(毕业论文)菊苣根中黄酮的提取工艺正文终稿.doc

长春工业大学摘要菊苣为多年生草本植物，源于欧洲，现在广泛分布亚洲、美洲。菊苣根中含有蛋白质、糖类、脂肪、黄酮、纤维素等营养物质，其中黄酮含量较高，黄酮是一类以苯色酮环为基础的酚类化合物，具有保肝、降压、利尿等功效。本实验主要用单因素的实验方法，用超声波乙醇提取法和乙醇回流提取法提取黄酮，通过改变提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比，获得的提取液在紫外分光光度计下测其吸光度，通过其吸光度得到菊苣根中黄酮含量，通过两种方法的比较得到，乙醇回流提取法得到的黄酮含量较高，最优提取条件为：乙醇浓度70，提取温度80，提取时间2.5h，料液比为1：20。再用正交实验优化乙醇回流提取法，得到对黄酮含量影响最大的是提取温度和乙醇浓度，其次是提取时间、料液比，在最佳提取条件下得最高总黄酮含量为7.74mg/g。关键词：菊苣根；黄酮；提取；正交Abstract Chicory is the perennial herb, mainly from Europe, now widely distributed in Asia, the America. Chicory root contains protein, carbohydrates, fats, flavonoids, cellulose and other nutrients, high flavonoid content, flavonoids are a class of phenolic compounds, benzene chromone ring has hepatoprotective, antihypertensive, diuretic and other effects. With the method of single factor experiments, this experiment applied ultrasonic ethanol extraction and hot water reflux extraction method flavonoids, by changing the extraction temperature, ethanol concentration, extraction time and liquid to solid ration in chicory root extract obtained under UV spectrophotometer measured absorbance by the absorbance, the results shows that hot water reflux extraction method obtained a higher flavonoid content, and final optimized conditions for extracting flavonoids was established, extracted 2.5 hours on 80, ethanol concentration 70% and solid to liquid ration 1:20. Then the orthogonal experiment to optimize the hot water reflux extraction method, and get to influence the flavonoid content is the extraction temperature and ethanol concentration, followed by the extraction time, solid to liquid ratio, the flavonoid content is 7.74mg / g under this optimum conditions.Keywords: chicory root；flavone；extract；orthogonalityII长春工业大学目录摘要IAbstractII第一章 前言1第二章 文献综述32.1 菊苣的简介32.1.1菊苣叶简介32.1.2 菊苣根简介42.2 总黄酮的简介52.2.1 总黄酮的理化性质52.2.2 总黄酮的功效成分52.2.3总黄酮的营养价值62.3菊苣根中总黄酮的提取方法72.3.1超声波乙醇提取法72.3.2乙醇回流提取法82.3.3 微波辅助提取法82.3.4 超临界提取法82.3.5 加速溶剂提取法92.4 菊苣根中总黄酮的测定方法92.4.1亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠比色法92.4.2紫外分光光度法92.4.3高效液相色谱法102.5 菊苣根总黄酮的研究目的与意义102.5.1 菊苣根总黄酮的研究目的102.5.2 菊苣根总黄酮的研究意义10第三章 实验部分123.1 实验样品123.2 实验仪器与试剂123.2.1实验仪器123.2.2 实验试剂123.3 实验方法133.3.1 菊苣根中总黄酮提取工艺133.3.2 菊苣根中总黄酮提取机理133.3.3 芦丁标准曲线143.3.4 菊苣根中总黄酮提取方法153.3.5 总黄酮的测定分光光度法16第四章 结果与讨论174.1 芦丁标准曲线的绘制174.2 菊苣根中总黄酮提取结果184.2.1超声波乙醇提取结果184.2.2乙醇回流提取结果204.3 菊苣根中总黄酮提取方法总结22第五章 结论与展望245.1 结论245.2 展望24致谢25参考文献2627第一章 前言菊苣有欧洲菊苣之称，为菊科植物。源产于欧洲，在国外广泛用于生产饲料，也是制糖的原料。菊苣在20世纪80年代引入我国，并以一种良好的态势迅速成为受欢迎的高等保健型蔬菜和新型优良牧草。菊苣适宜在温暖湿润的气候下生长，但也耐寒、耐热，对土壤要求也不是很严格，在荒地、坡地、田地、草原均可生长，全国各地均适合种植。菊苣也可作为药材，它的提取物具有改善高血糖、高血脂、高尿酸等作用1。菊苣由地上地下两部分组成，地上部分叶片柔弱，嫩叶可以采摘食用，适口性好，营养价值高。地下部分为菊苣根，干燥菊苣根中菊粉含量非常高，菊粉中黄酮等含量很高，可作为低聚果糖、高果糖的生产原料。菊苣在许多国家广泛用作饲料、蔬菜和制糖原料,该植物根提取物还具有明显的保肝作用。菊苣根的水提取物还有降压、利尿等药理活性。菊苣根部经烘烤磨碎之后可以加入咖啡中作为增香添加剂或者咖啡的替代品，根煮熟后涂上奶油可食用，叶可以做沙拉，菊苣的嫩叶可以采摘食用，但是软化栽培的菊苣也可以生食，叶子可以蘸酱，或者做成凉拌菜，也可炒、煮食用，口感好。菊苣的根部重量是菊苣叶子的几十倍，但是往往被人们浪费，没有更加有效的利用其价值。菊苣根中含有黄酮，黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，栎皮素由于具有强抗组织胺性，可以用于各类敏感症。菊苣根中还含有蛋白质，氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，据报道菊苣根中含有都中含有多种人类所必需的蛋白质，氨基酸就有17种之多，而菊苣根中含有人类所需的8种必需氨基酸中的4种。 所以我们可以把菊苣作为提取人类必需氨基酸的绿色原料。菊苣根中含有糖类，菊糖是自然界中天然存在的功能性食用多糖,具有抗消化特点,有水溶性膳食纤维和生物活性的生理功能,可增加人体内碳水化合物的供能时间而又不会显著提高人体内血糖水平。菊苣根中含有脂肪，菊苣根中的脂肪含量相对较低，只有2%左右，菊苣根中有人体所必需的亚麻酸和亚油酸及其他不饱和脂肪酸，但含量较少。菊苣根中还含有维生素，目前已有很多国家开发并食用菊苣根，将菊苣根作为膳食纤维食用2，因为菊苣根有特殊的苦味。因菊苣根中黄酮含量较高，所以用超声波乙醇提取法和热水回流提取法提取菊苣根的黄酮，采用单因素实验和正交的实验方法，得出菊苣根中黄酮提取的最优条件为：乙醇浓度70，提取温度80，提取时间2.5h，液料比为1：20。菊苣自从引入我国以来，以其营养价值高、营养丰富、食用口感好和烹制方便而深受人们欢迎。目前，在我国华北与山东省均已有大面积的人工种植，其药用价值和营养价值正在被开发应用中，近些年来菊苣在我国的种植面积呈逐年上升的趋势发展。第二章 文献综述2.1 菊苣的简介 菊苣为菊科多年生草本植物，根为肉质、短粗、肥大，茎直立，有棱，中空，多分支，叶互生，为倒披针形，头状花序，花冠舌状，花色青蓝。高40-100cm。 菊苣耐寒、耐旱，喜欢阳光，1525下生长迅速，即使夏季温度高，但是仍具有较强的生长能力。菊苣的耐寒性也较强，在-8-10时仍能生长完好，在-15-20下亦能生长。菊苣根系较发达，抗旱性较好，而且较耐盐碱，pH为8.2的土地时生长良好。菊苣对 图2-1 菊苣土壤的要求不严格，旱地、水浇地均可种植。菊苣在夏季播种或者秋季播种时，当年基本不抽茎，而是第二年开始抽茎，并开花结实。生长为两年以上的植株，根颈上不断生长出新的萌芽，并逐渐取代老的植株。菊苣种子一般是在受粉后的20天左右即为发育成熟，11月底开始停止生长，春季播种生育期为150天左右。2.1.1菊苣叶简介 菊苣地上部分叶片丛生于短缩茎上，基本呈倒披针形，先端渐尖，叶缘呈齿状，叶片呈叶绿色至深绿色，有些品种的叶脉带有紫红色晕斑，叶面有稀疏的绒毛。叶簇开展度很少成斜直立生长，或平展生长，都不形成叶球，利用其肉质直根进行栽培。叶片质地较薄，两面长稀疏的多细胞长节毛，但叶脉处及边缘的毛较多。菊苣叶片柔嫩多汁，营养丰富，叶丛期粗 蛋白质含量22.87%，初花期粗蛋白质含量14.73%平均17%。粗蛋白质产量达250kg/亩。初花期含粗 图2-2 菊苣叶脂肪2.1%，粗纤维30.6%3。菊苣氨基酸含量丰富，叶丛期9种必须氨基酸含量高于苜蓿草粉，菊苣根中含有丰富的胡萝卜素、维生素C与维生素B，所以菊苣根可以用来做维生素的开发，如单体维生素、复合维生素或者添加于食品之中作为维生素的补充剂，相信菊苣根以其丰富的维生素储存含量，便宜的市场价格，安全之质量保证，将会得到更多的厂家所青睐，会成为炙手可热消费物品，适口性非常好。 2.1.2 菊苣根简介 菊苣根及菊苣干燥的根，秋季采挖，除去杂质，晒干。菊苣根呈圆锥形，根肥大，有侧根及多数须根，长为10-20cm，直径为0.5-1.5cm。表面基本为棕黄色，有细腻而不规则的纵皱纹，质较硬，不易折断，断面外侧呈黄白色，中部为白色，有时有空心的情况，气微，微苦。菊苣根顶端有时有2-3个叉，嚼之有韧性。 图2-3菊苣根 有资料证明：人工栽培的菊苣根提取物具有保肝的作用，王良信动物实验结果显示：30只雄性大鼠分为4组，第1组为CCl4对照组,第2组为模型组,第3组为CCl4+黄酮类制剂组,第4组为菊苣根提取物+CCl4组。第3和4组在用CCl4诱导肝炎前7d给以相应药物,菊苣提取物以50mg/kg剂量灌胃,对照组给等量的水,黄酮类制剂剂量也是50mg/kg。试验15d后处死大鼠。根据邻甲苯胺反应计算大鼠血浆中葡萄糖水平、苯丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性。取大鼠肝脏中叶染色制作切片,进行组织学研究。结果显示,模型大鼠天冬氨酸转氨酶活性比正常动物提高69%,天冬氨酸转氨酶/苯丙氨酸转氨酶之比增至0.79(对照组为0.55),表明肝脏功能受到破坏。给以提取物后,大鼠血浆中肝炎毒性产生的影响降低了18%,使用提取物和黄酮类制剂后,天冬氨酸转氨酶活性分别比对照组降低了27%、47%。CCl4使大鼠血浆中葡萄糖水平降低了54%,表明器官对葡萄糖合成与储藏能力受到破坏；而给以提取物后,葡萄糖水平趋于正常4。 人工栽培的菊苣根水提物还具有降压、利尿等作用。将菊苣干燥根粉碎,用水提取并制成注射液,分为0.79 g/kg、1.74 g/kg和3.84 g/kg 3个剂量组,取家兔放在固定架内,乌拉坦麻醉后(5mL/kg),注射肝素、葡萄糖盐水使血压平稳,插气管插管和尿液导管,连接血压换能器,家兔血压稳定后再注射栽培菊苣注射液,一次给药量为0.51mL/kg,给药前每次注射生理盐水12 mL/kg,观察给药前后家兔的血压和尿液变化。结果:石油醚部分中分离得到三个化合物,分别为-谷甾醇,豆甾醇及菜籽甾醇；乙酸乙酯部分分离得到2个化合物,均为有机酸类；CO2超临界萃取物中确定二个化合物,即棕榈酸和十五二烯醇；家兔的药理实验表明：菊苣的水提物具有降血压和利尿的作用,而且随着给药剂量的增加,降压作用及利尿作用明显增强5。2.2 总黄酮的简介 黄酮是一类以苯色酮环为基础的酚类化合物。在植物中是由苯丙氨酸产生的肉桂酰辅酶A，是经碳链延长环化生成的查耳酮，再进而衍生成的各种苯基衍生物。 黄酮类化合物是指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而形成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物结构中常常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合生成苷。黄酮类化合物是在廿世纪八十年代末作为保健产品引起国际医药界的关注，临床医学研究人员发现其黄酮类化合物具有抗哮喘、防止长期抽烟引起的脑动脉硬化与脑血栓的形成以及降血压、血脂作用等。进而表明黄酮具有多样化的药理作用。2.2.1 总黄酮的理化性质 天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置以及联接方式的不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。组成黄酮苷类的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形的粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。黄酮具有显色反映：盐酸-镁粉（或锌粉）反应为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应，反应机理现在认为是因为生成了阳碳离子缘故；四氢硼钠（NaBH4）是对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂，产生红紫色。而与其它黄酮类化合物均不显色。黄酮类化合分子中常含有下列结构单元，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐、锶盐、铁盐等试剂反应，生成有色络合物；与1%三氯化铝或硝酸铝溶液反应，生成的络合物多为黄色（max=415nm），并有荧光，可用于定性及定量分析。2.2.2 总黄酮的功效成分 黄酮广泛存在自然界的某些植物和浆果中，总数大约有4千多种，其分子结构不尽相同，如芸香苷、橘皮苷、栎素、绿茶多酚、花色糖苷、花色苷酸等都属黄酮。不同分子结构的黄酮可作用于身体不同的器官，如银杏山楂-心血管系统，蓝梅-眼睛，酸果-尿路系统，葡萄-淋巴、肝脏，接骨木果-免疫系统，平时我们可以通过多食葡萄、洋葱、花椰莱、喝红酒、多饮绿茶等方式来获得黄酮，作为身体的一种补充。二十年前，科学家发现具有活化石之称的银杏树中含有相对较多的黄酮，现在主要从银杏叶中提取黄酮。 菊苣根中含有微量的黄酮，据相关报道主要有黄酮类（Flavones）、黄酮醇类（Flavonols）和花色素类（Anthocyans）等。黄酮类主要有5,7,4三轻黄酮（Apigenin）3，5，7，3,4,5六经黄酮（Myrieetin）以及黄酮糖苷等。黄酮醇类有山奈酚 （Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）及它们与葡萄糖组成的单糖（QMG）和二糖苷（QDG）句至多糖苷（QPG）。花色素类主要是由花青（Cyaniding），花葵素（Pelargonidin）与葡萄糖组成的葡糖苷6。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，为研究菊苣根中总黄酮的抗氧化性质，分别测定了菊苣根中总黄酮对OH的清除作用、对O2-的清除作用和对脂质过氧化的抑制作用。结果表明：菊苣根中总黄酮对OH的清除能力、对O2-的清除能力和脂质过氧化的抑制能力EC50分别为24.65gmL、57.01gmL和42.87gmL，菊苣根中总黄酮具有较强的抗氧化的作用7。 可有效清除体内的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。2.2.3总黄酮的营养价值 黄酮可以改善血液循环，方法：测定的总黄酮灌胃给药对家兔血黏度和血小板聚集的影响。结果：总黄酮灌胃30120mg/kg可显著降低家兔全血黏度、红细胞压积和红细胞聚集指数；抑制腺苷二磷酸诱导的家免血小板聚集。结论：总黄酮具有改善家兔血液流变性、血小板聚集作用8。可以降低胆固醇，向天果中的黄酮还含有一种PAF抗凝因子，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状。 被称为花色苷酸的黄酮化合物在动物实验中被证明可以降低26%的血糖和39%的三元脂肪酸丙酯，这种降低血糖的功效是很神奇的，但更重要的是它对稳定胶原质的作用，因此它对糖尿病引起的视网膜病及毛细血管脆化有很好的作用。黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，栎素由于具有强抗组织胺性，可以用于各类敏感症。它的抑制细胞免疫和体液免疫以及调节细胞凋亡等作用也日益受到重视9。一项由荷兰专家主持的研究发现：由4807位参与者的实验表明，每天饮375毫升绿茶的人，其心脏病的发病概率是那些不喝茶的人的一半；致命性心脏病发病率只有三分之一。其中重要的原因就是绿茶中所含的黄酮。来自南太平洋岛国的向天果，富含33种类黄酮，可以帮助人体改善血液循环，提高免疫力，是糖尿病、高血脂、高血压患者的福音。蜂胶是蜂蜜从植物新生枝芽或树皮上采集的树胶，混以自身分泌加工而成的芳香胶状体。45万只蜜蜂，一年仅能采到40g60g左右的蜂胶，被誉为“紫色黄金”。蜂胶皇是蜂胶中的极品，其总黄酮含量高达9300mg以上，且其余成份黄金配比，协同作用。科学家们给予蜂胶皇许多美称：血管清道夫、血糖守护神、抗癌勇士、天然免疫增强剂。高纯度大豆异黄酮对小鼠肝癌、乳腺癌有明显的抑瘤作用10。黄酮对许多疾病具有防治作用,揭示黄酮类化合物的吸收和代谢有利于了解其功效机制。黄酮的吸收和代谢水平依不同细胞而异,但主要受到胞内代谢的水平和它们从细胞中向外转运速度的影响11。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗12。黄酮具有降低血糖和血脂的作用13。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定有扩张冠血管、 2-苯基色原酮分子结构增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒的活性14。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化。2.3菊苣根中总黄酮的提取方法2.3.1超声波乙醇提取法 超声提取法是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取方法。用超声波提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺条件。采用超声提取50 min对酸枣仁总黄酮的提取效果进行分析,确定最佳提取方法。以乙醇浓度、料液比和提取时间为因子进行单因素试验和正交试验,确定超声波提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺。用超声波提取确定为理想的提取方法。影响总黄酮得率的主次因素为料液比乙醇浓度超声提取时间。超声波提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺条件为:70%乙醇,料液比130,超声提取50 min提取2次,提取率达到98.73%。采用超声波提取法的研究为酸枣仁总黄酮的工业化生产提供了参考依据15。2.3.2乙醇回流提取法 应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。优选瓜馥木总黄酮提取工艺。采用传统乙醇溶剂热回流提取黄酮,利用紫外分光光度法测定黄酮含量。通过单因素实验考察温度、乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对黄酮提取率的影响规律,并通过正交实验确定各因素对黄酮提取率的影响。黄酮最佳提取工艺条件为温度75,乙醇浓度60%,料液比1:25,提取时间4.0 h,提取次数5次,平均黄酮提取率为6.805%16。2.3.3 微波辅助提取法 微波辅助(MAE)提取法是利用微波加热与固态样品接触的溶剂,使所需的化合物从样品中分配到溶剂里的一系列提取过程。提取在密闭或敞开的微波-透明容器中,提取溶剂和样品混合在里面,同样接受到微波能。溶液中的微波(电介质)可以加热。 首先进行了单因素试验,在此基础上设计了L9(34)四因素三水平正交试验。确定了微波辅助法提取黄酮的最佳工艺条件为:以95%乙醇为提取剂,微波功率500W,微波温度65,提取时间8min,提取液料比10:1(mlg-1),最佳条件下的提取率为0.738mgg-1。结果表明,微波辅助萃取法有省时、节省溶剂、提取率高等优点,有较大的推广价值17。2.3.4 超临界提取法 超临界流体用作植物物质,环境样品,聚合物和食品提取的溶剂(6-8).大多数超临界提取(SFE)采用超临界二氧化碳,添加或不添加有机溶剂修饰剂。SFE具有分析选择性,提取功率可通过调节超临界流体密度和温度及压力进行微调。超临界流体的溶和功率可通过添加极性溶剂如丙酮或氯化亚甲烷来调节。本技术对基质和分析物的依靠性很强,必须针对每一种物质和分析物进行优化，本技术相对较快,提取时间少于1h。很多SFE生产厂家提供了各种自动和手动的提取仪器.样品装进高温高压管中,超临界流体穿过样品,并在含分析物的溶剂中减压或聚集在吸收区以便于回收。 通过单因素试验研究了溶剂比例、温度、时间、压力对超临界CO2 萃取毛白杨雄花序黄酮类化合物的影响，利用正交试验的方法得到最佳工艺条件：温度 60 ,液料比151、压力35MPa条件下 ,萃取 90min ,得率可达0.59%18。 2.3.5 加速溶剂提取法加速溶剂提取是在较高温度(一般为50-200)和压力1500-2000psi下进行液-固提取的方法.任何溶剂或溶剂混合物均可使用,少于15mL体积的溶剂需要10g样品.样品装进管中,高温加压液体穿过样品,然后冷却,收集。目前,只有一种加速溶剂提取系统达到产业生产规模,这是一种自动设备。相关技术应用于聚合物,动植物组织,食品和环境样品.美国环境保护协会(EPA)固态废弃物办公室已批准采用本技术提取部分挥发有机化合物,作为SW-846的第三代技术. 2.4 菊苣根中总黄酮的测定方法2.4.1亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠比色法原理是在待测物的水溶液中，加入亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠试液，铝离子与黄酮类化合物3，4，二羟基发生络合反应显色来进行测定。例如芦丁化合物B环上有邻二酚羟基，与铝离子络合，在500nm处有最大吸收，如果供试品显色后在同一地方有最大吸收，即可以芦丁做对照品，用比色法进行测定。采用氯化铝法、硝酸铝-亚硝酸钠法分别测定大叶冬青叶中的总黄酮含量。实验结果表明两种方法的测定结果相差很大,通过显色机理的分析,确立了氯化铝法为总黄酮含量测定的适宜方法,方法的回收率90.7%99.5%,平均回收率为97.8%,相对标准偏差2.2%。通过正交试验研究了总黄酮提取工艺,结果表明其适宜工艺条件为液料比12:1(V/m)、乙醇浓度60%、提取时间2h、提取次数2次,此条件下总黄酮得率为0.68%19。 2.4.2紫外分光光度法黄酮类化合物由于均具有苯基色原酮的基本结构，羰基与二个芳香环形成两个较强的共轭系统，对紫外光区相应有两个区域的特征吸收。吸收带I在较长波长（330380nm）；吸收带II在较短波长（240280nm）。经分离纯化的待测样品中主要含有黄酮类成分，其紫外光谱中有两个特征吸收带，因此可以选用其中主要的黄酮成分作为对照品测定总黄酮含量。为建立一种检测保健食品中总黄酮含量的快速分析方法 ,以活性成分芦丁为标准品 ,在其紫外最大吸收峰415nm处测定其总黄酮的含量。方法的最低检测浓度为0.1g/mL,芦丁标准品在10250g/mL范围内具有良好线性关系。平均加样回收率0.9762% ,相对标准偏差为1.85 %，该方法简便 ,重现性好 ,可作为检测保健食品中总黄酮含量方法之一20。2.4.3高效液相色谱法如果待测物中，总黄酮的大多数成分明确、含量高、易得到可供含量测定用的对照品，则可用高效液相色谱法直接测定总黄酮的含量或者样品经过处理，测定指标成分含量，再换算成总黄酮含量。对HPLC法测定大豆异黄酮的方法进行了研究。结果表明,采用C18色谱柱,柱温40,以甲醇-冰醋酸水溶液为流动相,流速1.0 mL/min,254 nm紫外检测器进行检测,其重复测定结果的相对标准偏差均小于5%,人员之间重复测定结果的平均值接近,相对标准偏差在0.28%3.78%之间,回收率在95.15%104.92%范围内,相对标准偏差均小于2%。所建立的HPLC法适用于大豆异黄酮的测定21。2.5 菊苣根总黄酮的研究目的与意义2.5.1 菊苣根总黄酮的研究目的为了更清楚的了解菊苣根中黄酮的提取，我们做了大量实验研究和查阅很多资料参考，首先从菊苣的植物学特征，了解菊苣的外表特征，了解菊苣叶、菊苣根的特征及其营养药理作用等，充分利用菊苣根重量大，重点开发其药理价值，以菊苣根中黄酮的提取及其提取方法等，提取出的黄酮的营养价值及其药理特性等，使人民更好的利用其营养价值。2.5.2 菊苣根总黄酮的研究意义 目前菊苣根的应用已逐步成型，首先菊苣是一种具有发展前途的饲草作物。其生长迅速,再生性好,产草量高,年产鲜草每公顷150t以上；富含各种营养物质,以抽芽前营养价值最高,维生素、胡萝卜素、钙含量丰富。吸收率高,猪、鸡、鸭、鹅、兔、牛、鱼等皆喜食,据报道:用菊苣饲喂奶牛,每头奶牛每天采食菊苣45kg50kg，10天后增产牛奶20%, 奶质优良, 口感醇香；饲喂猪, 每2.54kg菊苣可替代1kg全价精料，用含有50%的菊苣饲料饲喂，肉料比为13.93，猪毛色光亮，食欲旺盛，肉味甚佳。采用生物技术和利用酶制剂水解菊粉生产的低果聚糖，不经后处理，直接喷雾干燥制成粉剂，作为功能饲料添加剂，具有增殖双歧杆菌的作用，能够增强畜禽抗病害能力。菊苣的肉质根含有咖啡酸和奎宁酸所形成绿原酸和苦味质，经过焙炒可产生特殊的风味，能给浸煮液以深的色泽,增加咖啡的溶解质量，缓和咖啡的刺激作用,从而成为咖啡的添加物或代用品和制糖原料22，改善了咖啡的风味和浓度,提了咖啡的品质，同时还可减少木本咖啡的含量，降低成本。菊苣根中黄酮含量较高，具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿等功效23。菊苣由于营养丰富、口感鲜嫩,是一种极受欢迎的高档保健型蔬菜24。每100 g鲜菊苣芽球中含K元素 195.5 mg、Zn元素0.793mg、胡萝卜素0.043 mg、蛋白质680 mg,维生素A、C和Mg等多种微量元素。另外菊苣在栽培过程中不需施药,是一种很好的优质高档保健型蔬菜,如今已在许多省份栽培,产品已投入市场,获得了较好效益。菊苣根中的黄酮具有通过益生元、益生菌调节肠胃蠕动功能，菊粉可作为肠道内有益菌双歧杆菌的增殖因子，刺激与促进双歧杆菌增殖，据报道菊粉已被国外开发成功能性食品，用来提高机体免疫力。其对细菌和真菌均有一定的抑制作用25。 研究表明,大鼠膳食中加入5%20%菊粉和低聚果糖,具有提高肠道钙吸收、调节钙平衡和骨矿密度的作用。菊苣提取物具有显著降低血清胆固醇,甘油三酯水平的药理活性。Vanen等对12名年龄在1416岁的青少年测定了菊粉和低聚果糖对钙吸收的影响,结果表明：低聚果糖组钙吸收的百分率显著升高。通过多次老鼠试验已确认,菊苣低聚果糖可促进鼠类对无机盐的吸收,特别是对钙和镁的吸收。Coudray等以9名健康青年为研究对象,膳食中每天给予菊粉40g,实验28d,测定尿、粪中的钙、镁、铁和锌含量。结果显示：菊粉可显著增加钙吸收和钙平衡而不影响其它矿物质的储留。由于对菊苣低聚果糖消耗量的不同,可以使人对钙的吸收率分别提高26%58%26。可开发作为促进矿物质吸收元素的食品，还具有降血脂、降低蛋黄总脂和胆固醇的作用27。 菊苣植株茂盛,叶片深绿,花紫蓝色,花期长达4个多月,可以作为盆景花卉栽培,具有较高的观赏价值;菊苣根系发达,保水固土作用强,是优良绿化和水保植物；菊苣花还是优良的蜜源；菊苣的根、茎、叶是生产食用菌的优质基料。菊苣根中黄酮对人体有很多保健功效，菊苣叶可以食用，也可以做饲料用，而菊苣根并没有太大的工业应用，鉴于其黄酮的提取，可以进一步利用其根部提取物的营养价值。据报道北京奥运期间欧洲运动员要求食用菊苣，可见菊苣在欧洲非常有市场，作为农业大国，我国政府可以鼓励农民种植菊苣，把菊苣加工成成熟产品，出口国外，增加国民收入，菊苣的发展前景非常的客观。第三章 实验部分3.1 实验样品 菊苣根样品产地为河北承德。3.2 实验仪器与试剂3.2.1实验仪器 （1）JA2003N型 电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）； （2）JJ-2型 组织捣碎机（江苏金坛江南有限公司）； （3）DHG-914385- 电热恒温鼓风干燥机（上海新苗医疗器械制造有限公司）； （4）UV1102型 紫外分光光度计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）； （5）FD-1C型 冷冻干燥机（背景德天佑科技发展有限公司）； （6）TDZ5-WS型 多管架自动平衡离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）； （7）SHZ-A型 循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）； （8）85-2型 恒温磁力搅拌器（郑州长城科贸有限公司）； （9）B-220型 恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）； （10）RE52-98 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）； （11）JPT-20 架盘天平（江苏常热衡器厂）； （12）索氏提取装置； （13）凯氏烧瓶750ml； （14）电炉子 （郑州长城科贸有限公司）； （15）容量瓶（100mL、500mL、1000mL、2000mL）若干； （16）锥形瓶250mL若干； （17）100mL具塞刻度量筒；3.2.2 实验试剂 （1）浓盐酸（分析纯） 北京化工厂 （2）冰醋酸（分析纯） 北京化工厂 （3）硫酸铜（分析纯） 北京化工厂 （4）高锰酸钾 天津市化学试剂厂 （5）芦丁 北京化工厂 （6）碳酸钠（分析纯） 北京化工厂 （7）95%乙醇（分析纯） 北京化工厂 （8）丙酮（分析纯） 北京化工厂 （9)无水乙醇（分析纯） 北京化工厂 （10）氢氧化钠 沈阳试剂二厂 （11)硝酸铝溶液 （12)浓硫酸（分析纯） （13)硝酸钠溶液3.3 实验方法3.3.1 菊苣根中总黄酮提取工艺切片烘干（105）清洗样品（根部）预处理称重取样品品装瓶磨粉提取黄酮（超声波乙醇、乙醇回流提取）浸泡加入乙醇溶液500nm下测OD值抽虑（得滤液）图3-1菊苣根中黄酮的提取工艺3.3.2 菊苣根中总黄酮提取机理3.3.2.1 超声波乙醇提取机理 超声提取的主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。当大能量的超声波作用于介质时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时闭合，并产生高达几千个大气压的瞬间压力，即空化现象。超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大的压力，使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率。3.3.2.2 乙醇回流提取机理 应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材为容量的1312，溶剂浸过药材表面12cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时。放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。3.3.3 芦丁标准曲线(1)芦丁标准溶液配制 准确称取经105（干燥至恒重）的芦丁标准品0.0150g，用无水甲醇溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，将溶液摇匀，得浓度为1.5gmL的标准溶液备用28。 (2)标准曲线的测定 分别取上述芦丁标准溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，相当于芦丁含量分别为0g、75g、150g、300g、450g、600g，分别置于6个10.00mL刻度的比色管中，加入30乙醇溶液至5mL处。分别加入5亚硝酸钠溶液03mL，混合均匀，放置5min；加入10硝酸铝溶液03mL混合均匀，放置6min后加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL混匀，用30乙醇定容至刻度，l0min后于502nm波长处做比色测定，参比为空白试剂。得芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线及回归方程。（3）样品处理 取样品1g（精确至0.01g）于25mL具塞比色管中，加入15mL无水乙醇，涡旋混匀3min，超声提取30min（超声条件60，功率100W），抽滤，用无水乙醇淋洗比色管残渣及抽滤瓶，收集全部滤液于100mL蒸发皿中，于50水浴上挥发除去乙醇，用无水甲醇冲洗蒸发皿，收集溶液于50mL容量瓶中，定容。（4）测定 取1mL待测液于25mL比色管中，按测定标准曲线的步骤测定，加入30%乙醇5mL，加5%亚硝酸钠0.3mL，振荡后放置5min，加入10%硝酸铝溶液