积雪草苷在高糖诱导人角膜上皮细胞损伤修复中的作用及机制研究.pdf

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：支晓雯，李兵 积雪草苷在高糖诱导人角膜上皮细胞损伤修复中的作用及机制研究 眼科新进展，（）：【实验研究】积雪草苷在高糖诱导人角膜上皮细胞损伤修复中的作用及机制研究支晓雯李兵欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者简介：支晓雯（：），女，年 月出生，辽宁沈阳人，在读硕士研究生。研究方向：眼表疾病。：通 信 作 者：李 兵（：），女，辽宁锦州人，博士，硕士研究生导师，主任医师，锦州医科大学附属第一医院眼科主任。研究方向：眼表疾病及角膜移植、眼视光学及屈光不正。：收稿日期：修回日期：本文编辑：臧赫作者单位：辽宁省锦州市，锦州医科大学（支晓雯）；辽宁省锦州市，锦州医科大学附属第一医院（李兵）【摘要】目的探究积雪草苷（）对高糖诱导的人角膜上皮细胞（）损伤修复的作用及机制。方法体外培养 ；法检测不同浓度的葡萄糖及 对 细胞增殖活性的影响，筛选出 最佳高糖诱导浓度（）及 干预浓度（）进行后续实验；实验分组：空白对照组（组；仅加入培养基 ）、高糖组（组；添加 葡萄糖）、组（添加 的 ）、高糖 组（组；添加 葡萄糖及 的 ）。法检测各组细胞培养 、及 增殖活性；细胞划痕实验检测各组细胞培养 迁移能力；染色实验检测各组细胞凋亡率；检测各组细胞中 、的表达；检测各组细胞中 、蛋白表达。结果与 组比较，组细胞培养 、及 时增殖活性均明显降低，差异均有统计学意义（均为 ）；与 组比较，组细胞培养 、及 时增殖活性均升高，差异均有统计学意义（均为 ）。与 组比较，组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（）；与 组比较，组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（）。与 组比较，组细胞迁移能力明显被抑制，差异有统计学意义（）；与 组比较，组细胞迁移能力明显增强，差异有统计学意义（）。与 组比较，组细胞中 、及 表达均明显降低，差异均有统计学意义（均为 ）；与 组比较，组细胞中 、及 表达均明显升高，差异均有统计学意义（均为 ）。与 组比较，组细胞中 、及 蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义（均为 ）；与 组比较，组细胞中 、及 蛋白表达均明显升高，差异均有统计学意义（均为 ）。结论 可以缓解因高糖导致的 损伤，促进细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡，这种作用可能是通过激活 信号通路实现的。【关键词】糖尿病角膜病变；积雪草苷；通路；损伤修复【中图分类号】糖尿病角膜病变（）是糖尿病引起的最常见的眼部并发症之一 ，长期高血糖会引起患者眼部局部微循环障碍，对角膜各层组织的结构、代谢及功能均有影响。的临床表现复杂多样，轻症者可仅有干眼表现 ，严重者则会出现角膜的敏感性丧失 、角膜上皮伤口愈合困难 、视力下降甚至失明 。由于角膜上皮是眼表的最外层，容易受到磨损和创伤，所以需要不断地修复，任何影响角膜上皮细胞增殖、迁移等的因素均会影响角膜上皮的修复。积雪草苷（）是中草药积雪草中最重要的生物活性成分之一，药理研究证实，在抗炎 、抗氧化 ，以及促进伤口愈合 等方面具有积极作用。可以促进糖尿病大鼠皮肤的愈合，而且该作用与 连环蛋白（）通路相关 。因此，本实验通过高糖建立 模型，观察 对高糖诱导的角膜上皮细胞损伤是否有保护作用，并探究是否与 通路有关，以期为临床进一步研究提供理论基础。材料与方法 主要材料及试剂人角膜上皮细胞（）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号 。主要试剂包括：培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、（纯度 ）购自索莱宝生物有限公司；试剂盒购自美国 公司；染色试剂盒购自碧云天生物有限公司；蛋白、细胞周期素 （）蛋白、抗体购自美国 公司；、上下游引物购自上海生工生物工程股份有限公司；荧光定量 检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司。实验方法 培养 采用 完全培养基（基础培养基 体积分数 胎牛血清 青链霉 ：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 素）在 、含体积分数 的 培养箱中孵育。高糖浓度筛选取对数生长期的 消化重悬，调整细胞密度为 个，细胞接种于个 孔板中，每孔 ，将 孔板置于 、含体积分数 的 细胞培养箱中，待 细胞状态稳定后，弃去培养液，随机分为 组，分别加入 完全培养基以及含 不 同 浓 度 的 葡 萄 糖（、）的 完全培养基，每组设 个复孔，继续放入培养箱中孵育，分别培养 、及 后在每孔中加入 的 试剂，孵育 以后，采用酶标仪检测细胞在 波长处的吸光度（）值。由于 葡萄糖下 存活率过低，不利于后续实验进行，最终选取 葡萄糖作为细胞模型诱导浓度。浓度筛选铺板方法同 ，细胞状态稳定后，弃去培养液，随机分为 组，分别加入 完全培养基以及含不同浓度的 （、）的 完全培养基，每组设 个复孔，继续放入培养箱中分别培养 、及 后，在每孔中加入 的 试剂，孵育 后，采用酶标仪检测细胞在 波长处的 值。由于 的 对 增殖没有抑制作用，的 对 增殖有促进作用，的 对于 的增殖有抑制作用，故选取 的 作为后续药物干预治疗浓度。实验分组根据上述两项实验结果，采用选定的葡萄糖浓度及 浓度，将实验分组设定为空白对照组（组；仅加入培养基 ）、高糖组（组；添加 葡萄糖）、组（添加 的 ）和高糖 组（组；添加 葡萄糖及 的 ）。细胞增殖实验铺板方式同 ，细胞状态稳定后，弃去培养液，将细胞按照实验分组进行处理，每组设 个复孔，放入培养箱中分别培养 、后，在每孔中加入 的 试剂，孵育 后，采用酶标仪检测细胞在 波长处的 值。染色实验检测细胞凋亡在 孔培养板内放置圆形细胞爬片，取对数生长期的 消化重悬后以 个 的密度接种于孔板中，每孔 ，置于、含体积分数 的 细胞培养箱中 后，弃去培养液，将细胞按照实验分组进行处理，继续培养 ，洗涤后，采用 多聚甲醛固定细胞 ，弃去多聚甲醛，清洗，加入含有 的 的 室温孵育 ，用 清洗次，按照说明书配制 检测液，每孔加 ，避光孵育 ，洗涤 次，染色 ，洗涤后采用抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察各组细胞。细胞迁移实验取对数生长期的 消化重悬后以 个 细胞密度接种于 孔板中，每孔 ，置于 、含体积分数 的 细胞培养箱中培养 后，弃去培养液，将细胞按照实验分组进行处理，每组设 个复孔，放入培养箱中继续培养 ，采用划痕仪垂直于 孔板纵向划痕，弃去培养基，清洗，加入无血清 ，在 观察划痕宽度，以及在 后观察愈合情况并拍照记录，使用 软件估算细胞迁移距离。实验细胞复苏后，采用 完全培养基重悬，置于、含体积分数 的 细胞培养箱中，细胞密度达到 以上时传代至 个 培养皿中，待细胞密度在 左右时，弃去培养液，将细胞按照实验分组进行处理，后加入细胞裂解液，移入离心管中，冰上静置 后，放入 预冷离心机中，离心 ，吸取上清液至新管中，采用 蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，加入不同体积的 使每组蛋白浓度相同，高温加热 使蛋白变性，配制 凝胶，每孔加入 变性蛋白样品，电泳至 到达分离胶底部时，采用转移电泳装置将蛋白转移至 膜上，用封闭液（含 脱脂奶粉的 ）室温摇床上封闭，一抗 孵育过夜，洗膜 次，二抗孵育，洗膜 次，滴加显色液置于凝胶成像系统中显影，以 为内参，采用 软件计算灰度值并分析每组中 、的蛋白表达量。实验细胞复苏后培养至密度 时，传代至 个 培养皿中，待细胞密度至 以上，弃去培养液，将细胞按照实验分组进行处理，继续培养 ，法提取细胞总 ，采用逆转录试剂盒将 逆转录为 ，使用特异性引物进行 ，反应体系为上下游引物各 、模板 、（共 ），每组设置 个复孔，放入 仪中扩增，检测不同样本中 、的表达，以 为内参，采用 方法计算各基因相对表达量。统计学处理采用 软件进行统计学分析，计量资料用均数 标准差（珋 ）表示，两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：。眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：结果 各组细胞增殖实验结果 法检测结果显示，培养 、及 ，与 组比较，组细胞增殖活性均明显降低，差异均有统计学意义（均为 ）；与 组比较，组细胞增殖活性均升高，差异均有统计学意义（均为 ）（表 ）。逆转了 造成的 损伤。表 法检测各组 增殖活性组别 波长处 值 组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，。各组细胞凋亡实验结果 染色结果显示，组、组、组及 组细胞 阳性细胞率分别为 、和 。与 组比较，组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（，）；与 组比较，组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（，）（图 ）。逆转了 导致的 凋亡。图 染色检测各组 凋亡 各组细胞迁移实验结果划痕实验结果显示，组、组、组及 组细胞培养 的平均迁移率分别为 、。与 组比较，组细胞迁移能力明显被抑制，差异有统计学意义（，）；与 组比较，组细胞迁移能力明显增强，差异有统计学意义（，）（图 ）。高糖抑制了 的迁移能力，逆转了高糖导致的 迁移能力受损。图 划痕实验检测各组 迁移能力 各组 、及 检测结果 检测结果显示，组、组、组及 组细胞中，的相对表达量分别为 、，的相对表达量分别为 、，的相对表达量分别为 、。与 组比较，组细胞中 、及 表达均明显降低，差异均有统计学意义（、，均为 ）；与 组比较，组细胞中 、及 表达均明显升高，差异均有统计学意义（、，均为 ）。促进了 、及 的表达。各组 实验结果 检测结果显示，组、组、组及 组细胞中，相对蛋白表达量分别为 、，相对蛋白表达量分别为 、，相对蛋白表达量分别为 、。与 组比较，组细胞中 、及 蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义（、，均为 ）；与 组比较，组细胞中 、及 蛋白表达均明显升高，差异均有统计学意义（、，均为 ）（图）。促进了 、及 蛋白的 ：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 表达。图 检测各组 、及 蛋白表达 讨论糖尿病是一种全身性、代谢性内分泌疾病，严重时可引起全身多个系统的并发症，晚期糖尿病患者眼部往往受累 。是糖尿病在眼部的主要并发症之一，但其发病机制尚不明了，可能与高糖引起的炎症、糖化产物沉积及氧化应激反应等相关 。是中草药积雪草中最重要的活性成分之一，在抗炎、抗氧化、促进损伤愈合等方面具有积极作用。基因最初在小鼠体内被发现，名为 基因 ，后来在果蝇体内发现一种同源物，基因被更名为 基因 ，进一步研究发现，通过控制关键的效应物 发挥一系列典型的病理生理反应，形成了经典的 信号通路 。研究表明，信号通路广泛存在于生物体内且是较为稳定保守的通路，参与调节细胞的分化、增殖、凋亡及迁移等过程 ，信号通路在角膜发育过程中发挥了至关重要的作用 ，其下游基因 被发现在正常的细胞中具有促进增殖的作用，如可促进角膜缘上皮细胞的增殖，而高糖可抑制 蛋白的表达，这可能与角膜上皮细胞增殖能力下降及凋亡相关 。因此，本实验使用高糖诱导 损伤模型，探究 对于高糖诱导 损伤的保护作用及其机制。的增殖、迁移及凋亡是其损伤修复的基础。在本实验中，体外高糖诱导的 损伤模型细胞增殖与迁移能力均明显受损，本实验借此模拟了 的病理生理学过程，而使用 干预治疗细胞损伤模型后，造成的细胞增殖损伤情况得到极大缓解，这提示 具备促角膜损伤修复的作用；同时，造成 严重的凋亡反应，在使用 干预治疗后，导致的细胞凋亡同样得到极大缓解。在糖尿病角膜损伤中，角膜上皮基底膜的组成发生变化、会发生糖化产物的沉积，导致角膜神经末梢的损伤和高血糖状态下的氧化应激反应，从而导致角膜损伤 。角膜的透明性和稳态主要由上皮细胞维持，在受伤或感染的情况下，快速的上皮表面重建和愈合必不可少，但糖尿病会增加对自发性角膜损伤的易感性，包括上皮糜烂和溃疡。在糖尿病患者中，角膜上皮的任何损伤或创伤均需要更长的时间愈合。在本实验中，能够促 增殖与迁移，同时可以明显抑制 导致的凋亡反应，这提示 对于糖尿病角膜损伤修复具有积极作用。为探究 促进 损伤修复的作用机制，本实验又对 信号通路基因进行检测，结果发现，可以明显抑制 通路相关蛋白表达，而在 干预治疗后，这种强烈阻断 信号通路激活的作用明显被逆转，这提示 可以通过促进 信号通路转导从而促进细胞的增殖和迁移作用，减轻细胞的凋亡反应。结论 对于 具有保护作用，其通过促进细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡，以及激活 信号通路转导从而发挥角膜损伤修复的作用。参考文献 谭思文，梁荣斌，邵毅 糖尿病性角膜病变的研究进展 眼科学报，（）：，（）：，：，（）：张谋鑫 糖尿病大鼠角膜病变相关神经营养因子的变化 福州：福建医科大学，：，（）：，：，：，（）：，（）：金钦阳，朱勤，李雪灵，叶利方，屈百鸣 积雪草苷对糖尿病心肌病大鼠 的表达及氧化应激的影响 心电与循环，（）：，（）：，胡蓉，姜润松 积雪草苷对烫伤大鼠创面愈合及瘢痕形成中热休克蛋白 表达的影响 浙江医学，（）：，（）：，眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：，（）：，：谢连凤，刘琳琳，蒋贻平，谭述香 糖尿病患者空腹血糖与血尿酸对糖尿病视网膜病变的交互作用分析 眼科新进展，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：陈梨萍，李科，郑振优，宋绪华，李雷，赵楠楠 蛋白对人角膜上皮细胞 蛋白表达的影响及意义 实用医学杂志，（）：，（）：赵楠楠，陈梨萍，修皓，郑振优，唐平，籍雪颖 高糖对人角膜上皮细胞创伤修复中 蛋白表达的影响 国际眼科杂志，（）：，（）：，：，（）：，：，：【】（）（）（），（）（）（）（），（），（），（），；，；，（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），【】；：眼 科新进展 年 月第 卷第 期