不同提取及扩增方法检测大肠杆菌DNA的性能比较.pdf

第 卷 第期湘潭大学学报(自然科学版)V o l N o 年月J o u r n a l o fX i a n g t a nU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)A p r D O I:/j i s s n X 引用格式:余小妹,钱纯亘,聂立波,等不同提取及扩增方法检测大肠杆菌D NA的性能比较J湘潭大学学报(自然科学版),():C i t a t i o n:YUX i a o m e i,Q I ANC h u n g e n,N I EL i b o,e ta l C o m p a r i s o no f t h ep e r f o r m a n c eo fd i f f e r e n te x t r a c t i o na n da m p l i f i c a t i o nm e t h o d sf o rd e t e c t i n gE s c h e r i c h i ac o l iD NAJ J o u r n a lo fX i a n g t a nU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n),():不同提取及扩增方法检测大肠杆菌D N A的性能比较余小妹,钱纯亘,聂立波,汤建新,吴力强,黄钊,易辉(湖南工业大学 生命科学与化学学院,生物医用纳米材料与器件湖南省重点实验室,湖南 株洲 ;深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司,广东 深圳 ;株洲市人民医院,湖南 株洲 )摘要:大肠杆菌O H 是一种危害性极大的食源性致病菌,为实现大肠杆菌O H 的快速检测,分别采用碱加热裂解法、T r i t o n X 加热裂解法、溶菌酶加十二烷基硫酸钠(S D S)裂解法、S D S加蛋白酶K裂解法及热裂解法种方法提取大肠杆菌O H 基因组D NA,考察了环介导等温扩增(L AMP)和实时荧光定量聚合酶链式反应(q P C R)扩增法对所提取D NA的检测效果,并建立最佳的核酸快速提取样品预处理方法结果表明,以碱加热裂解预处理提取的大肠杆菌O H 基因组D NA为检测样本时,L AMP扩增及q P C R扩增法的检测性能最好,检出限达到 C F U/m L,与常规商品化试剂盒提取所得菌液基因组D NA的检测性能一致所建立的碱加热裂解样品预处理方法耗时短、成本低,无须进行复杂的核酸提取,操作简单,可用于大肠杆菌O H 的快速检测关键词:大肠杆菌O H;L AMP;q P C R;碱加热裂解法;核酸提取中图分类号:Q 文献标志码:A文章编号:X()C o m p a r i s o no f t h ep e r f o r m a n c eo fd i f f e r e n t e x t r a c t i o na n da m p l i f i c a t i o nm e t h o d s f o rd e t e c t i n gE s c h e r i c h i a c o l iD N AY UX i a o m e i,Q I ANC h u n g e n,N I EL i b o,T ANGJ i a n x i n,WUL i q i a n g,HU ANGZ h a o,Y IH u i(H u n a nK e yL a b o r a t o r yo fB i o m e d i c a lN a n o m a t e r i a l sa n dD e v i c e s,C o l l e g eo fL i f eS c i e n c ea n dC h e m i s t r y,H u n a nU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,Z h u z h o u ,C h i n a;S h e n z h e nYHL OB i o t e c hC o,L t d,S h e n z h e n ,C h i n a;Z h u z h o uP e o p l esH o s p i t a l,Z h u z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:E s c h e r i c h i a c o l iO H i sah i g h l yh a z a r d o u sp a t h o g e n i cf o o d b o r n eb a c t e r i u m I no r d e rt oa c h i e v er a p i dd e t e c t i o no fE s c h e r i c h i ac o l iO H,f i v em e t h o d si n c l u d i n ga l k a l i n et h e r m a l l y s i s,T r i t o n X t h e r m a l l y s i s,l y s o z y m ew i t hS D S l y s i s,S D Sw i t hp r o t e i n a s eKl y s i s,a n dt h e r m a l l y s i sw e r eu s e dt oe x t r a c tg e n o m i cD NAo fE s c h e r i c h i ac o l iO H T h ed e t e c t i o ne f f e c t so f l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n(L AMP)a n dr e a l t i m e f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(q P C R)a m p l i f i c a 收稿日期:基金项目:湖南省重点研发计划(S K );湖南省自然科学基金(J J );湖南省教育厅优秀青年项目(B )通信作者:黄钊(),男,湖南常德人,工程师,硕士生导师 E m a i l:h u a n g z h a o c o mt i o nm e t h o d so nt h ee x t r a c t e dD NA w e r e i n v e s t i g a t e dt oe s t a b l i s ht h eo p t i m a ln u c l e i ca c i dr a p i de x t r a c t i o ns a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tu s i n gt h ee x t r a c t e dE s c h e r i c h i ac o l iO H g e n o m i cD NAo b t a i n e dt h r o u g ha l k a l i n et h e r m a l l y s i sp r e t r e a t m e n ta st h et e s t i n gs a m p l e,b o t hL AMPa n dq P C Ra m p l i f i c a t i o nm e t h o d s s h o w e d t h eb e s t d e t e c t i o np e r f o r m a n c e,w i t had e t e c t i o n l i m i t o f C F U/m L,c o n s i s t e n tw i t ht h ed e t e c t i o np e r f o r m a n c eo f g e n o m i cD NAo b t a i n e d f r o mc o n v e n t i o n a l c o mm e r c i a l k i t s T h ee s t a b l i s h e da l k a l i n e t h e r m a l l y s i s s a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o d i s t i m e e f f i c i e n t,c o s t e f f e c t i v e,w i t h o u t c o m p l e xn u c l e i ca c i de x t r a c t i o n,a n ds i m p l e t oo p e r a t e,w h i c hi ss u i t a b l e f o r r a p i dd e t e c t i o no fE s c h e r i c h i a c o l iO H K e yw o r d s:E s c h e r i c h i a c o l iO :H;L AMP;q P C R;a l k a l i n e t h e r m a l l y s i s;n u c l e i ca c i de x t r a c t i o n引言随着食源性疾病的暴发,食源性致病菌成为影响食品质量与安全的首要因素食源性致病菌是引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌,主要包括大肠杆菌O H、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、蜡样芽孢杆菌,其可直接或间接污染食品及水源,人经口感染可导致肠道传染病的发生,食物中毒以及畜禽传染病的流行大肠杆菌O H 是肠出血性大肠杆菌(EHE C)中最典型的一种,EHE CO H 为革兰氏阴性菌,无芽孢,有周鞭毛大多数菌株有荚膜,对低温有较高的耐受力,且具有耐酸性,个细菌即可引发感染感染大肠杆菌O H 后主要引起婴幼儿腹泻和出血性结肠炎,并发溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜,严重时导致死亡大肠杆菌O H 传播途径多样,其中以食源性传播为主,亦可通过水源性和接触性传播,如污染的生肉类、肉制品,未经过灭菌的牛奶,受污染的水果和蔬菜,被污染的饮用水和农田灌溉水等均易引发感染大肠杆菌O H 大肠杆菌O抗原是革兰氏阴性杆菌脂多糖的一部分,由许多重复的低聚糖单元组成,特异O抗原合成基因位于r f b基因簇内,r f b基因簇编码多种组装特异O抗原所需的酶 B i l g e等通过序列分析发现大肠杆菌O H 的特异基因r f b E,并推测大肠杆菌O H 的r f b E基因编码甘露醇合成酶目前检测大肠杆菌O H 的P C R方法常以r f b E为靶基因,且基于此基因编码的O抗原标志物在免疫学检测中应用广泛现有的大肠杆菌O H 检测方法主要有分离培养鉴定法、免疫学检测法、分子生物学检测法,以及以此类方法为基础发展起来的新型检测技术,如传感器技术、生物芯片技术等分离培养鉴定法包括增菌、分离、纯化、革兰氏染色、镜检和生化鉴定等一系列步骤,实验结果准确性较高,但耗时费力,随着分子生物学技术的不断发展,出现了许多针对微生物的快速检测方法免疫分析的检测依据是利用抗原和抗体的特异性反应,该检测方法具有灵敏度高、特异性强的优点,但容易出现假阳性、假阴性 分子生物学检测方法中聚合酶链式反应(P C R)、逆转录聚合酶链式反应(R T P C R)、实时荧光定量聚合酶链式反应(r e a l t i m eq P C R)等应用广泛 ,然而P C R技术一直无法摆脱对精密仪器设备的依赖、高洁净度操作环境、反应时间过长等局限自 世纪 年代以来,出现了多种等温核酸扩增技术,其特点是可以在固定的温度条件下实现核酸快速扩增和检测,由于反应不依赖热循环,检测成本大幅降低,且可实现对食品、农作物和病原体等现场快速检测,极大提高检测效率目前常用的等温扩增技术包括依赖核酸序列扩增(NA S B A)、环介导等温扩增(L AMP)、依赖解旋酶扩增(HD A)、重组酶聚合酶扩增(R P A)等 第期余小妹,等不同提取及扩增方法检测大肠杆菌D NA的性能比较L AMP最早由N o t o m i等人提出 ,特点是针对靶基因的个区域设计种特异引物进行扩增反应,在链置换酶B s tD NA聚合酶(B s tD NAp o l y m e r a s e)的作用下,与特殊设计的引物形成茎环结构,在 温度下保持恒温 m i n即可实现核酸扩增,具有快速、简易、高特异性、不依赖昂贵仪器设备的优点目前,L AMP扩增产物的检测方法主要有比浊法、紫外荧光法和琼脂糖凝胶电泳法 L AMP扩增时会产生焦磷酸镁乳白色沉淀副产物,可在扩增的终末阶段肉眼观察乳白色沉淀判断扩增有效性,也可通过浊度仪实时监测浊度变化进行检测;紫外荧光法检测时在反应管中加入S Y B RG r e e nI或其他染料,通过紫外照射下的颜色变化判定检测效果;琼脂糖凝胶电泳法是取L AMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像分析进行结果判读,基因组D NA的提取质量直接影响核酸扩增的结果,进而影响到检测速度、灵敏度、检测限等.因此,探索简单、快速的基因组D NA提取方法将有助于提高微生物的现场快速检测效率目前基于酶法裂解的试剂盒是提取微生物基因组D NA的常用方法,但其成本高、纯化步骤多,耗时长 本研究拟采用碱加热裂解法、T r i t o n X 加热裂解法、溶菌酶加十二烷基硫酸钠(S D S)裂解法、S D S加蛋白酶K裂解法及热裂解法种方法对大肠杆菌溶液进行预处理,提取菌液基因组D NA,并与商用核酸提取试剂盒提取的核酸作为对比通过考察不同方法所提取D NA的L AMP扩增和q P C R扩增检测效果,筛选出一种简便、高效、快速、灵敏的核酸提取样本处理方法,为实现大肠杆菌不同应用场景下的高效灵活检测提供技术参考实验部分 材料 菌种本研究所用大肠杆菌O H 菌株由南京农业大学生命科学学院王卉教授惠赠 主要试剂和仪器)试剂N a OH、HC l、T r i t o n X 、十二烷基硫酸钠(S D S)、N a C l,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;琼脂粉、溶菌酶、d NT P s,生工生物工程(上海)股份有限公司;B s tD NA聚合酶、M g S O、xL AMP反应缓冲液,德国Q I AG E N公司;L AMP荧光染料,N e w E n g l a n dB i o l a b(北京)公司;酵母提取粉,胰蛋白胨,英国O X O I D公司;H i S c r i p t I I IUO n eS t e pq P C R试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;琼脂糖,蛋白酶K,磁珠法通用型基因组D NA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司;引物和探针由安徽通用生物合成;溶液配制:gN a C l,g胰蛋白胨,g酵母提取粉,加蒸馏水定容至 m L配制成L B液体培养基;gN a C l,g胰蛋白胨,g酵母提取粉,g琼脂粉,加蒸馏水定容至 m L配制成L B固体培养基)仪器高速冷冻离心机,R型,德国E p p e n d o r f公司;涡旋振荡器,S V E U,美国L a b n e t公司;触屏式金属浴,型,美国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司;实时定量q P C R仪,Q u a n t S t u d i o型,美国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司;电泳仪,P o w e r p a cB a s i c型,B i o R a d公司;凝胶电泳成像系统,J P 型,上海金鹏分析仪器有限公司;电热恒温培养箱,GH P N型,上海一恒科学仪器有限公司;摇床,MQT HR型,上海旻泉仪器有限公司;实验室超纯水仪,C a s c a d a ,美国P A L L公司湘潭大学学报(自然科学版)年 方法 大肠杆菌的培养及计数将大肠杆菌菌种接种于已灭菌的L B培养基中,于 r/m i n摇床震荡培养过夜将菌液用蒸馏水按 倍梯度稀释,取 L稀释 倍后的菌液在L B固体平板上进行涂布,放入恒温培养箱中,培养过夜,记录平板菌落数 L AMP及q P C R扩增引物的设计通过查阅相关文献获取可用于鉴定大肠杆菌的特异性基因 ,该基因为r f b E基因(G e n b a n k登录号为A F ),其核苷酸序列如图所示,该基因为大肠杆菌特有以该基因为模板利用引物设计网站L AMPp r i m e rd e s i g n i n gs o f t w a r eP r i m e r E x p l o r e r(h t t p:/p r i m e r e x p l o r e r j p/e/)设计L AMP扩增引物,包括一对外引物和一对内引物,外引物为F、B,内引物为F I P(F 和F)和B I P(B 和B);实验所用q P C R引物来源于参考文献,包括两条引物(F和R)和一条探针(P),引物序列如表所示图r f b E基因序列及引物组每条引物在基因中的位置图F i g r f b Eg e n e s e q u e n c ea n dp r i m e r s e t l o c a t i o nm a po f e a c hp r i m e r i nt h eg e n e表L AMP和q P C R引物序列表T a b s e q u e n c eo fL AMPa n d q P C Rp r i m e r s引物序列L AMP引物组引物组引物组 F T G GAA T G G T T G T C A C GAA B A G C AA T T T C A C G T T T T C G T F I PT T G C C T A T G T A C A G C T AA T C C T T G T GA C AAAA C A C T T T A T GA C C G B I PA T T G G C A T GA C G T T A T AG G C T A C G C T T G T T C T AA C T G G G C T AA F C C A G T T A GAA C AA G C T GA T GA B G T T T C GA T GA G T T T A T C T G C A F I PG T G GA C T T G T A C AA GA C T G T T GA T A T AT C A C GAAAA C G T GAAA T T G C B I PT T C A C A C T T A T T G GA T G G T C T C AA T G G T GA T T C C T T AA T T C C T C T C T T F C C A G T T A GAA C AA G C T GA T GA B G G C C T T G T T T C GAT GA G T T F I PC T T G T G GA C T T G T A C AA GA C T G T C GAAAA C G T GAAA T T G C T GA B I PT T C A C A C T T A T T G GA T G G T C T C AA T G G T GA T T C C T T AA T T C C T C T C Tq P C R引物FT G T T C C AA C A C T GA C AT A T A T A G C A T C A引物RC A GA C A T T T G C C AA G T T T C A T T A T C T探针PF AM A C A C AG GA G C C A C C C C C A T T T T C G T B HQ 第期余小妹,等不同提取及扩增方法检测大肠杆菌D NA的性能比较 L AMP扩增引物的筛选 L的L AMP反应体系包括:外引物(F 和B)各含 m o l/L,内引物(F I P和B I P)各含 m o l/L,UB s tD NA聚合酶,mm o l/Ld NT P s,mm o l/L M g S O,xL AMPb u f f e r,xL AMP荧光染料,D NA模板,d d HO,同时用无污染的无酶水代替D NA模板设置一个 阴性对照 L AMP反应体 系配制好 后放入q P C R仪中,设置程 序为 ,m i n,每个循环 s 为了验证样本预处理方法的可适用性,处理完的模板同时进行q P C R扩增对比,Lq P C R反应体系包括:xO n e S t e pUM i x(诺唯赞),xE n z y m e M i x(诺唯赞)、前引物(F)、后引物(R)、探针(P)各含m o l/L,d d HO,同时用无污染的无酶水代替D NA模板作为阴性对照反应体系配制后放入q P C R仪中,设置反应程序为 预变性 s,变性 s和 退火并延伸 s,反应 个循环 L AMP扩增产物验证L AMP扩增反应完成后将产物放入金属浴中,m i n终止反应,然后取部分产物进行凝胶电泳检测,浓度的琼脂糖凝胶,上样量为L,V恒压电泳 m i n,观察是否有条带来验证引物的可用性 样品预处理方法筛选参考其他文献研究所用方法并作改进 :选取一个高浓度(C F U/m L)和低浓度(C F U/m L)的大肠杆菌菌液作为样本,取 m L菌液,r/m i n,离心m i n,去掉上清,分别采用表中方法b,碱加热裂解;方法c,T r i t o n X 加热裂解;方法d,溶菌酶S D S;方法e,S D S 蛋白酶K;方法f,热裂解种样品预处理方法处理,处理后的样本 r/m i n,离心m i n,收集上清液作为扩增模板,以商品化试剂盒(磁珠法,天根生化,方法a)提取的核酸作为对照,根据L AM P和q P C R扩增结果筛选出合适的样品预处理方法表不同预处理方法的主要步骤T a b m a i ns t e p s o fd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n tm e t h o d s方法步骤文献方法a根据试剂盒的操作说明进行D NA的提取方法b加入 L mm o l/LN a OH后混匀,置于金属浴上 加热 m i n,加入 L mm o l/LHC l中和 方法c加入 L (v/v)T r i t o n X 水溶液混匀,置于金属浴上 加热 m i n 方法d L m g/m L溶菌酶,混匀后放于金属浴上 处理 m i n,再加入 L(v/v)S D S水溶液,混匀后室温放置m i n,最后加入 Lmm o l/LN a C l 方法e加入 L蛋白酶K(m g/m L)和 L(v/v)S D S水溶液,混匀,加热 m i n,加热m i n 方法f加入 L蒸馏水后放于金属浴上 加热 m i n 样品预处理方法的处理条件优化根据筛选结果选取两种核酸提取效果较好的样品处理方法,改变处理试剂浓度,其他条件不变,优化出最适处理浓度筛选出的方法为方法b和方法c(见下文),方法b的条件优化测试为以一个高浓度(C F U/m L)和低浓度(C F U/m L)的大肠杆菌菌液作为样本,选择浓度依次为 mm o l/L、mm o l/L、mm o l/L、mm o l/L的N a OH对菌液样本进行处理,随后进行L AMP扩增方法c的条件优化则用浓度依次为(v/v)、(v/v)、(v/v)、(v/v)的T r i t o n X 处理菌液样本,最后进行L AMP扩增对比湘潭大学学报(自然科学版)年 添加组分对扩增反应的抑制性为了检测筛选出的样品处理方法所添加试剂是否对L AMP扩增反应体系有影响,进行了抑制性实验,以商品化试剂盒(方法a)提取的D NA作为模板,在L AMP反应体系中添加不同处理方法的试剂,试剂的浓度为上清液模板中的最终浓度,以验证添加组分对扩增反应的影响方法b预处理 菌液样本时,菌液 样本中添加 mm o l/L N a OH后 再 添 加 等 体 积 的 mm o l/LHC l,中和后为 mm o l/LN a C l,故在L AMP反应体系中分别添加 mm o l/L、mm o l/L、mm o l/L、mm o l/L的N a C l(终浓度),考察N a C l浓度对L AMP扩增的影响;方法c预处理菌液样本时,菌液样本中添加 (v/v)T r i t o n X ,故在L AMP反应体系中分别添加(v/v)、(v/v)、(v/v)、(v/v)T r i t o n X (终浓度),考察T r i t o n X 浓度对L AMP扩增的影响 样品预处理方法的检出限对比用灭菌蒸馏水将原始浓度的菌液样本按 倍梯度稀释,用不同样本预处理方法进行前处理,随后进行L AMP扩增和q P C R扩增的检出限对比,最终筛选出一个最优处理方法 实际样本的检测将过夜培养的菌液用纯净水稀释成不同浓度(C F U/m L C F U/m L),模拟实际样本中的大肠杆菌浓度,用所筛选的预处理方法对其进行处理以及L AMP扩增检测,再与商品化试剂盒(方法a)提取的菌液核酸的q P C R扩增检测结果进行对比,计算出所筛选方法的检测灵敏度、特异性和总符合率结果与讨论 L AMP扩增引物的筛选及产物验证对设计的大肠杆菌L AM P扩增引物进行筛选,从中选择扩增曲线良好,出峰时间快的引物,同时扩增产物进行电泳分析以验证引物的可用性引物筛选结果如图所示,第组和第组引物扩增效果较差,第组引物没有扩增信号产生,第组引物只在 C F U/m L和 C F U/m L浓度下出现扩增信号,且循环阈值(C t)较大,第组引物个样本浓度均出现扩增信号,C t值较小,且以无污染的无酶水为扩增模板的阴性对照组(n t c)没有出现非特异性扩增;随后对第组引物的扩增产物进行凝胶电泳检测,结果如图所示由于L AM P扩增后可以产生大量具有不同长度、不同数目茎环结构和反向重复序列的D N A混合物,导致琼脂糖凝胶电泳呈现出长短不一的梯形条带,且以无污染的无酶水为扩增模板的阴性对照组(n t c)没有出现条带,与文献报道的一致,说明该引物没有发生非特异性扩增,可用于后续的检测020406080循环数020406080循环数020406080循环数107106105ntc107106105ntc107106105ntc5.004.003.002.001.000.00荧光强度5.004.003.002.001.000.00荧光强度5.004.003.002.001.000.00荧光强度(a)(b)(c)105105105图(a)引物组;(b)引物组;(c)引物组 大肠杆菌浓度分别为 C F U/m L,C F U/m L和 C F U/m LF i g (a)P r i m e r s e t;(b)P r i m e r s e t;(c)P r i m e r s e t T h ec o n c e n t r a t i o n so fE s c h e r i c h i a c o l iw e r e C F U/m L,C F U/m La n d C F U/m L,r e s p e c t i v e l y第期余小妹,等不同提取及扩增方法检测大肠杆菌D NA的性能比较2 0001 000500250长度/bp1 0007 0004 000图引物组L AMP扩增产物验证,泳道:M a r k e r,C F U/m L样本L AMP扩增产物,C F U/m L样本L AMP扩增产物,阴性对照组(无污染的无酶水为扩增模板)F i g P r i m e r s e t L AMPa m p l i f i c a t i o np r o d u c t v e r i f i c a t i o n,L a n e s :M a r k e r,L AMPa m p l i f i c a t i o np r o d u c t o f C F U/m Ls a m p l e,L AMPa m p l i f i c a t i o np r o d u c t o f C F U/m Ls a m p l e,n e g a t i v ec o n t r o l g r o u p(u n c o n t a m i n a t e de n z y m e f r e ew a t e ra s a m p l i f i c a t i o nt e m p l a t e)样品预处理方法的筛选采用不同样品预处理方法(方法b至方法f)处理菌液样本,并以商品化试剂盒(方法a)提取样本核酸作为对照,考察不同样品预处理方法处理后的L AMP扩增及q P C R扩增效果L AMP扩增效果如图所示0204060800204060800204060806.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度a(107)a(104)ntca(107)a(104)b(107)b(104)ntca(107)a(104)c(107)c(104)ntc106106106020406080循环数020406080循环数020406080循环数6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度a(107)a(104)d(107)d(104)ntca(107)a(104)c(107)c(104)ntca(107)a(104)f(107)f(104)ntc106106106循环数循环数循环数图(a)方法aL AMP扩增;(b)方法b与方法aL AMP扩增对比;(c)方法c与方法aL AMP扩增对比;(d)方法d与方法aL AMP扩增对比;(e)方法e与方法aL AMP扩增对比;(f)方法f与方法aL AMP扩增对比大肠杆菌浓度分别为 C F U/m L和 C F U/m LF i g (a)L AMPa m p l i f i c a t i o no fm e t h o da;(b)C o m p a r i s o no fL AMPa m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dba n dm e t h o da;(c)C o m p a r i s o no fL AMPa m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dca n dm e t h o da;(d)C o m p a r i s o no fL AMPa m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dda n dm e t h o da;(e)C o m p a r i s o no fL AMPa m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dea n dm e t h o da;(f)C o m p a r i s o no fL AMPa m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dfa n dm e t h o da T h ec o n c e n t r a t i o n s o fE s c h e r i c h i a c o l iw e r e C F U/m La n d C F U/m L,r e s p e c t i v e l y湘潭大学学报(自然科学版)年图结果表明方法b、方法c和方法f处理后的L AMP扩增效果均比商品化试剂盒(方法a)好,C t值较小,检测时间缩短,但实验结果显示方法f的L AMP扩增检出限较高(数据未给出),推测是处理步骤过于简单,细胞裂解后残留物对L AMP扩增抑制较大;方法d处理后C t值相比商品化试剂盒偏大;方法e没有出现扩增信号,可能是方法e的细胞裂解效果较差或所添加成分对L AMP反应体系有影响q P C R扩增效果如图所示,方法b、方法c和方法f都出现扩增信号,说明这几种预处理方法均可适用于q P C R扩增检测,但方法b和方法c在高浓度和低浓度菌液样本的C t值都大于方法a,仅方法f在低浓度菌液样本的C t值与方法a相当方法d中只有低浓度菌液样本出现孔信号,且C t值较大,可能是方法d处理后的样本会对q P C R扩增体系产生影响;方法e中高浓度和低浓度菌液样本都没有出现扩增信号,推测方法e的细胞裂解效果较差为保证所筛选的样本预处理方法的通用性,综合L AMP扩增及q P C R扩增效果,选择方法b和方法c进行下一步实验6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度010203040循环数010203040循环数010203040循环数a(107)a(104)ntca(107)a(104)b(107)b(104)ntca(107)a(104)c(107)c(104)ntc1051051056.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度6.005.004.003.002.001.000.00荧光强度010203040循环数010203040循环数010203040循环数a(107)a(104)d(107)d(104)ntca(107)a(104)c(107)c(104)ntca(107)a(104)f(107)f(104)ntc105105105图(a)方法aq P C R扩增;(b)方法b与方法aq P C R扩增对比;(c)方法c与方法aq P C R扩增对比;(d)方法d与方法aq P C R扩增对比;(e)方法e与方法aq P C R扩增对比;(f)方法f与方法aq P C R扩增对比大肠杆菌浓度分别为 C F U/m L和 C F U/m LF i g (a)q P C Ra m p l i f i c a t i o no fm e t h o da;(b)C o m p a r i s o no fq P C Ra m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dba n dm e t h o da;(c)C o m p a r i s o no fq P C Ra m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dca n dm e t h o da;(d)C o m p a r i s o no fq P C Ra m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dda n dm e t h o da;(e)C o m p a r i s o no fq P C Ra m p l i f i c a t i o nb e t w e e nm e t h o dea n dm e t h o da;(f)C o m p a r i s o no fq P C Ra m p l i f i c a t i o n