()组.组.组.华良姜素(.)组.木 犀 草 素()组 与()组比较.、.与()组比较.、.与()华良姜素(.)组比较.、.与()木犀草素()组比较.、.图 华良姜素、木犀草素对、的表达影响.(.).().(.).().(.).().讨论巨噬细胞分泌 及 彼此的相互调控机制目前还不完全清楚 本研究结果表明用 刺激.细胞时、蛋白表达上升且促炎因子表达增加抗炎因子减少 经华良姜素、木犀草素处理细胞后、蛋白表达量下降同时促炎因子表达减少抗炎因子增加表明 种黄酮化合物调控 与/信号通路有关图 结果显示沉默 可下调、表达沉默 则上调、表达综上所述在 诱导的.巨噬细胞炎性模型中华良姜素和木犀草素通过抑制 和 表达、阻断 和 磷酸化来抑制促炎 因子并促进抗炎 表达 与炎症细胞比较黄酮化合物通过中和 表达抑制巨噬细胞炎症反应 白细胞介素因子的中和作用是通过 信号通路进行调控 表明华良姜素、木犀草素抗 诱导的巨噬细胞炎症是通过抑制促炎因子上调、同时抑制抗炎因子下调来发挥作用 因此华良姜素和木犀草素对于炎性巨噬细胞中 表达具有中和作用这种调节使得 分泌定向恢复至接近它们在空白细胞中的水平 不同 之间的负向和正向调节表明这类细胞因子存在定向的调控关系对于揭示巨噬细胞抗炎、免疫调节及发挥其他生物功能具有重要的指导意义 .空白对照组.模型对照组.华良姜素.组.华良姜素.组.华良姜素.组.华良姜素 组.华良姜素 组.华良姜素 组与空白对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 华良姜素对.巨噬细胞中 信号通路相关蛋白的调节.空白对照组.模型对照组.木犀草素.组.木犀草素.组.木犀草素 组.木犀草素 组.木犀草素 组.木犀草素 组 与空白对照组比较.与模型对照组比较.图 木犀草素对.巨噬细胞中 信号通路相关蛋白的调节.参考文献 .:.():./.():.:.():.:.():.:./.():.():./.():.姚红侯宇芯任晋宏等.基于/信号通路探讨华良姜素抗肝癌细胞 凋亡的作用机制.中国实验方剂学杂志():.():.().():.():.张雯宋俊科朱晓瑜等.表没食子儿茶素对/通路减轻脂多糖诱导 细胞炎症反应的影响.医药导报():.():.医药导报 年 月第 卷第 期