生物化学和分子生物学人卫蛋白质的合成省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

作者:孙露洋 倪菊华单位:北京大学第十五章 蛋白质合成Protein Biosynthesis第1页目录第一节 蛋白质合成体系第二节 氨基酸与tRNA连接第三节 肽链合成过程第四节 蛋白质合成后加工和靶向输送第五节 蛋白质合成干扰和抑制第2页重点难点熟悉了解掌握蛋白质合成概念及特点；蛋白质合成体系组成及各自功效；遗传密码特点；翻译后加工主要方式。蛋白质合成基本过程；原核生物与真核生物蛋白质合成异同；蛋白质合成后靶向输送机制。分子伴侣功效；各类蛋白质亚细胞定位分拣信号特点；抗生素和毒素对蛋白质合成影响第3页蛋白质合成体系Protein-synthesizing System 第一节第4页密码子（codon)在mRNA开放阅读框区域，每3个相邻核苷酸为一组，编码 一个氨基酸，称为三联体密码（triplet code）或密码子。p遗传密码（genetic code）起始密码子和终止密码子 起始密码子（initiation codon）：AUG 终止密码子（termination codon）：UAA、UAG、UGA一、mRNA是蛋白质合成模板第5页第1个核苷酸（5端）第2个核苷酸第3个核苷酸（3端）UCAGU苯丙氨酸苯丙氨酸亮氨酸亮氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸酪氨酸酪氨酸终止密码子终止密码子半胱氨酸半胱氨酸终止密码子色氨酸UCAGC亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸组氨酸组氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸UCAGA异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸*甲硫氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰胺天冬酰胺赖氨酸赖氨酸丝氨酸丝氨酸精氨酸精氨酸UCAGG缬氨酸缬氨酸缬氨酸缬氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸UCAG遗传密码表第6页p遗传密码特点：方向性（directional）连续性（non-punctuated）简并性（degeneracy）摆动性（wobble）通用性（universal）第7页密码子连续性（a）氨基酸排列次序对应于mRNA中密码子排列次序；（b）核苷酸插入造成移码突变第8页密码子摆动性第9页运载氨基酸：氨基酸各由其特异tRNA携带，一个氨基酸可有几个对应tRNA，氨基酸结合在tRNA 3-CCA位置，结合需要ATP供能；充当“适配器”：每种tRNA反密码子决定了所携带氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。ptRNA作用二、tRNA是氨基酸和密码子之间特异衔接子第10页合成肽链时mRNA与tRNA相互识别、肽键形成、肽链延长等过程全部在核糖体上完成，核糖体沿着模板mRNA链从5端向3端移动。p核糖体类似于一个移动多肽链“装配厂”三、核糖体是蛋白质合成场所第11页核糖体功效位点第12页p酶类：氨酰-tRNA合成酶肽酰转移酶转位酶 p蛋白质因子：起始因子（initiation factor，IF）延长因子（elongation factor，EF）释放因子（release factor，RF）四、蛋白质合成需要各种酶类和蛋白质因子第13页种类生物学功效起始因子IF1IF2IF3占据核糖体A位，预防tRNA过早结合于A位促进fMet-tRNAfMet与小亚基结合阻止大、小亚基过早结合；增强P位结合fMet-tRNAfMet特异性延长因子EF-TuEF-TsEF-G促进氨酰-tRNA进入A位，结合并分解GTPEF-Tu调整亚基有转位酶活性，促进mRNA-肽酰-tRNA由A位移至P位；促进tRNA卸载与释放释放因子RF1RF2RF3特异识别终止密码UAA或UAG；诱导肽酰转移酶转变为酯酶特异识别终止密码UAA或UGA；诱导肽酰转移酶转变为酯酶含有GTPase活性，当新合成肽链从核糖体释放后，促进RF1或 RF2与核糖体分离原核生物肽链合成所需要蛋白质因子第14页种类生物学功效起始因子eIF1eIF1AeIF2eIF2B，eIF3eIF4AeIF4BeIF4EeIF4GeIF4FeIF5eIF5B结合于小亚基E位，促进eIF2-tRNA-GTP复合物与小亚基相互作用原核IF1同源物，预防tRNA过早结合于A位含有GTPase活性，促进起始Met-tRNAMet与小亚基结合最先与小亚基结合起始因子；促进后续步骤进行eIF4F复合物成份，含有RNA解旋酶活性，解开mRNA二级结构，使其与小亚基结合结合mRNA，促进mRNA扫描定位起始密码AUGeIF4F复合物成份，结合于mRNA5-帽结构eIF4F复合物成份，结合eIF4E和poly(A)结合蛋白(PABP)包含eIF4A、eIF4E、eIF4G复合物促进各种起始因子从小亚基解离，从而使大、小亚基结合含有GTPase活性，促进各种起始因子从小亚基解离，从而使大、小亚基结合延长因子eEF1eEF1eEF2与原核EF-Tu功效相同与原核EF-Ts功效相同与原核EF-G功效相同释放因子eRF识别全部终止密码真核生物肽链合成所需要蛋白质因子第15页氨基酸与tRNA连接The Attachment of Amino Acid onto its tRNA第二节第16页氨基酸与tRNA连接专一性由氨酰-tRNA合成酶决定。氨酰-tRNA合成酶含有高度专一性，既能识别特异氨基酸，又能识别应该结合该种氨基酸tRNA。所以，氨酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。一、氨酰-tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNAp反应过程氨基酸+tRNA氨酰-tRNAATP AMPPPi氨酰-tRNA合成酶第17页氨酰-tRNA合成酶催化ATP分解为焦磷酸与AMP；第一步反应第二步反应AMP、酶、氨基酸三者结合为中间复合体（氨酰-AMP-酶），其中氨基酸羧基与磷酸腺苷磷酸以酐键相联而活化；第三步反应活化氨基酸与tRNA 3-CCA末端腺苷酸核糖2或3位游离羟基以酯键结合，形成对应氨酰-tRNA。第18页氨酰-tRNA合成第19页二、肽链合成起始需要特殊起始氨酰-tRNA起始氨酰-tRNA:Met-tRNAiMet参加肽链延长甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMetp真核生物p原核生物起始氨酰-tRNA:fMet-tRNAfMet第20页肽链合成过程Synthesis Process of Peptide Chain第三节第21页p 原核生物翻译起始复合物形成一、翻译起始复合物装配开启肽链合成核糖体大小亚基分离mRNA与核糖体小亚基结合fMet-tRNAfMet结合在核糖体P位翻译起始复合物形成。p 真核生物翻译起始复合物形成43S前起始复合物形成mRNA与核糖体小亚基结合核糖体大亚基结合第22页mRNAS-D序列第23页原核翻译起始复合物形成第24页真核翻译起始复合物形成第25页二、在核糖体上重复进行三步反应延长肽链 p翻译起始复合物形成后，核糖体从mRNA5端向3端移动，依据密码子次序，从N端开始向C端合成多肽链p在核糖体上重复进行进位、成肽和转位，每循环1次，肽链上即可增加1个氨基酸残基p真核生物肽链延长机制与原核生物基本相同，但亦有差异，如二者所需延长因子不一样，真核生物需要eEF1、eEF1和eEF2这三类延长因子，其功效分别对应于原核生物EF-Tu、EF-Ts和EF-G。另外，在真核生物，一个新氨酰-tRNA进入A位后会产生变构效应，致使空载tRNA从E位排出。第26页p三步反应进位（positioning）：氨酰-tRNA按照mRNA模板指令进入核糖体A位过程，又称注册成肽（peptide bond formation）：核糖体A位和P位上tRNA所携带氨基酸缩合成肽过程转位（translocation）：成肽反应后，核糖体需要向mRNA3端移动一个密码子距离，方可阅读下一个密码子，此过程为转位第27页肽链延长第28页三、终止密码子和释放因子造成肽链合成终止p肽链上每增加一个氨基酸残基，就需要经过一次进位、成肽和转位反应。如此往复，直到核糖体A位对应到了mRNA终止密码子上。p终止密码子不被任何氨酰-tRNA识别，只有释放因子RF能识别终止密码子而进入A位，这一识别过程需要水解GTP。第29页p原核生物有3种RFRF1识别UAA或UAG，RF2识别UAA或UGA，RF3则与GTP结合并使其水解，帮助RF1与RF2与核糖体结合。p真核生物仅有eRF一个释放因子全部3种终止密码子均可被eRF识别。真核生物中肽链合成完成后水解释放过程还未完全了解。第30页多聚核糖体（polyribosome或polysome）：多个核糖体结合在1条mRNA链上所形成聚合物。多聚核糖体形成能够使肽链合成高速度、高效率进行。多聚核糖体第31页蛋白质合成后加工和靶向输送Processing and Targeting of Synthesized Proteins第四节第32页一、新生肽链折叠需要分子伴侣p细胞中大多数天然蛋白质折叠并不是自发完成，其折叠过程需要其它酶或蛋白质辅助，这些辅助性蛋白质能够指导新生肽链按特定方式正确折叠，它们被称为分子伴侣（molecular chaperone）。p当前研究得较为清楚分子伴侣是热激蛋白70（heat shock protein 70,Hsp70）家族和伴侣蛋白（chaperonin）。第33页p Hsp70：在蛋白质翻译后加工过程中，Hsp70与未折叠蛋白疏水区结合，既可防止蛋白质因高温而变性，又可预防新生肽链过早折叠。Hsp70也能够使一些跨膜蛋白在转位至膜前保持非折叠状态。有些Hsp70经过与多肽链结合、释放循环过程，使多肽链发生正确折叠。这个过程需要ATP水解供能，并需要其它伴侣蛋白如Hsp40共同作用。p chaperonin：其主要作用是为非自发性折叠肽链提供正确折叠微环境。比如，在 大 肠 杆 菌，约 有 10%15%细 胞 内 蛋 白 质 正 确 折 叠 依 赖 伴 侣 系 统GroEL/GroES，热激条件下依赖该系统蛋白质则高达30%。在真核细胞，与GroEL/GroES功效类似伴侣蛋白是Hsp60。第34页Hsp70作用示意图第35页GroES/GroEL系统作用原理第36页二、肽链水解加工产生含有活性蛋白质或多肽p新生肽链水解是肽链加工主要形式。新生肽链N端甲硫氨酸残基，在肽链离开核糖体后，大部分即由特异蛋白水解酶切除。p还有许多蛋白质在初合成时是分子量较大没有活性前体分子，如胰岛素原、胰蛋白酶原等。这些前体分子也需经过水解作用切除部分肽段，才能成为有活性蛋白质分子或功效肽。p有些多肽链经水解能够产生数种小分子活性肽，如阿黑皮素原（pro-opiomelanocortin，POMC）。第37页POMC水解修饰第38页化学修饰类型被修饰氨基酸残基磷酸化丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸N-糖基化天冬酰胺O-糖基化丝氨酸、苏氨酸羟基化脯氨酸赖氨酸甲基化赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸乙酰化赖氨酸、丝氨酸体内常见蛋白质化学修饰三、氨基酸残基化学修饰改变蛋白质活性第39页四、亚基聚合形成含有四级结构活性蛋白质p经过非共价键亚基聚合形成含有四级结构蛋白质；p含有四级结构蛋白质由两条以上肽链经过非共价键聚合，形成寡聚体（oligomer）；p辅基连接后形成完整结合蛋白质；p结合蛋白质合成后都需要结合对应辅基，才能成为含有功效活性天然蛋白质。第40页五、蛋白质合成后被靶向输送至细胞特定部位 p分泌型蛋白质在内质网加工及靶向输送p内质网蛋白C端含有滞留信号序列p大部分线粒体蛋白在细胞质合成后靶向输入线粒体p质膜蛋白质由囊泡靶向输送至细胞膜p核蛋白由核输入因子运载经核孔入核第41页蛋白种类信号序列结构特点分泌蛋白和膜蛋白信号肽由1336个氨基酸残基组成，位于新生肽链N端核蛋白核定位序列由48个氨基酸残基组成，通常包含连续碱性氨基酸（Arg或Lys），在肽链位置不固定内质网蛋白内质网滞留信号肽链C端Lys-Asp-Glu-Leu序列核基因组编码线粒体蛋白线粒体前导肽由2035个氨基酸残基组成，位于新生肽链N端溶酶体蛋白溶酶体靶向信号甘露糖-6-磷酸（Man-6-P）蛋白质亚细胞定位分捡信号第42页信号肽结构特点第43页分泌型蛋白质加工与靶向输送第44页核蛋白靶向输送第45页蛋白质合成干扰和抑制Interference and Inhibition of Protein Synthesis第五节第46页一、许多抗生素经过抑制蛋白质合成发挥作用抗生素作用位点作用原理应用伊短菌素原核、真核核糖体小亚基妨碍翻译起始复合物形成抗病毒药四环素原核核糖体小亚基抑制氨酰-tRNA与小亚基结合抗菌药链霉素、新霉素、巴龙霉素原核核糖体小亚基引发读码错误；抑制起始抗菌药氯霉素、林可霉素、红霉素原核核糖体大亚基抑制肽酰转移酶，阻断肽链延长抗菌药放线菌酮真核核糖体大亚基抑制肽酰转移酶，阻断肽链延长医学研究嘌呤霉素原核、真核核糖体使肽酰基转移到它氨基上，肽链脱落抗肿瘤药夫西地酸、微球菌素原核延长因子EF-G阻止转位抗菌药大观霉素原核核糖体小亚基阻止转位抗菌药惯用抗生素抑制肽链合成原理及应用第47页白喉毒素作用原理二、一些毒素抑制真核生物蛋白质合成第48页本章小结p蛋白质含有种属特异性，所以各种生物蛋白质必须由机体本身合成。蛋白质含有种属特异性，所以各种生物蛋白质必须由机体本身合成。p蛋蛋白白质质合合成成体体系系包包含含原原料料氨氨基基酸酸，模模板板mRNA、氨氨基基酸酸搬搬运运工工具具tRNA、蛋蛋白白质质合合成成场场所所核核糖体，以及合成各阶段所需酶和蛋白质因子等。糖体，以及合成各阶段所需酶和蛋白质因子等。p蛋白质合成过程包含起始、延长和终止三个阶段。蛋白质合成过程包含起始、延长和终止三个阶段。p原原核核生生物物和和真真核核生生物物肽肽链链合合成成过过程程基基本本相相同同，只只是是真真核核生生物物反反应应更更为为复复杂杂、包包括括蛋蛋白白质质因因子更多。子更多。p翻翻译译后后加加工工包包含含在在分分子子伴伴侣侣帮帮助助下下肽肽链链折折叠叠、肽肽链链末末端端及及内内部部水水解解、肽肽链链中中氨氨基基酸酸残残基基化化学修饰、亚基聚合等方式。学修饰、亚基聚合等方式。p蛋白质在细胞质合成后，还需要被靶向输送至其发挥功效亚细胞区域，或分泌到细胞外。蛋白质在细胞质合成后，还需要被靶向输送至其发挥功效亚细胞区域，或分泌到细胞外。p蛋白质生物合成是许多药品和毒素作用靶点。蛋白质生物合成是许多药品和毒素作用靶点。第49页本章知识点框架图：蛋白质合成蛋白质合成体系蛋白质合成后加工和靶向输送原核生物真核生物1.起始氨酰-tRNA:fMet-tRNAfMet 2.翻译起始复合物形成核糖体大小亚基分离mRNA与核糖体小亚基结合fMet-tRNAfMet结合在核糖体P位翻译起始复合物形成3.进位、成肽和转位 延长因子：EF-Tu、EF-Ts和EF-G4.肽链合成终止 RF1识别UAA或UAG，RF2识别UAA或UGA，RF3则与GTP结合并使其水解，帮助RF1与RF2与核糖体结合蛋白质生物合成是许多药品和毒素作用靶点1.起始氨酰-tRNA:Met-tRNAiMet2.翻译起始复合物形成43S前起始复合物形成mRNA与核糖体小亚基结合核糖体大亚基结合3.进位、成肽和转位 延长因子：eEF1、eEF1和eEF24.肽链合成终止 释放因子：eRF蛋白质合成过程1.原料：氨基酸2.模板：mRNA3.氨基酸搬运工具：tRNA4.蛋白质合成场所：核糖体5.酶和蛋白质因子1.翻译后加工：在分子伴侣帮助下肽链折叠、肽链末端及内部水解、肽链中氨基酸残基化学修饰、亚基聚合。2.蛋白质靶向输送至其发挥功效亚细胞区域，或分泌到细胞外。惯用抗生素：伊短菌素、四环素、链霉素、新霉素、巴龙霉素、氯霉素、林可霉素、红霉素、放线菌酮、嘌呤霉素、夫西地酸、微球菌素、大观霉素第50页谢 谢 观 看第51页