级研究生双向与光合实验.doc

2023级研究生《植物科学实验技术》
双向电泳技术（524 lab）
一、实验目的：
了解蛋白质组学研究中的基本实验设计思绪，掌握蛋白质组双向电泳实验流程及相关软件分析。
二、材料与试剂
材料：①叶片（墨兰、石斛）②花芽（春石斛、蝴蝶兰）③蝴蝶兰花瓣（白色、红色）④蝴蝶兰花苞
仪器：聚焦仪，天平，电子秤，合用于2ml、10ml、50ml离心管的高速离心机，PH计，磁力搅拌器，低温冰箱，真空泵，紫外分光光度计，水浴锅等
试剂：三氯乙酸（TCA），丙酮，β-巯基乙醇，Tris-base，牛血清蛋白，考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，尿素（Urea），硫脲（Thiourea）,CHAPS，DTT，碘乙酰胺IAA，IPG buffer，PH3-10,IPG预制胶条（7cm，PH3-10），丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，过硫酸铵(Ap),甘氨酸Gly，硫酸铵，甲醇，溴酚蓝，超纯水，液氮,正磷酸等
器皿：研钵，10ml、50ml、100ml、500ml容量瓶，10ml、500ml烧杯，1.5ml、50ml离心管， 50ml量筒，1ml、5ml、2.5ul、10ul、20ul、100ul微量移液器，100ml棕色瓶，冰盒，滤纸，玻璃棒，记号笔，布氏漏斗，试管等
三、实验流程
I 样品制备
A：蛋白质制备方法（全程低温，操作尽量快、准；双向电泳最重要、最基础环节）

A-1 TCA/丙酮沉淀法 —— 墨兰、石斛叶片
1. 称取0.3克左右样品，在预冷的研钵中，液氮研磨成粉
2. 粉末转移至10ml离心管中，加入6-8ml 10%TCA/丙酮，-20℃沉淀过夜（至少2小时），震荡几次
3. 取沉淀过夜的样品重量平衡，离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清
4. 向沉淀中加入6-8ml冷丙酮，混匀并进行重量平衡，-20℃沉淀20min,离心（13200rpm、4℃、30min）弃上清。（此过程反复三次）
5. 向沉淀中加6-8ml 80%冷丙酮混匀并进行天平平衡，-20℃沉淀20min,然后离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清。（此过程反复两次）
6. 转移沉淀到1.5ml离心管中，加1ml 冷丙酮洗涤、沉淀两次（离心0.5min）
7. 真空冰浴抽滤，干燥沉淀至干粉，-80℃低温保存。
(补充：醋酸铵/甲醇沉淀法:基本环节同TCA/丙酮沉淀法，只是第2步加入的是0.1M醋酸铵/甲醇)

A-2酚抽提法 —— 石斛、蝴蝶兰花芽
1. 称取0.3克左右样品，在预冷的研钵中，液氮研磨成粉
2. 粉末转移至10ml离心管中，加入酚抽提液与水饱和酚混匀，离心（13200rpm、4℃、20min）
3. 吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇（①液），剩余下层水相，加入Tris饱和酚混匀，离心（13200rpm、15℃、20min）
4. 吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇（②液），下层水相及杂质丢弃，①和②-20℃沉淀过夜（4h以上）
5. 取沉淀过夜的样品重量平衡，离心（13200rpm、4℃、30min），倒掉上清，加入6-8ml冷丙酮混匀，-20℃沉淀30min,离心（13200rpm、4℃、20min），弃上清。
6. 向沉淀中加6-8ml 80%冷丙酮混匀，-20℃沉淀20min,然后离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清。
7. 转移沉淀到1.5ml离心管中，加1ml 冷丙酮洗涤、离心沉淀两次（离心0.5min）
8. 真空冰浴抽滤，干燥沉淀至干粉，-80℃低温保存。

A-3 Tris-HCl提取缓冲液/醋酸铵-甲醇提取法——蝴蝶兰花瓣（白色、红色）：
1. 称取1.0 g花瓣，加入少许PVP，液氮研磨
2. 粉末转移至10ml离心管中，加5倍体积的 Tris-HCl提取缓冲液和少量的PMSF，摇匀，冰上悬
浮10 min，离心（13200rpm、4℃、15min ）
3. 取上清液加入预冷的5倍体积的0.1M 醋酸铵甲醇，-20℃条件下沉淀过夜。
4. 取沉淀过夜的样品重量平衡，沉淀加入10ml 0.1M醋酸铵甲醇溶液洗涤，离心（13200rpm、4℃、15min ）
弃上清。该环节反复3次。
5. 沉淀加入10ml预冷80%丙酮洗涤，离心（13200rpm、4℃、15min ）弃上清。该环节反复2次
6. 沉淀分装到1.5ml离心管中，加1ml 冷丙酮洗涤、离心沉淀两次（离心0.5min）
7. 真空冰浴抽滤，干燥沉淀至干粉,-80℃低温保存。
A-4 蝴蝶兰花苞（两种方法：酚抽提法、Tris-HCl提取缓冲液/醋酸铵-甲醇提取法）环节见A-2和A-3

试剂：
TCA—丙酮：10% TCA，0.07%ß-巯基乙醇，以丙酮为溶剂。置于-20℃冰箱保存。
冷丙酮 ：具有0.07%ß-巯基乙醇的丙酮，置于-20℃冰箱保存。
80%冷丙酮：80%丙酮，0.07%ß-巯基乙醇，用双蒸水定容。置于-20℃冰箱保存。
0.1M醋酸铵-甲醇：醋酸铵0.7708g，甲醇定容。Tris-HCl提取缓冲液
酚抽提液：蔗糖23.96g、氯化钾0.746g、EDTA 1.461g、Tris-base 6.057g、HCl0.25ml，双蒸水定容。（ß-巯基乙醇2%（v/v）现用现加）。置于4℃冰箱保存。
Tris-HCl提取缓冲液：0.1M Tris-HCl（pH 8.0），5 %（w/v）蔗糖，2%（w/v）SDS，5%（v/v）β-巯基乙醇，2mM PMSF（4℃保存）

B：Brandford 法定量蛋白
1) 考马斯亮蓝G-250试剂：
50mg考马斯亮蓝G-250溶于25ml 90％乙醇，加入50 ml 85％正磷酸，用双蒸水定容到500ml。
2）标准蛋白溶液：称取10mg牛血清白蛋白定容到100ml，得到100μg/ml的标准蛋白溶液。1ml标准溶液加5ml考马斯亮蓝G-250试剂，反映2min后测定595nm处吸光值。

0
1
2
3
4
5
6
100μg/ml的标准蛋白溶液(ml)
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水(ml)
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白含量（μg）
0
10
20
40
60
80
100
A 595

e.g．测得数据解决后，得线性标准曲线为 y=0.0074 x + 0.0164 （R2=0.997，一般R2＞0.995定量较好）

3) 样品蛋白质含量测定
10ul蛋白质样品加水稀释到1ml，加5ml考马斯亮蓝G-250试剂，反映2min后测定595nm处吸光值。根据标准曲线方程计算蛋白质含量。
II 双向电泳
第一部分 第历来等电聚焦（IEF）

1、 称取15mg蛋白质干粉加入约300ul（1：20）水化液（根据方法适当调整干粉与水化液比例）混匀，30℃（绝对不能超过33℃，防止蛋白氨甲酰化）水浴至少1h，然后离心（13200rpm、15℃、40min，吸取上清（计体积）。
蛋白质浓度测定：吸取10ul样品测定595nm吸光值，根据标准曲线计算蛋白质浓度
2、取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm、pH3-10 NL），室温中放置10分钟。
3、根据测定的蛋白质浓度，吸取适量样品（7cm胶条蛋白上样量为200-300ug），用水化液补足180μl上样。
4、沿着聚焦盘槽的边沿自左而右线性加入样品。在聚焦盘或水化盘两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产气愤泡。否则影响到胶条中蛋白质的吸取和分布。
5、用镊子去除IPG胶条上的保护层。将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液，胶条的正极（标有+）相应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产气愤泡。(Bio-rad/GE标准胶条槽)
6、在每根胶条上覆盖约1ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7、对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设立等电聚焦程序。
7cm胶条
水化 50V 20℃ 12 h 积极水化
S1 100V 快速 4 h 除盐
S2 1000V 线性 1 h 除盐
S3 4000V 线性 1 h 升压
S4 4000V 快速 2万VH 聚焦
S5 500V 快速 99 h 保持
选择所放置的胶条数。（1根）
设立每根胶条的极限电流。（50mA/根）
设立等电聚焦时的温度。（20℃）
补充：GE Manifold 胶条槽
胶条被动水化（水化盘，水化环节同积极水化），水化结束后的IPG胶条胶面朝上置于Manifold 胶条槽中，加滤纸盐桥，胶条的正极（标有+）相应于聚焦盘的正极，活动电极压在滤纸并卡紧。设立电压程序，同上。
8、 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
试剂:
水化液(10ml)：尿素（Urea）8M 4. 8g；硫脲（Thiourea）2M 1. 52g；CHAPS 4%（v/v） 0.4g；0.001%（w/v）溴酚蓝；DTT 10mM（10ul 1M DTT母液）；
IEF上样前加入IPG buffer（ 0.5%(v/v)PH 3-10NL）和溴酚蓝

第二部分 胶条平衡

1．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用双蒸水浸湿，然后直接置于胶条上，轻轻吸去胶条上的矿物油及多余样品。以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
2. 将胶条胶面朝上转移至平衡盘中，加入2.5ml平衡缓冲液I。将样品平衡盘放在水平摇床上平衡15分钟（计时器计时）。
3. 向另一个槽内加入2.5ml胶条平衡缓冲液II，待第一次平衡结束后，胶条胶面朝上转移至平衡缓冲液II中，继续在水平摇床上缓慢摇摆15分钟。
4．第二次平衡期间，将低熔点琼脂糖及Marker进行加热6min左右。

试剂：
平衡缓冲液：50mM Tris-Hcl (PH8.8)； 6m M 尿素；30％甘油（v/v）； 2％ SDS 0.002%溴酚蓝
平衡液Ⅰ： + 1% DTT (0.025g/2.5ml平衡缓冲液) 还原试剂 (将S–S键转化为SH)
平衡液Ⅱ： + 2.5% IAA (0.0625g/2.5ml平衡缓冲液) 烷基化试剂 (中和DTT，使组氨酸和半胱氨酸烷基化)
第三部分 第二向 SDS-PAGE
1、灌胶
配制10ml 12%的丙烯酰胺凝胶，将溶液注入玻璃板夹层中，上部留约0.5cm的空间，用无水乙醇封面，保持胶面平整。聚合约1h。
12% PAGE胶
mL
水
3.2
30%丙烯酰胺溶液
4.0
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
2.6
10% SDS
0.1
10%过硫酸氨（Aps）
0.1
TEMED
0.004
2、 倒去SDS-PAGE凝胶上方玻璃板间多余的液体，用滤纸吸干，将解决好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
3、 第二次平衡结束后，取出胶条用滤纸吸取多余的平衡液，并完全浸没在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
4、用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，加入已加热好的低熔点琼脂，不要在胶条下方产气愤泡。
5、待低熔点琼脂糖凝胶完全凝固后，将凝胶转移到电泳槽中，在电泳槽加入电泳缓冲液后（防止产气愤泡），接通电源。7cm胶板12％连续15mA 10min；30mA 1h 30min
7、 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。
8、 改良考马斯亮蓝染色
参照Candiano等的方法略作改动，具体环节为：
（1）清洗：用清水洗涤胶5min两次
（2）染色：考马斯亮蓝G-250染色过夜；
（3）脱色：双蒸水清洗2次，双蒸水漂洗变浅至背景为无色；
试剂：
30% 聚丙烯酰胺贮液（30%Acr-Bis）
丙烯酰胺 30g；甲叉-双丙烯酰胺0.8g；用双蒸水定容至100ml；滤膜过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris碱 pH8.8
Tris碱 18.15g；双蒸水 80ml
用1mol/L HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至100ml。滤膜过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
10% SDS 10g SDS溶于100ml双蒸水，滤膜过滤后，棕色瓶常温冰箱保存。
10% Ap(现用现配)：10mg Ap溶于100ul
1×电泳缓冲液（25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS）
Tris碱 3.03g； 甘氨酸 14.4g；SDS 1g；双蒸水 1L；混匀后，室温保存。
染色液
0.12％考马斯亮蓝G-250＋10％硫酸铵＋10％正磷酸＋20％甲醇（后再加25%甲醇）

第四部分 图象扫描及分析

1. 打开扫描仪，再打开计算机；将凝胶至于扫描仪上，用纯水小心湿润，使胶与扫描仪的玻璃板之间没有气泡，并用纸巾小心吸干凝胶周边的水分，盖上上盖，准备进行扫描。
2. 预览拟定扫描范围，调整扫描范围和扫描窗口大小，进行扫描，保存（一般是TIFF文献格式）。
3. 扫描结束后，先用纸巾小心吸干大部分水分，再用擦镜纸小心的擦拭镜面。盖好盖子，关闭计算机和扫描仪电源。
4. 用PDQuest分析软件分析，具体参照PDQuest™ 2-DAnalysis Software教程

Ⅲ 单向SDS-PAGE电泳
1. 样品复溶：
称取10mg蛋白质干粉加入约300ul（1：30）样品缓冲液混匀，85℃水浴5min，然后13200rpm 15℃ 20min，吸取上清（计体积）。
2. 灌胶：
配制8ml丙烯酰胺分离胶和3ml浓缩胶，先将分离胶灌入玻璃板中，凝结40min，然后将浓缩胶灌入并插入梳子，凝结30min
3. 点样：
将单向电泳仪组装好，向内槽加上电泳缓冲液，小心拔出梳子，定量上样（每孔10ul液体），进行电泳
电泳程序：15mA 10min 30mA 1h20min（视电泳速度调整）
4. 拆板：电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。
5. 染色:
改良考马斯亮蓝G-250
参照Candiano等的方法略作改动，具体环节为：
（1）清洗：用清水洗涤胶5min两次
（2）染色：考马斯亮蓝G-250染色过夜；
（3）脱色：双蒸水清洗2次，双蒸水漂洗变浅至背景为无色；
试剂:
样品缓冲液：1.0M Tris-Hcl（PH6.8）1.6ml；10%SDS 4ml；87%甘油 2.5ml；溴酚蓝0.4ml；β-ME 1ml（先不加）超纯水定容到20ml 。4℃长期保存。
带分离胶的凝胶配方：
试剂
12%分离胶（共8ml）
3%浓缩胶（3ml）
双蒸水
2.56
2.11ml
Acr-Bis
3.20
0.51
1.5mol/LTris-HClpH8.8
2.08
——
1.0mol/LTris-HClpH6.8
——
0.38
10% SDS
0.08
0.03
10% AP
0.08
0.03
TEMED
0.008
0.003

四：研究生分组和时间安排
1. 参与《植物科学实验技术》的研究生分为四个大组（大家根据课程安排及自身情况自行调整）。
2. 以大组为单位，进行双向电泳以及凝胶染色和图像分析。
3. 每位同学撰写一份实验报告，本学期结束后上交，便于成绩录入。
4. 三天：①制备样品：晚上、第二天上午 ② 历来、单向：上午、晚上；二向：第二天晚上 ③ 图像扫描

实验 LI-6400便携式光合仪测定植物(兜兰)的光合日变化

一 实验目的
1了解LI-6400光合测量系统的工作原理，通过本实验掌握其基本操作。
2 通过测定植物白天各时段光合速率的变化，绘制光合日变化曲线并分析。
二 实验原理
LI-6400是一个开放系统，即光合和蒸腾的测量基于流动于叶室内气流中CO2、H2O的变化量。LI-6400领先于传统开放系统的地方在于它将气体分析器安装于传感器头上。这样节省了气流到达传感器的时间，检测速度的改善不是依赖于气流计（传统系统往往这样）,并且严格准确地反映出叶片的变化。光照的忽然变化会导致光合速率的忽然变化，这会由CO2浓度的变化来检测到。
三 实验材料
第一组:肉饼、第二组:红魔帝、第三组:白魔帝
四 实验方法
按照LI-6400光合测量系统的实验说明，测定自然条件下植物材料的光合速率，观测光合速率的变化，待数值稳定后开始记录。
具体环节
1 使用普通叶室，连接好LI-6400便携式光合仪，打开电源预热20min。
2 在OPEN主菜单下的“Calib Menu”下，选择F3对仪器的Flow、CO2、H2O等进行零点校正。注意校正CO2、H2O零点时，应当关闭叶室并且保持叶室中不能夹入叶片，并且要用新鲜的碱石灰和干燥剂。
3 通过OPEN主界面的F4（New Msments）菜单打开一个保存测量数据的文献，输入保存测量数据的文献名，并添加标记，以便于数据的输出和分析。
4 设立测量条件（光强 lamp off、CO2浓度 mixer off、气体流速 500、叶面积大小 6、气孔比率 2），自然条件下测定不需设立光强与CO2。设立完毕后，观测参比室与样本室读数差异，若超过实验误差允许范围时需要进行匹配（Match)，测量过程中仪器也可自动匹配。
5 夹入叶片，叶片适应，数值稳定后进行记录（按Log键，系统就会把整套数据保存起来）。换叶片反复此步。
6 完毕所有记录后，关闭文献（Close file)。
7 用RS-232数据线连接电脑和LI-6400，按esc退回主界面，按F5（Utility Menu）按上下箭头选择“File Exchange Mode”，在电脑上预先安装Sim FX软件，双击打开LI6400FileEx，点击File，选择Prefs，选择Com端口，按Connect，连接成功后，选择文献传输到指定位置。
8 关机。按esc，退回主界面，关闭电源。
9 把化学管旋钮旋至中间松弛状态；旋转叶室调节螺丝，保持叶室处在打开状态。
五 实验结果
六 结果分析