电镜细胞化学技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

电镜细胞化学技术第1页电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术 从光镜组织化学基础上发展起来，从光镜组织化学基础上发展起来，任务是研究细胞内各种成份在超微结构任务是研究细胞内各种成份在超微结构水平上分布情况以及这些化学成份在细水平上分布情况以及这些化学成份在细胞活动过程中动态改变。酶细胞化学，胞活动过程中动态改变。酶细胞化学，免疫细胞化学，放射自显影以及各种细免疫细胞化学，放射自显影以及各种细胞组成生化分析等都属于电镜细胞化学胞组成生化分析等都属于电镜细胞化学范围。范围。第2页酶细胞化学发展情况酶细胞化学发展情况w酶细胞化学是从酶细胞化学是从50年代末开始发展。年代末开始发展。w酶在生命活动中占有极其主要地位，离酶在生命活动中占有极其主要地位，离开了酶，一切生命活动所需物质代谢将开了酶，一切生命活动所需物质代谢将成为不可能。成为不可能。w当前已知有当前已知有各种酶。各种酶。LM组织化学方法组织化学方法-显示出酶显示出酶100各种各种 EM细胞化学细胞化学-显示出酶显示出酶80各种各种 南医大电镜室南医大电镜室-EM-显示出酶显示出酶30各种各种第3页酶细胞化学意义酶细胞化学意义w酶细胞化学定位对研究细胞生理功效和酶细胞化学定位对研究细胞生理功效和病理过程有主要意义；病理过程有主要意义；w很多酶能够作为细胞膜和各种细胞器标很多酶能够作为细胞膜和各种细胞器标志酶，而且有些细胞还有其特有标志酶，志酶，而且有些细胞还有其特有标志酶，这就为研究细胞器结构与功效，细胞器这就为研究细胞器结构与功效，细胞器相互关系以及细胞判别提供了一个新武相互关系以及细胞判别提供了一个新武器。器。第4页细胞器细胞器标志酶标志酶内质网内质网核苷二磷酸酶，葡萄糖核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸磷酸酶酶高尔基体高尔基体TPP（硫胺素焦磷酸酶），（硫胺素焦磷酸酶），NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）酸酶）GERL和溶酶体和溶酶体ACP酶（酸性磷酸酶）酶（酸性磷酸酶）线粒体线粒体细胞色素氧化酶，琥珀酸细胞色素氧化酶，琥珀酸脱氢酶脱氢酶微粒体微粒体过氧化氢酶（过氧化氢酶（H2O2酶）酶）细胞膜（膜性结构）细胞膜（膜性结构）核糖核苷酸酶（如核糖核苷酸酶（如ATP酶）酶），碱性磷酸酶，碱性磷酸酶细胞器和它们标志酶细胞器和它们标志酶第5页酶细胞化学基本原理酶细胞化学基本原理 在生物化学中，按照催化反应性质在生物化学中，按照催化反应性质将酶分成水解酶、氧化还原酶、转换酶、将酶分成水解酶、氧化还原酶、转换酶、裂合酶、合成酶和异构酶六大类。但在裂合酶、合成酶和异构酶六大类。但在细胞化学上能够检出酶多数属水解酶和细胞化学上能够检出酶多数属水解酶和氧化还原酶两大类。氧化还原酶两大类。第6页一、水解酶一、水解酶底物底物酶条件酶条件初级反应产物初级反应产物捕捉剂捕捉剂最终反应产物最终反应产物捕捉剂通常是重金属（如铅、钡、铜等）捕捉剂通常是重金属（如铅、钡、铜等）普通来说，这些最终产物在细胞内位置代表普通来说，这些最终产物在细胞内位置代表酶促反应位置，也就是酶定位。酶促反应位置，也就是酶定位。以酸性磷酸酶为例：以酸性磷酸酶为例：甘油磷酸甘油磷酸钠钠酸性酸性 磷酸酶磷酸酶PH 5.0ROHH3PO4Pb2+Pb3(PO4)2第7页二、氧化还原酶二、氧化还原酶w包含氧化酶和脱氢酶，在氧化还原酶细包含氧化酶和脱氢酶，在氧化还原酶细胞化学方法中，包含着两个既分开又紧胞化学方法中，包含着两个既分开又紧密联络底物，在细胞化学中一个底物被密联络底物，在细胞化学中一个底物被还原，另一个被氧化。两个底物中，有还原，另一个被氧化。两个底物中，有一个是酶理想底物，另一个是专门选择一个是酶理想底物，另一个是专门选择在氧化还原时会起主要化学改变某种物在氧化还原时会起主要化学改变某种物质，后一个底物有很多方面可看作是捕质，后一个底物有很多方面可看作是捕捉剂等效物，称捕捉底物。捉剂等效物，称捕捉底物。第8页氧氧 化化 酶酶H2O2H2O氧化酶氧化酶DABDAB氧化聚合物氧化聚合物OsO4（锇酸）（锇酸）锇黑（高电子密度）锇黑（高电子密度）第9页脱脱 氢氢 酶酶琥珀酸盐琥珀酸盐延胡索酸盐延胡索酸盐琥珀酸琥珀酸脱氢酶脱氢酶高铁氰化物高铁氰化物Fe(CN)63 亚铁氰化物亚铁氰化物Fe(CN)64Cu2+亚铁氰化铜亚铁氰化铜以琥珀酸脱氢酶为例以琥珀酸脱氢酶为例注：注：Cu2+存在在柠檬酸钠或酒石酸钾钠条件下存在在柠檬酸钠或酒石酸钾钠条件下第10页惯用酶细胞化学试验步骤惯用酶细胞化学试验步骤 一、取材与固定一、取材与固定 试验动物组织最好用灌注固定，人体活检试验动物组织最好用灌注固定，人体活检标本以浸泡固定为主。用标本以浸泡固定为主。用2戊二醛固定液经戊二醛固定液经血管灌注固定动物组织血管灌注固定动物组织5分钟左右，然后取下分钟左右，然后取下所需组织，切成宽所需组织，切成宽1mm，长，长510mm长方形长方形组织块，在一样固定液中继续固定，固定时间组织块，在一样固定液中继续固定，固定时间随组织大小、种类而定。各种酶对固定液敏感随组织大小、种类而定。各种酶对固定液敏感度和耐受性也不一样，必须依据详细情况选择度和耐受性也不一样，必须依据详细情况选择固定液温度、浓度、时间和固定液温度、浓度、时间和PH。第11页惯用固定剂对超微结构和酶活性保留情况惯用固定剂对超微结构和酶活性保留情况保留情况保留情况超微结构情况酶活性酶活性超微结构情况酶活性酶活性乙醛乙醛差差好好羟基乙二醛羟基乙二醛好好好好丙烯醛丙烯醛好优异差差乙乙-甲基丙烯醛甲基丙烯醛好好好好巴豆醛巴豆醛尚可尚可好好丙酮醛丙酮醛差差差差甲醛甲醛尚可尚可优异琥珀醛琥珀醛尚可尚可好好戊二醛戊二醛优异好好丙醛丙醛尚可尚可好好乙二醛乙二醛尚可，好尚可，好好好第12页 二、漂洗组织二、漂洗组织 用用0.1M二甲胂酸钠缓冲液二甲胂酸钠缓冲液（PH7.4）在在4下漂洗组织，洗去戊二醛固定液，下漂洗组织，洗去戊二醛固定液，漂洗时间最少漂洗时间最少2小时以上，能够过夜。小时以上，能够过夜。二甲胂酸钠缓冲液是最理想漂洗液，因为二甲胂酸钠缓冲液是最理想漂洗液，因为它不干扰任何酶细胞化学反应。它不干扰任何酶细胞化学反应。第13页 三、切组织片三、切组织片 将长条组织块埋在将长条组织块埋在7琼脂中，用组织切琼脂中，用组织切片机切成片机切成25m75m组织组织片，将切下片，将切下组织组织片片浸泡在浸泡在40.1M二甲胂酸钠缓冲液中；或将组二甲胂酸钠缓冲液中；或将组织块用冰冻切片机切成所需厚度组织片，但需织块用冰冻切片机切成所需厚度组织片，但需预防冰晶产生。也可用振荡切片机切成预防冰晶产生。也可用振荡切片机切成45 m左右左右组织组织片。片。当被检验材料被充分固定时，用冰冻切片机制作当被检验材料被充分固定时，用冰冻切片机制作切片能很好保持微细结构。当材料不能充分固定切片能很好保持微细结构。当材料不能充分固定或不能被固定时，因为冷冻溶解能引发组织结构或不能被固定时，因为冷冻溶解能引发组织结构损伤，所以用组织切片机或振荡切片机。损伤，所以用组织切片机或振荡切片机。对一些有方向性组织，在切薄片前必须注意样品对一些有方向性组织，在切薄片前必须注意样品定向，事先确定所需要细胞位置。定向，事先确定所需要细胞位置。第14页 四、置换缓冲液四、置换缓冲液 将组织片放入配制孵育液用缓冲液中，将组织片放入配制孵育液用缓冲液中，换液换液23次，每次次，每次510分钟，使组织内部建分钟，使组织内部建立细胞化学反应所需立细胞化学反应所需PH条件，缓冲液温度须条件，缓冲液温度须保持保持4左右。有些细胞化学反应中有预孵育左右。有些细胞化学反应中有预孵育步骤，即将组织片浸在没有底物孵育液里步骤，即将组织片浸在没有底物孵育液里20分钟左右，在酶与底物相遇之前使组织内部分钟左右，在酶与底物相遇之前使组织内部建立起所需建立起所需PH以及足够捕捉剂浓度。以及足够捕捉剂浓度。第15页 五、孵育五、孵育 将组织片放在新鲜配制孵育液中，在室温将组织片放在新鲜配制孵育液中，在室温或或37水浴箱中孵育水浴箱中孵育30分钟至分钟至2小时，孵育过小时，孵育过程中不停振荡孵育液，使其轻易扩散到组织程中不停振荡孵育液，使其轻易扩散到组织内。内。孵育液要求现配现用，成份普通不能有大变动，底孵育液要求现配现用，成份普通不能有大变动，底物和捕捉剂浓度、缓冲液缓冲能力等必须保持在很物和捕捉剂浓度、缓冲液缓冲能力等必须保持在很窄程度内；在一些孵育液配方中，一些成份已靠近窄程度内；在一些孵育液配方中，一些成份已靠近溶解度极限，所以在混合各种成份时必须尤其小心。溶解度极限，所以在混合各种成份时必须尤其小心。各种酶有其对应孵育时间、温度、各种酶有其对应孵育时间、温度、PH，必须严格，必须严格恪守。恪守。第16页 六、漂洗组织六、漂洗组织 首先用配制孵育液缓冲液清洗组织，首先用配制孵育液缓冲液清洗组织，以去除孵育液中过剩试剂，普通换洗以去除孵育液中过剩试剂，普通换洗23次，每次次，每次5分钟，然后用分钟，然后用0.1M二甲胂二甲胂酸钠缓冲液漂洗，所用缓冲液保持在酸钠缓冲液漂洗，所用缓冲液保持在4左右。左右。第17页 七、后固定七、后固定 用用1锇酸固定液对组织作后固定，锇酸固定液对组织作后固定，因为组织较薄，在因为组织较薄，在4下固定时间普通下固定时间普通不超出不超出1小时。为了更加好显示细胞各小时。为了更加好显示细胞各种膜结构，能够用亚铁氰化钾还原锇酸种膜结构，能够用亚铁氰化钾还原锇酸作后固定。作后固定。第18页 八、脱水包埋八、脱水包埋 按超薄切片技术中常规方法进行脱按超薄切片技术中常规方法进行脱水和环氧树脂包埋，但脱水时间缩短二水和环氧树脂包埋，但脱水时间缩短二分之一，且不用醋酸双氧铀作块染。分之一，且不用醋酸双氧铀作块染。对超薄切片染色要慎重，因为电子染色可能会含对超薄切片染色要慎重，因为电子染色可能会含糊细胞化学反应细节，染色液也可能会含糊细胞糊细胞化学反应细节，染色液也可能会含糊细胞化学反应细节，染色液也可能与细胞化学反应产化学反应细节，染色液也可能与细胞化学反应产物起作用。所以，首先必须观察未经染色切片，物起作用。所以，首先必须观察未经染色切片，只有确证染色对细胞化学反应产物没干扰情况下只有确证染色对细胞化学反应产物没干扰情况下才能做常规超薄切片染色。才能做常规超薄切片染色。第19页应应 用用第20页第21页第22页第23页第24页免疫电子显微技术第25页电镜免疫细胞化学技术电镜免疫细胞化学技术 电镜免疫细胞化学技术是在细胞超电镜免疫细胞化学技术是在细胞超微结构水平上研究抗原抗体反应部位并微结构水平上研究抗原抗体反应部位并研究其动态改变。研究其动态改变。1959年，年，Singer首先提出用电子密首先提出用电子密度较高铁蛋白度较高铁蛋白(Ferritin)标识抗体方法，标识抗体方法，使在细胞超显微水平上研究抗原抗体反使在细胞超显微水平上研究抗原抗体反应成为可能。在此基础上，相继发展了应成为可能。在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、免疫酶技术及胶体金标识技术等。技术、免疫酶技术及胶体金标识技术等。第26页对标识物要求对标识物要求w标识物必须是电子密度高物质，在电镜标识物必须是电子密度高物质，在电镜下可识别下可识别w标识物与抗体或与抗原反应必须不改变标识物与抗体或与抗原反应必须不改变抗体或抗原活性抗体或抗原活性w标识物在电子轰击下不改变形状标识物在电子轰击下不改变形状w惯用标识物有铁蛋白、辣根过氧化物酶惯用标识物有铁蛋白、辣根过氧化物酶（HRP）、胶体金等）、胶体金等第27页基本操作基本操作w组织固定与取材：固定要求保留良好细组织固定与取材：固定要求保留良好细胞超微结构和保持组织抗原性，取材要胞超微结构和保持组织抗原性，取材要求快速、精细。固定液：过碘酸赖氨求快速、精细。固定液：过碘酸赖氨酸多聚甲醛液（酸多聚甲醛液（PLP液），多聚甲醛液），多聚甲醛戊二醛混合液，戊二醛混合液，4%多聚甲醛液多聚甲醛液w免疫染色：包埋前染色、包埋后染色、免疫染色：包埋前染色、包埋后染色、超薄冰冻切片染色超薄冰冻切片染色w包埋：树脂包埋、低温包埋包埋：树脂包埋、低温包埋第28页包埋前染色包埋前染色w即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。包埋。w包埋前染色组织以中层较为理想；表层包埋前染色组织以中层较为理想；表层因受机械修整，结构往往保留不好；深因受机械修整，结构往往保留不好；深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。w在做超薄切片前应先做半薄切片，找出在做超薄切片前应先做半薄切片，找出免疫反应阳性部位。免疫反应阳性部位。第29页 优点：优点：1.标本染色前不经过锇酸固定、脱水、标本染色前不经过锇酸固定、脱水、包埋等过程，抗原未被破坏，易于取得包埋等过程，抗原未被破坏，易于取得良好免疫反应。良好免疫反应。2.可在免疫反应阳性部位定位做超薄切可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片，提升电镜下检出率。片，提升电镜下检出率。3.适于含抗原量较少组织。适于含抗原量较少组织。缺点：缺点：因为经过一系列免疫染色步骤，常出现因为经过一系列免疫染色步骤，常出现一定超微结构损伤。一定超微结构损伤。第30页包埋后染色包埋后染色 组织标本经固定、脱水及树脂包埋，组织标本经固定、脱水及树脂包埋，制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。注意点：注意点：1、OsO4可使抗原活性显著降低。可使抗原活性显著降低。2、铜网易与化学物质产生反应，故需、铜网易与化学物质产生反应，故需选镍网或金网。选镍网或金网。3、在免疫组化处理全过程中，应注意、在免疫组化处理全过程中，应注意保持网面湿润，以免影响抗原活性。保持网面湿润，以免影响抗原活性。第31页 优点：优点：超微结构保留很好，方法简便，阳性结超微结构保留很好，方法简便，阳性结果有高度可重复性，同一张切片上可进果有高度可重复性，同一张切片上可进行多重免疫染色。行多重免疫染色。缺点：缺点：抗原活性在电镜生物样品处理过程中可抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；包埋在环氧树脂中组能减弱甚至丧失；包埋在环氧树脂中组织不易进行免疫反应等。织不易进行免疫反应等。第32页超薄冰冻切片染色超薄冰冻切片染色w将组织置于将组织置于2.3mol/l蔗糖液中，投入液氮蔗糖液中，投入液氮中速冻，在冰冻超薄切片机上切片。中速冻，在冰冻超薄切片机上切片。w优点：优点：样品抗原性保留很好，兼有包埋样品抗原性保留很好，兼有包埋前和包埋后染色优点。前和包埋后染色优点。w缺点：缺点：需配置冰冻超薄切片机，且技术需配置冰冻超薄切片机，且技术难度较大。难度较大。第33页 不论哪一个免疫电镜技术都面临微不论哪一个免疫电镜技术都面临微细结构保留和组织中抗原活性保留这一细结构保留和组织中抗原活性保留这一对矛盾。如戊二醛、锇酸等固定液有利对矛盾。如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构保留，但抗原活性有影响；于微细结构保留，但抗原活性有影响；而而H2O2能增加树脂穿透性，但对微细结能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在生物样品处理过程中，应同时注意到这生物样品处理过程中，应同时注意到这两方面。其次，每次免疫染色中清洗工两方面。其次，每次免疫染色中清洗工作应注意彻底，不然非特异性产物和其作应注意彻底，不然非特异性产物和其它污染物会影响特异性反应物显示和观它污染物会影响特异性反应物显示和观察。察。第34页免疫电镜胶体金标识法第35页 金标法是金标法是Faulk和和Taylor在在1971年提年提出，并首先用于免疫电镜。出，并首先用于免疫电镜。金标法是利用胶体金在碱性环境中金标法是利用胶体金在碱性环境中带有负电荷性质，使其与抗体相吸附，带有负电荷性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标识。从而将抗体标识。LM:金标识抗体与抗原反应时，呈鲜艳樱红金标识抗体与抗原反应时，呈鲜艳樱红色色 EM:金颗粒含有很高电子密度，清楚可见金颗粒含有很高电子密度，清楚可见第36页优优 点点w标识抗体不复杂，对微细结构损伤小。标识抗体不复杂，对微细结构损伤小。w金颗粒电子密度高，在金颗粒电子密度高，在TEM下清楚可见。下清楚可见。w利用不一样直径金颗粒标识不一样抗体，是利用不一样直径金颗粒标识不一样抗体，是研究突出小泡内神经递质共存有力工具。研究突出小泡内神经递质共存有力工具。w由抗原抗体反应部位结合金颗粒数量多少能由抗原抗体反应部位结合金颗粒数量多少能够进行粗略免疫细胞化学定量分析。够进行粗略免疫细胞化学定量分析。w能够对培养细胞内抗原进行标识定位。能够对培养细胞内抗原进行标识定位。w金含有强烈激发电子能力金含有强烈激发电子能力-能够用于能够用于TEM和和SEM观察。观察。w金标液无毒性，对人体无害。金标液无毒性，对人体无害。w胶体金被科技工作者认为是当前最理想标识胶体金被科技工作者认为是当前最理想标识物之一。物之一。第37页操作步骤操作步骤 应用于电镜水平免疫金染色法，可应用于电镜水平免疫金染色法，可分为包埋前染色和包埋后染色，因为包分为包埋前染色和包埋后染色，因为包埋前染色对细胞膜穿透性差，普通只用埋前染色对细胞膜穿透性差，普通只用于细胞表面抗原标识；细胞内部抗原标于细胞表面抗原标识；细胞内部抗原标识普遍采取包埋后染色。识普遍采取包埋后染色。第38页包埋后染色包埋后染色 1.超薄切片厚超薄切片厚5070nm左右，左右，载载于于200300网孔网孔镍镍网上。网上。2.置置1%H2O2内内10min至至1h，促，促进树进树脂穿透性，脂穿透性，有利于抗体有利于抗体进进入。滴入入。滴入1%H2O2液液1滴于蜡板滴于蜡板上，将网上，将网载载片面片面轻轻浮于液滴上。浮于液滴上。3.双蒸水洗双蒸水洗3次，每次次，每次10min，第一、二次洗法，第一、二次洗法如步如步骤骤2，浮于液滴上，第三次以盛有双蒸水，浮于液滴上，第三次以盛有双蒸水加加样样器沿器沿镍镍网面冲洗，水流网面冲洗，水流应应有适当有适当压压力，力，但不易但不易过过强强，用，用滤纸滤纸在网在网缘缘将水吸干。将水吸干。4.浮于正常羊血清（浮于正常羊血清（1:501:100）滴上，室温）滴上，室温30 60 min，以，以饱饱和固定和固定剂剂中游离中游离醛醛基占据非特基占据非特异性异性结结合部位，以阻断非特异性吸附。合部位，以阻断非特异性吸附。5.PBS漂洗漂洗3min，3次。次。第39页 6.滤纸滤纸吸干，孵育于第一抗体血清上，先室温吸干，孵育于第一抗体血清上，先室温预预孵孵1h，再置于，再置于4冰箱冰箱2436h。（从冰箱取。（从冰箱取出后需室温放置出后需室温放置1h）7.PBS漂洗漂洗3min，3次。次。8.PBS（内含（内含1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，PH8.2）中）中5min，此步，此步为为胶体金胶体金结结合做准合做准备备。9.胶体金胶体金标识标识抗体液抗体液1:301:100，淡，淡红红色色为为适宜适宜稀稀释释液，室温孵育液，室温孵育1h。10.双蒸水洗双蒸水洗3min，3次。次。如作双重染色，如作双重染色，则应则应将将镍镍网翻网翻过过来，用另来，用另一一类类抗体血清，重复上述步抗体血清，重复上述步骤骤210。11.枸枸橼橼酸酸铅铅染色染色5min，然后双蒸水洗。，然后双蒸水洗。12.饱饱和醋酸和醋酸铀铀染色染色5min，双蒸水洗，双蒸水洗净净。13.电镜观电镜观察。察。第40页应用第41页第42页第43页组织内雌激素受体CG-HRP-E2标识技术第44页 雌激素受体雌激素受体(ER)除存在于性器官外，几乎在全身除存在于性器官外，几乎在全身器官或多或少存在。对对应组织进行器官或多或少存在。对对应组织进行ER定性、定量定性、定量检验，对研究疾病发生、发展、诊疗和治疗都有主要检验，对研究疾病发生、发展、诊疗和治疗都有主要意义。意义。有生化法、组化法、组化免疫法及新近发展起来有生化法、组化法、组化免疫法及新近发展起来单克隆抗体，已经有学者对这些方法进行评价。单克隆抗体，已经有学者对这些方法进行评价。最近有作者用辣根过氧化物酶最近有作者用辣根过氧化物酶(HRP)偶联雌二醇偶联雌二醇(E2)检测乳腺癌水平，并广泛地得到应用。上述方法检测乳腺癌水平，并广泛地得到应用。上述方法均缺乏准确定性和定量研究均缺乏准确定性和定量研究 南医大电镜室首次将胶体金南医大电镜室首次将胶体金(CG)与与HRP偶联偶联E2结合作为配体形成了结合作为配体形成了CG-HRP-E2，使，使ER在电镜下显在电镜下显示，可在细胞超微结构水平进行定位和定量分析。示，可在细胞超微结构水平进行定位和定量分析。第45页结结 果果HRP-E2在在LM下显示下显示CG-HRP-E2在在EM下显示下显示对应靶细胞核内和胞浆对应靶细胞核内和胞浆内有不一样程度胶体金内有不一样程度胶体金颗粒分布颗粒分布附表：细胞浆与细胞核内附表：细胞浆与细胞核内ER平均密度平均密度(颗粒数颗粒数/0.12nm2)种类种类例数例数胞浆内胞浆内胞核内胞核内增生期间腺细胞增生期间腺细胞102.151.802.962.233.262.54增生期间质细胞增生期间质细胞101.501.22腺癌细胞腺癌细胞61.341.813.221.28第46页第47页讨讨 论论wCG稳定，快速吸附蛋白质而不改变生物活性稳定，快速吸附蛋白质而不改变生物活性wE2对靶细胞内对靶细胞内ER有高度亲和力与专一性有高度亲和力与专一性wHRP和和CG都是标识物都是标识物w创新之处于于把创新之处于于把CG与与HRP-E2（有售）相结合，形成（有售）相结合，形成CG-HRP-E2标识物，能很好标识靶细胞内胞浆和胞核标识物，能很好标识靶细胞内胞浆和胞核受体受体wHRP-E2与与CG-HRP-E2结果完全吻合结果完全吻合w在超微结构水平上进行准确定性和定量在超微结构水平上进行准确定性和定量w方法可靠，试剂起源易，价格低廉方法可靠，试剂起源易，价格低廉w本科研（国家自然科学基金资助本科研（国家自然科学基金资助免免疫电镜细胞化学疫电镜细胞化学部分）结果证实靶细胞中，核内部分）结果证实靶细胞中，核内ER显著多于浆内显著多于浆内ER，为，为30年来关于核受体或浆受体争论提供了一个有力年来关于核受体或浆受体争论提供了一个有力科学检测伎俩科学检测伎俩第48页细胞形态立体计量学第49页细胞形态立体计量学意义细胞形态立体计量学意义w是对细胞及其结组成份形态进行定量分是对细胞及其结组成份形态进行定量分析一个方法，也就是用立体学方法来分析一个方法，也就是用立体学方法来分析细胞形态结构（膜结构、颗粒结构、析细胞形态结构（膜结构、颗粒结构、纤维结构）纤维结构）w从二维图像推导三维空间结构，要用到从二维图像推导三维空间结构，要用到几何概率论等一些数学方法，这一套方几何概率论等一些数学方法，这一套方法称为立体学（法称为立体学（Stereology）。将立体）。将立体学方法用在细胞形态分析上，就是形态学方法用在细胞形态分析上，就是形态计量学（计量学（Cell Morphometry）第50页超薄切片取得图像超薄切片取得图像存在以下问题存在以下问题 1.二维图像与三维结构二维图像与三维结构 细胞含有三位结构，而电镜图像显示只细胞含有三位结构，而电镜图像显示只是二维形态。怎样从二维图像导出三维是二维形态。怎样从二维图像导出三维图像图像?2.定性与定量定性与定量 电镜是定性观察，定量是指用统计学方电镜是定性观察，定量是指用统计学方法对在电镜下所观察有差异图像进行统法对在电镜下所观察有差异图像进行统计学处理。计学处理。第51页3.抽样与统计抽样与统计 一个细胞群体细胞数目往往是很大，一个细胞群体细胞数目往往是很大，电镜下观察细胞只是一个抽样观察，其电镜下观察细胞只是一个抽样观察，其结果必须进行统计学处理。结果必须进行统计学处理。4.立体计量方法可行性立体计量方法可行性 立体计量方法是一个数学方法，有严立体计量方法是一个数学方法，有严格科学性。能够利用图像分析系统进行格科学性。能够利用图像分析系统进行处理，假如试验室没有图像分析系统能处理，假如试验室没有图像分析系统能够用人工方法进行立体计量分析。够用人工方法进行立体计量分析。第52页细胞一些结组成份体积细胞一些结组成份体积相对测量相对测量 一、体密度（一、体密度（Volume density）表示结构体积在参考系体积中占表示结构体积在参考系体积中占有相对大小结构参数，以有相对大小结构参数，以Vv表示表示 Vv=Vx/Vr Vx表示某种结组成份体积，表示某种结组成份体积，Vr表示参表示参考系体积考系体积第53页 体密度面分析、线分析、点分析体密度面分析、线分析、点分析因为在细胞不一样截面上结构是有差异，而且同一因为在细胞不一样截面上结构是有差异，而且同一细胞群体和各细胞之间也有差异，所以必须随机拍细胞群体和各细胞之间也有差异，所以必须随机拍摄大量（普通在摄大量（普通在30张以上）不一样细胞不一样切面张以上）不一样细胞不一样切面照片进行测量及统计，才能得出可靠结果。照片进行测量及统计，才能得出可靠结果。第54页二、面密度（二、面密度（Surface density）表示膜面积相对多少量，用表示膜面积相对多少量，用Sv表示表示Sv某种膜结构面积某种膜结构面积Sx参考系体积参考系体积Vr第55页 曲线长度（曲线长度（Length of curve）膜在二维图像上显示为曲线，普通而言，曲线形膜在二维图像上显示为曲线，普通而言，曲线形状是不规则，用图像分析仪能够测出曲线长度；如没状是不规则，用图像分析仪能够测出曲线长度；如没有图像分析仪，可用一组平行等距测试线测出。有图像分析仪，可用一组平行等距测试线测出。曲线长用曲线长用B表示，测试线表示，测试线间距为间距为L，曲线与测试线，曲线与测试线交点数为交点数为I，用几何概率，用几何概率方法能够证实：方法能够证实：B=LI/2第56页