MTT配制原理操作步骤结果分析注意项目.doc

MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项-四、试验所需材料1MTT 溶液配制 通常MTT 配成终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。市面上通常MTT包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这么小包装，厂家全部是将MTT放入小管中，个人提议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法：预先在50ml离心管（没有话，可用培养瓶替换）加入20ml PBS，从中先吸收500-1000ul PBS装入含MTT小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。能够反复几次，以使小管中MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长久保留于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，通常每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有些人将粉剂分装在EP管里，用时候现配，直接往培养板中加。注意事项：l 在配制和保留过程中，容器最好用铝箔纸包住。l 配成MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT通常最好现用现配，过滤后4度避光保留两周内（个人曾做过4度避光保留4周MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保留在-20度长久保留，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。l MTT有致癌性，用时候小心,有条件最好带那种透明簿膜手套.2MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，能够直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液过程中，可能会把结晶去掉，造成结果不稳定。2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文件方法：周建军等，评价抗癌物质活性改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。（个人认为其溶解能力不如DMSO强）该溶解液因含有SDS，在低温保留时候易产生结晶，所以在用之前必需提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。五、MTT法试验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心搜集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10104/ml。细胞具体计数方法请参考.cn中相关文章。对于初学者而言，要使细胞达成5-10104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单方法以初步确定细胞数量。以通常细胞培养常见25cm2为例，1) 细胞密度在长到约80%90%（下图所表示为80%90%密度时细胞大致状态），消化离心搜集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。2) 另取一支新15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基. 3) 从第一步准备3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时通常为或小于5-10104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；假如不够该浓度，再依据计数结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。4) 细胞数量因试验目标不一样应做对应调整，如通常细胞增殖试验每孔个就能够（相当于细胞悬液密度为2104/ml），细胞毒性试验每孔500010000个（相当于细胞悬液密度为5104/ml）。另外，还应依据细胞本身特征，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快细胞密度可略小。 2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这么待测细胞密度为500010000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。l 注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，所以接种过程中要反复数次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT结果至关关键。-3. 将接种好细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度药品,标准上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日早晨加药.通常5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.提议设6个，不然难以反应真实情况。下图可做为96孔板参考步局。 l 对于加药，有些人直接将药品按不一样体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽可能在EP管中将不一样浓度药品配好，然后将96孔板中培养上清去掉（能够用排枪吸走）再加入100ul含不一样浓度药品培养基，这么能确保药品浓度正确。另外，需注意是，假如用这种方法，不要把96孔板培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免因为96孔板干燥引发细胞死亡。 4. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药品作用效果。下图为一经典药品梯度为细胞毒性作用。5. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药品和MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT培养液。 6. 终止培养，准备溶解结晶。 l 溶解结晶方法有两种，第一个，用DMSO溶解1) MTT加入培养4h后，结晶可充足形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有些人直接用移液器将上清移走，也有些人提议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这么上清便被滤纸吸走，以降低结果损失。个人认为，这两种方法全部有可能造成结晶损失，从而引发结果不正确。采取哪种方法，能够自己探索一下再决定。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充足溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔吸光值。 l 另一个方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）1) MTT加入培养4h后，结晶可充足形成。这种方法细胞上清能够不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（该溶解液因含有SDS，在低温保留时候易产生结晶，所以在用之前必需提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。）2) 放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。假如紫色结晶较小较少，溶解时间会短部分。假如紫色结晶较大较多，溶解时间会长部分。 在实际操作过程中，往往为了等候46小时，使得试验者在下班以后或晚上来测OD值，给试验者带来了很大不方便。个人曾经探索，加入溶解液后过夜再测对OD值基础无影响，但要注意是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就能够了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度药品溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。MTT操作方法一、MTT是什么MTT是一个粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一个黄颜色染料。二、MTT法用来做什么简单地说：是一个检测细胞存活和生长方法。MTT关键有两个用途1药品（也包含其它处理方法如放射线照射）对体外培养细胞毒性测定；2细胞增殖及细胞活性测定。三、为何MTT能够用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功效。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中甲瓒，用酶标仪在490nm波优点测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成量和细胞数成正比。依据测得吸光度值（OD值），来判定活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（假如是测药品毒性，则表示药品毒性越小）。四、试验所需材料1MTT 溶液配制 通常MTT 配成终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。市面上通常MTT包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这么小包装，厂家全部是将MTT放入小管中，个人提议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法：预先在50ml离心管（没有话，可用培养瓶替换）加入20ml PBS，从中先吸收500-1000ul PBS装入含MTT小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。能够反复几次，以使小管中MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长久保留于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，通常每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有些人将粉剂分装在EP管里，用时候现配，直接往培养板中加。注意事项：l在配制和保留过程中，容器最好用铝箔纸包住。l配成MTT需要无菌，MTT对菌很敏感lMTT通常最好现用现配，过滤后4度避光保留两周内（个人曾做过4度避光保留4周MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保留在-20度长久保留，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。lMTT有致癌性，用时候小心,有条件最好带那种透明簿膜手套. 2MTT甲瓒溶解液2.1二甲基亚砜DMSO，能够直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液过程中，可能会把结晶去掉，造成结果不稳定。2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文件方法：周建军等，评价抗癌物质活性改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。（个人认为其溶解能力不如DMSO强）该溶解液因含有SDS，在低温保留时候易产生结晶，所以在用之前必需提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。五、MTT法试验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心搜集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10104/ml。 细胞具体计数方法请参考易生物试验技术中相关文章。对于初学者而言，要使细胞达成5-10104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单方法以初步确定细胞数量。以通常细胞培养常见25cm2为例，1)细胞密度在长到约80%90%（下图所表示为80%90%密度时细胞大致状态），消化离心搜集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。2)另取一支新15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.3)从第一步准备3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时通常为或小于5-10104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；假如不够该浓度，再依据计数结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。)细胞数量因试验目标不一样应做对应调整，如通常细胞增殖试验每孔个就能够（相当于细胞悬液密度为2104/ml），细胞毒性试验每孔500010000个（相当于细胞悬液密度为5104/ml）。另外，还应依据细胞本身特征，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快细胞密度可略小。2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这么待测细胞密度为500010000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。l注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，所以接种过程中要反复数次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT结果至关关键。3.将接种好细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度药品,标准上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日早晨加药.通常5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.提议设6个，不然难以反应真实情况。下图可做为96孔板参考步局。l对于加药，有些人直接将药品按不一样体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽可能在EP管中将不一样浓度药品配好，然后将96孔板中培养上清去掉（能够用排枪吸走）再加入100ul含不一样浓度药品培养基，这么能确保药品浓度正确。另外，需注意是，假如用这种方法，不要把96孔板培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免因为96孔板干燥引发细胞死亡。4.5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药品作用效果。下图为一经典药品梯度为细胞毒性作用。5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药品和MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT培养液。 6. 终止培养，准备溶解结晶。l 溶解结晶方法有两种，第一个，用DMSO溶解1) MTT加入培养4h后，结晶可充足形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有些人直接用移液器将上清移走，也有些人提议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这么上清便被滤纸吸走，以降低结果损失。个人认为，这两种方法全部有可能造成结晶损失，从而引发结果不正确。采取哪种方法，能够自己探索一下再决定。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充足溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔吸光值。l 另一个方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）1) MTT加入培养4h后，结晶可充足形成。这种方法细胞上清能够不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（该溶解液因含有SDS，在低温保留时候易产生结晶，所以在用之前必需提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。）2) 放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。假如紫色结晶较小较少，溶解时间会短部分。假如紫色结晶较大较多，溶解时间会长部分。在实际操作过程中，往往为了等候46小时，使得试验者在下班以后或晚上来测OD值，给试验者带来了很大不方便。个人曾经探索，加入溶解液后过夜再测对OD值基础无影响，但要注意是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就能够了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度药品溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。六、MTT结果分析相关怎样计算IC50 1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率举个例子：各药品浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值以下药品浓度ug/ml100502512.56.253.1250OD均值0.0800.0930.2360.3740.4410.5310.614公式中最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml药品，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率以下：药品浓度ug/ml100502512.56.253.125抑制率0.8690.8490.6160.3910.2820.135代入计算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655 IC50=45.186该药品IC50值为45.186ug/ml -/ MTT全部问题大汇总-试验前应明确问题1. 选择合适细胞接种浓度。通常情况下，96孔培养板一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但因为不一样细胞贴壁后面积差异很大，所以，在进行MTT试验前，要进行预试验检测其贴壁率、倍增时间和不一样接种细胞数条件下生长曲线，确定试验中每孔接种细胞数和培养时间，以确保培养终止致细胞过满。这么，才能确保MTT结晶形成酌量和细胞数呈线性关系。不然细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2. 药品浓度设定。一定要多看文件，参考她人结果再定个比较大范围先初筛。依据自己初筛结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！不然，可能你用时间和浓度根本不是药品有效浓度和时间。3. 时间点设定。在不一样时间点测定OD值，输入excel表，最终得到不一样时间点抑制率改变情况，画出改变曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好时间点（因为这个时候细胞增殖抑制表现最显著）。4. 培养时间。200ul培养液对于1045次方增殖期细胞来说，极难维持68h，假如营养不够话，细胞会由增殖期逐步趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液。5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽可能无菌操作，因为细菌也能够造成MTT比色OD值升高。6. 理论未必全部是正确。要依据自己实际情况调整。7. 试验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔全部要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不一样是对照孔加溶解药品介质，而加药组加入不一样浓度药品。8. 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高血清物质会影响试验孔光吸收值。因为试验本底增加，会试验敏感性。所以，通常选小于10%胎牛血清培养液进行。在呈色后，尽可能吸净培养孔内残余培养液。试验步骤贴壁细胞：1. 搜集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2. 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度药品，标准上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日早晨加药.通常5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.提议设5个，不然难以反应真实情况3. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药品和MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT培养液。5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充足溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔吸光值。7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度药品溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1. 搜集对数期细胞，调整细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 （储存液100ug/ml，需预试寻求最好稀释度，1：10-1：20）；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ul 1640）。2. 置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔吸光值）4. 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充足溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔吸光值。5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度药品溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。MTT配制MTT通常最好现用现配，过滤后4oC避光保留两周内有效，或配制成5mg/ml保留在-20度长久保留，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我通常全部把MTT粉分装在EP管里，用时候现配，直接往培养板中加，没必需一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用时候小心，有条件最好带那种透明簿膜手套.配成MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没相关系，毕竟时间较短，或你不放心时候能够把操作台上照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解，也有些人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方：NaCl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调ph 7.4定容1L