砖红镰刀菌菌株Pa2对草莓灰霉病的抑制作用.pdf

40(1)137-145 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期：2023-07-26 基金项目：国家重点研发计划（2022YFD1600702）；中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2016-RIP）；中国农业科学院郑州果树研究所科研业务费专项（ZGS202205 and 1610192023311）作者简介：*共同第一作者：史冰柯，硕士研究生，E-mail：；李晓倩，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，侯珲，副研究员，E-mail：；袁洪波，助理研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2024.02.001 砖红镰刀菌菌株Pa2对草莓灰霉病的抑制作用 史冰柯1*，李晓倩1*，王卓妮1，覃艮红1，范洋洋1，王 丽1，涂洪涛1,2，袁洪波1*，侯 珲1*（1.中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009；2.中国农业科学院中原研究中心，新乡 453004）摘要：由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的草莓灰霉病是草莓栽培中最具破坏性的病害之一，严重降低食用以及经济价值。本研究以“红颜”草莓为试验材料，测定砖红镰刀菌 Fusarium lateritium Pa2 对草莓灰霉病菌的抑菌活性、防治效果以及草莓病程相关基因表达水平的影响。结果表明，菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌具有显著的抑菌活性，其上清液可以破坏草莓灰霉病菌菌丝细胞膜，导致细胞内容物泄露。离体接种试验结果表明菌株 Pa2 对草莓叶片灰霉病、草莓果实灰霉病防治效果分别为 79.13%、54.29%。经菌株 Pa2 上清液处理 24 h 后草莓果实病程相关基因 FaPR1、FaPR4、FaGR 分别上升 19.05、24.64、3.69 倍。综上所述，砖红镰刀菌菌株 Pa2 是一种防治草莓灰霉病的新型生防菌资源。关 键 词：草莓灰霉病；砖红镰刀菌；病程相关基因；防治效果 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2024)01-0137-09 Inhibitory Effect of Fusarium lateritium Pa2 against Strawberry Gray Mold SHI Bingke1*,LI Xiaoqian1*,WANG Zhuoni1,QIN Genhong1,FAN Yangyang1,WANG Li1,TU Hongtao1,2,YUAN Hongbo1*,HOU Hui1*(1.Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,China;2.Zhongyuan Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Xinxiang 453004,China)Abstract:Strawberry gray mold caused by Botrytis cinerea is one of the most destructive diseases in strawberry cultivation,which seriously reduces the edible and economic value.In this study,Hongyan strawberries were used as experimental materials to determine the effects of Fusarium lateritium Pa2 on the inhibitory activity and control of gray mold pathogen,as well as the effects on the pathogenesis-related genes expression levels of strawberry fruit.The results showed that strain Pa2 had significant antifungal activity against B.cinerea.The supernatant of strain Pa2 could damage the mycelial cell membrane of B.cinerea,leading to leakage of cell contents.The results of inoculation experiments indicated that the control effects of strain Pa2 on strawberry leaves gray mold and strawberry fruits gray mold were 79.13%and 54.29%,respectively.In addition,the strawberry fruits pathogenesis-related genes FaPR1,FaPR4,and FaGR increased by 19.05,24.64,and 3.69 times at 24 hours post treatment with supernatant of strain Pa2,respectively.In conclusion,the F.lateritium strain Pa2 is a new biocontrol resource for controlling strawberry gray mold.Key words:strawberry gray mold;Fusarium lateritium;pathogenesis-related genes;control effect 草莓是一种重要的、高价值的植物，在世界各地均有种植1,2。草莓果实富含糖、膳食纤维、维生素和氨基酸，可加工成各种副产品，具有较高的经济价值3。然而，草莓在收获前和收获后都很容易受到微生138 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 物感染，尤其是真菌感染对草莓的经济效益影响最大。其中，由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的草莓灰霉病是草莓栽培中最具破坏性的病害之一，通常导致产量下降 10%25%，严重时甚至下降 50%以上4,5，草莓灰霉病病症初期出现棕色斑点，然后扩展到整个水果并出现灰色或灰褐色霉层6，对植物造成严重的损害或死亡，在储存、运输和销售过程中造成巨大的经济损失7。多年来，化学农药一直是控制草莓灰霉病最有效的策略8。然而，频繁和大规模使用杀菌剂会导致越来越严重的“3R”问题（抗性、猖獗和残留）9。因此，迫切需要寻找新的策略或替代化学杀菌剂来控制草莓灰霉病，内生菌防治性病害的作用机制包括空间与营养竞争、抗生作用、诱导植物系统抗病性以及分泌抗菌物质等10-12。内生菌可作为激发子诱导植物抗性，植物受到病原菌侵染后产生并积累植物病程相关蛋白，编码病程相关蛋白的基因表达量显著上调，其中 PR 作为病程相关基因，与植物的抗病性密切相关13。汪开拓等14研究发现经-氨基丁酸（-aminobutyric acid，BABA）处理后再接种灰葡萄孢菌的草莓果实Fa NPR1、Fa PR1 基因表达量变化趋势与单一灰葡萄孢菌接种组基本一致，但这 2 种 PRs 基因的表达量显著上升，同时显著诱导了草莓果实活性氧代谢系统和 As A-GSH 循环中关键基因 SOD、POD、CAT、GR基因的表达。窦国霞等15研究发现葡萄汁有孢汉逊酵母 Hanseniaspora uvarum 处理接种灰葡萄孢的草莓果实后，水杨酸 SA 信号通路相关基因 PR1 表达丰度在接种后 1224 h 内显著上调，PR1 的表达量在 12 h时是单独灰葡萄孢菌处理的 2.9 倍。并且由于微生物对环境的影响较温和和控制源的无毒性质，因此利用微生物对灰葡萄孢菌进行生物防治已被认为是化学防治方法的一种有效的替代方法。目前用于防治草莓灰霉病的生防菌株主要包括木霉菌 Trichoderma spp.、哈茨木霉菌 T.harzianum、尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum、葡萄汁有孢汉逊酵母 H.uvarum 等6,15-17。内生真菌砖红镰刀菌 F.lateritium作为生防菌已有少量报道，如 Zhong 等18研究发现内生砖红镰刀菌 HU0053 对柑桔绿霉病菌 Penicillium digitatum 具有较强的抗真菌活性，但砖红镰刀菌对草莓灰霉病的防治研究鲜少报道。因此本次实验目的是测定砖红镰刀菌对草莓灰霉病菌细胞膜、抗病防卫基因表达调控的影响以及对草莓灰霉病的防治效果。1 材料与方法 1.1 材料 试验所用草莓品种为“红颜”，选取大小一致、健康草莓；供试菌株：草莓灰霉病菌保存在中国农业科学院郑州果树研究所19，内生菌砖红镰刀菌菌株 Pa2 是从苹果枝条上分离获得，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.40605。供试培养基及试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉 6 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至 1000 mL，pH 7.0，马铃薯葡萄糖培养基（PDB）：马铃薯浸粉 6 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水定容至 1000 mL，pH 7.0；咪鲜胺（有效成分 450 g/L，深圳诺普信农化股份有限公司）。供试仪器：TGL-16 高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、MJX-260 HS 智能霉菌培养箱（宁波扬辉仪器有限公司）、TCS SP5 激光共聚焦显微镜（德国LEICA 公司）、RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、Thermo NANODROP 1000 紫外分光光度计（上海群基实验仪器技术有限公司）。1.2 菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌的抑菌活性 采用平板对峙法测定菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌的抑菌能力。在 PDA 平板中央接种直径 0.5 cm 的草莓灰霉病菌菌饼，四周各放置一块相同大小的菌株 Pa2 菌饼，每处理 3 个皿，重复 3 次。对照组仅放置草莓灰霉病菌，在 25 培养箱中黑暗培养 3 d，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率（%）=（对照组菌落直径处理组菌落直径）/（对照组菌落直径0.5）100。1.3 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌的抑制作用 用直径为 0.5 cm 的打孔器从培养 3 d 的 Pa2 菌落边缘取 5 个菌饼，接种于 100 mL 的 PDB 培养基中，在 25、180 r/min 摇床中培养 7 d，得到孢子悬浮液，然后 4000 r/min 离心 20 min，经 0.22 m 滤膜过滤后得到无菌上清液。将不同体积上清液与冷却至 50 左右的 PDA 培养基混合配制成终浓度为 5%、10%、20%上清液培养基，以不含上清液的 PDA 平板作为对照，平板中央接种草莓灰霉病菌菌饼（直径为 0.5 cm），在 25 培养箱黑暗培养 3 d，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度下的菌丝生长抑制率，每处理 第 1 期 史冰柯等：砖红镰刀菌菌株 Pa2 对草莓灰霉病的抑制作用 139 3 个皿，重复 3 次。1.4 菌株 Pa2 上清液粗提物对草莓灰霉病菌的抑制作用 菌株 Pa2 上清液获取方法同 1.3。将上清液在旋转蒸发仪中浓缩 810 倍，用 2 倍体积的乙酸乙酯萃取两次，收集有机相，再次在旋转蒸发仪中旋转蒸干，获得萃取物后使用甲醇溶解配置成 10 mg/mL 粗提物溶液备用。采用牛津杯抑菌试验法测定粗提物抑菌效果，在 PDA 平板中四周分别放入一个牛津杯，每个牛津杯中加入 50 L 粗提物溶液，中央放置草莓灰霉病菌，无菌水以及甲醇溶剂作为对照，25 培养 3 d后测量菌落直径。1.5 菌株 Pa2 对草莓灰霉病的防治作用 参照袁洪波等20方法测定菌株 Pa2 对草莓灰霉病的防治效果。选取健康大小一致草莓叶片及果实用无菌水冲洗干净，晾干后将叶片以及果实浸泡于菌株 Pa2 孢子悬浮液（孢子浓度为 1106 CFU/mL）中 10 s，将直径为 0.5 cm 的草莓灰霉病菌菌饼正面贴于接种点上，无菌水处理作为阴性对照，咪鲜胺（稀释 1000倍）处理作为阳性对照。用蘸无菌水的脱脂棉保湿，于 25 下培养箱中放置 5 d 时测量病斑长度，并拍照。每处理接种 10 个病斑，重复 3 次，统计不同处理的病斑大小，计算发病率和防治效果。发病率（%）=发病点数/总接种点数100；防治效果（%）=（对照病斑长度处理病斑长度）/对照病斑长度100。1.6 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌菌丝细胞膜的影响 挑取少量草莓灰霉病菌菌丝对照组置于 PDB 培养基中，处理组置于菌株 Pa2 上清液中，25 培养箱放置 6 h，分别挑取少量菌丝浸泡于浓度为 1 mol/L 的死细胞绿菁 SYTOX 染色 5 min，用清水洗去表面染料，将菌丝置于载玻片上，在 TCS SP5 激光共聚焦显微镜下观察菌丝变化。1.7 草莓灰霉病菌细胞膜通透性的影响 草莓灰霉病菌细胞膜通透性可通过测定细胞 OD260、OD280数值大小以判定21，将草莓灰霉病菌接种于 PDB 中，25、180 r/min 培养 3 d 后将培养发酵液收集至 50 mL 离心管中，4000 r/min 离心 10 min，弃上清收集底部菌丝，用无菌水清洗两遍后称取湿菌丝 2 g，分别置于 20 mL 含 10%和 20%的 Pa2 上清液的无菌水中，放回摇床中继续培养，以不含上清液为对照，分别在 0、6、12、24、48 h 取样，使用紫外分光光度计对各处理的 OD260、OD280进行测定。1.8 菌株 Pa2 上清液对草莓果实病程相关基因表达水平的影响 选取健康草莓果实，对照组喷施 PDB 培养基，处理组喷施 Pa2 上清液，分别在处理 0、12、24 h 时取果实表皮，提取总 RNA。采用 MonScriptTMRTII AII-in-Ome Mix with dsDNase 试剂盒逆转录成 cDNA，qRT-PCR 操作步骤按照 MonAmp ChemoHSqPCR 试剂盒使用说明进行，以 FaAction 作为内参基因，每个处理设置 3 个生物学重复，采用 2Ct算法计算基因相对表达量，使用（表 1）的引物测定病程相关基因 FaPR1、FaPR4 以及 FaGR 的表达量15,22,23，所用基因引物由河南尚亚生物技术有限公司合成。1.9 数据统计与分析 实验数据采用 Excel 2016 和 SPSS 26.0 软件进行统计分析，采用 Duncan 法进行数据分析。表 1 相关基因引物设计 Table 1 Primer design of related genes 基因 Gene 引物 Primer 引物序列 Primer sequence(5-3)FaActin-F GCTAATCGTGAGAAGATGAC FaActin FaActin-R AGCACAATACCAGTAGTACG FaPR1-F ACATGGGATGCCAATCTAGC FaPR1 FaPR1-R CCACAGGTTCACAGCAGATG FaPR4-F TCGTGTTCTTGGTGATGTTGTG FaPR4 FaPR4-R TGCGGGTTGTAGAGGTGGT FaGR-F CTGGTCGGGTTCCCAATTCA FaGR FaGR-R ATCCGGTTTGCTAGGTTCCC 140 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 2 结果与分析 2.1 菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌的抑菌活性 在平板对峙试验中对照组草莓灰霉病菌平均直径为 7.77 cm，经菌株 Pa2 处理后草莓灰霉病菌直径为平均 1.83 cm（图 1A），与对照相比有明显差异，对草莓灰霉病菌平均生长抑制率为 76.38%。显微镜下观察菌丝形态结果显示，草莓灰霉病菌菌丝与对照相比菌丝明显弯曲并伴有内容物泄露（图 1B，C）；以上结果表明菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌具有抑菌活性，同时能够破坏草莓灰霉病菌菌丝形态。A：菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌的抑制作用 Inhibition effect of strain Pa2 on B.cinerea；B：对照草莓灰霉病菌菌丝 Control mycelia of B.cinerea；C：菌株 Pa2 拮抗处理 Mycelia of B.cinerea treated with Pa2 图 1 菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌的拮抗作用 Fig.1 Antagonistic effect of strain Pa2 on B.cinerea 2.2 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌的抑制作用 由图 2A 可知，菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌生长具有抑制作用。测量结果显示草莓灰霉病菌对照菌落直径为 7.61 cm，含 5%、10%和 20%的上清液培养基中菌落直径分别为 4.22、2.57 和 1.97 cm（图 2B），菌丝生长抑制率分别为 44.57%、66.27%和 74.10%（图 2C）。统计结果显示，处理组与对照组相比有显著 10%5%对照 Control20%012345678对照 Control01020304050607080菌落直径 Colony diameter(cm)10%5%20%10%5%20%抑制率 Inhibition(%)BCAabcdcba A：菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌菌丝生长的影响 Inhibition of strain Pa2 supernatant on mycelial growth of B.cinerea；B：不同处理菌落直径 Colony diameter；C：菌丝生长抑制率 Inhibition rate of mycelial growth 注：图中数据为平均数标准差，不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在 P0.05 水平差异显著。Note:Data are meanSD,data with different letters indicate significant difference at P0.05 level by Duncans multiple range test.图 2 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌的抑制作用 Fig.2 Inhibition effect of strain Pa2 supernatant on B.cinerea 第 1 期 史冰柯等：砖红镰刀菌菌株 Pa2 对草莓灰霉病的抑制作用 141 差异，且各个浓度之间也存在显著差异。结果表明菌株 Pa2 上清液含有抑菌物质，且上清浓度与抑菌效果具有正相关性。2.3 菌株 Pa2 上清液粗提物抑菌效果 将获得的粗提液进行平板对峙试验结果显示，甲醇溶剂粗提物对草莓灰霉病菌生长无影响，测量对照组草莓灰霉病菌菌落直径为 7.77 cm，上清液粗提物处理后菌落直径为 3.13 cm，对菌落生长抑制率为59.67%（图 3），能够抑制病菌生长，表明上清液粗提物中含有抑菌活性物质。对照 ControlPa2甲醇 Methanol 图 3 菌株 Pa2 上清液粗提物对草莓灰霉病菌的影响 Fig.3 Effect of crude extract from the supernatant of strain Pa2 on B.cinerea 2.4 菌株 Pa2 孢子悬浮液对草莓灰霉病菌的防治作用 利用离体草莓叶片测定菌株 Pa2 对草莓灰霉病的防治效果显示，在草莓叶片接种草莓灰霉病菌 5 d 时对照病斑长度达 2.25 cm，经 Pa2 孢子悬浮液处理之后病斑长度为 0.47 cm，且发病率显著小于对照组，（图4，表 2）。在草莓果实接种灰霉病菌 5 d 时对照病斑长度达 1.98 cm，经 Pa2 孢子悬浮液处理之后病斑长度为 0.90 cm，且发病率显著小于对照组。统计结果显示，在叶片和果实上，菌株 Pa2 孢子悬浮液对草莓灰霉病的防效分别 79.13%和 54.29%，与对照相比有显著差异（表 2）。经咪鲜胺处理后的叶片及果实未出现病症（图 4）。以上结果表明，菌株 Pa2 孢子悬浮液能够显著降低病斑扩展的程度，对草莓灰霉病有较好的防治效果。1 cm1 cm对照 ControlPa2对照 ControlPa2咪鲜胺 Prochloraz咪鲜胺 Prochloraz草莓叶片Strawberry leaves草莓果实Strawberry fruits 图 4 菌株 Pa2 对草莓灰霉病的抑制作用 Fig.4 Inhibitory effect of strain Pa2 on strawberry gray mold 142 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 表 2 菌株 Pa2 对草莓灰霉病的防治效果 Table 2 Effect of strain Pa2 on strawberry gray mold 平均病斑长度 Lesion length(cm)发病率 Disease incidence(%)防治效果 Control effect(%)处理 Treatment 叶片 Leaves 果实 Fruits 叶片 Leaves 果实 Fruits 叶片 Leaves 果实 Fruits 对照 Control 2.250.66 a 1.980.11 a 100.000.00 a 100.000.00 a-Pa2 0.470.69 b 0.900.06 b 42.226.29 b 86.674.71 b 79.134.23 b 54.293.94 b 咪鲜胺 Prochloraz 0.000.00 c 0.000.00 c 0.000.00 c 0.000.00 c 100.000.00 a 100.000.00 a 注：图中数据为平均数标准差，不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在 0.05 水平差异显著，方差分析同列间比较。Note:Data are meanSD,data different letters indicate significant difference at 0.05 level by Duncans multiple range test,Analysis of variance comparison between same columns.2.5 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌菌丝细胞膜的影响 经 SYTOX 染色后，对照组菌丝无荧光出现（图 5A），处理组菌丝顶部出现膨大，菌丝弯曲，并且呈现出明显的绿色荧光（图 5B），表明菌株 Pa2 上清液能够破坏草莓灰霉病菌菌丝的细胞膜，增加细胞膜的通透性。BA绿色荧光通道 Green Fluorescence白光通道 Bright叠加 Merged20 m20 m A：对照组 Control group；B：处理组 Treated group 图 5 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌细胞膜通透性的影响 Fig.5 Effect of strain Pa2 supernatant on the hyphal membrane permeability of B.cinerea 2.6 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌细胞膜通透性的影响 OD260以及 OD280数值越高代表细胞内的核酸和蛋白质泄露量越大。草莓灰霉病菌经菌株 Pa2 上清液处理后，OD260和 OD280均呈上升趋势，在 48 h 时 5%上清液处理后 OD260值达 0.74，10%上清液处理后OD260值达 0.84（图 6A），同时 OD280值分别增加至 0.50 和 0.55（图 6B）；统计分析结果显示，处理组与对照组相比差异显著，表明菌株 Pa2 上清液具有破坏病原菌细胞膜能力，从而导致细胞内核酸和蛋白质泄露，同时上清液浓度越高对细胞损伤程度越大。2.7 菌株 Pa2 上清液对草莓果实病程相关基因表达的影响 菌株 Pa2 上清液处理草莓果实，用 qRT-PCR 测定 FaPR1、FaPR4 以及 FaGR 基因的表达。从图 7 可 第 1 期 史冰柯等：砖红镰刀菌菌株 Pa2 对草莓灰霉病的抑制作用 143 以看出，经过处理后的草莓果实 FaPR1 基因在 12 h 时相比对照高出 46.67 倍，在 24 h 时处理组基因表达量低于 12 h 处理组，高出对照组 19.05 倍；处理组草莓果实 FaPR4 以及 FaGR 基因表达量持续上升，其中处理组 FaPR4 基因在 24 h 时高于对照组 24.64 倍，处理组 FaGR 基因在 24 h 时高于对照组 3.69 倍。统计结果显示，处理组病程相关基因表达水平显著高于对照组，菌株 Pa2 处理能够诱导果实自身抗病基因表达来抵御病原菌的侵染。00.20.40.60.81.000.10.20.30.40.50.6对照Control10%上清 10%CFS20%上清 20%CFS时间 Time(h)bacbacbacbacbaacbacbcbacbcbaac0612244806122448时间 Time(h)A：OD260测定 Measurement of OD260；B：OD280测定 Measurement of OD280 注：不同字母表示各处理间差异显著（P0.05）。Note:Data with different letters indicate significant differences（P0.05）.图 6 菌株 Pa2 上清液对草莓灰霉病菌细胞膜通透性的影响 Fig.6 Effect of strain Pa2 supernatant on cell membrane permeability of B.cinerea 0102030405060700122404812162024283201224FaPR1基因表达Relative expression of FaPR1FaPR4基因表达Relative expression of FaPR4abaaababaaab时间 Time(h)时间 Time(h)对照 Control处理 Treatment00.51.01.52.02.53.03.54.04.501224FaGR基因表达Relative expression of FaGRaaabab时间 Time(h)图 7 qRT-PCR 检测菌株 Pa2 对草莓病程相关基因表达的影响 Fig.7 qRT-PCR assay for strawberry pathogenesis-related genes induced by strain Pa2 3 讨论 灰葡萄孢菌在许多植物寄主中能够引起灰霉病，特别是在收获贮存期会造成严重的经济损失。对该植 144 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 物病原菌一般通过化学杀菌剂进行防治，这不仅会导致环境污染问题，还会增加水果生产成本，此外，该病原菌已经对传统的合成杀菌剂产生了抗药性24。在这种情况下，有益微生物的生物防治在农业生产中显示出了应用的潜力，它们被认为是一种对植物病害有效防治和生态兼容的方法25。本研究发现，内生菌砖红镰刀菌菌株 Pa2 对草莓灰霉病具有显著的防治效果，表现出较好的应用潜力。细胞膜是真菌细胞的重要组成部分，细胞膜及细胞壁的完整性以及核酸及蛋白质合成是病原菌生长的重要条件，生防菌可以通过分泌拮抗物质破坏真菌细胞膜，影响正常功能代谢，抑制病原菌生长26-28。核酸和蛋白质在260和280 nm有最大吸收峰，细胞内核酸和蛋白质的泄露情况可通过OD260和OD280体现29。张钦语等30研究发现黑曲霉粗提物能够破坏青枯雷尔式菌Rastonia solanacearum细胞膜完整性以及损伤细胞结构，从而达到良好的抑菌效果；王炫栋等31发现丁香链霉菌 Streptromyces lilacinus 菌株 Sl-3 能够对大豆斑疹病菌细胞造成损伤，影响细胞分裂、细胞膜合成。本研究得出了相似的结果，经菌株 Pa2 上清液处理后病原菌的细胞膜发生破裂、内容物泄露，推测可能是菌株 Pa2 上清液能够破坏病菌保护酶系统，导致细胞内活性氧自由基积累，从而使细胞膜系统的完整性遭到破坏，最终导致菌体受到一定程度的损伤，这可能是菌株 Pa2 抑制病原菌生长的主要原因之一。另外，菌株 Pa2 上清液的粗提物能显著抑制草莓灰霉病菌菌落生长。这些结果表明，菌株 Pa2 上清液中含有抑菌活性物质。诱导植物系统抗性是果实采后病害生物防治的一个重要措施。生防菌通过诱导果实自身的抗性，从而抵抗病原菌的入侵32。水杨酸 SA 对植物体内建立对生物营养和半生物营养病原体的系统获得抗性（systemic acquired resistance）具有关键作用，其中 PR1 作为 SA 响应的关键基因；PR4 蛋白被鉴定为几丁质酶蛋白家族成员，在多种植物真菌性病害防御过程中被报道，如白粉病、灰霉病、霜霉病等33,34。谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase）是常见的抗氧化酶，可以增强植物对活性氧毒性的抵抗能力35。张亮等36研究发现荧光假单胞菌 P.fluorescens 能够诱导番茄病程蛋白基因 PRs（PR1、PR4、PR5、PR6）以及 GR、POX、PAL 等相关防卫基因的表达上调，降低番茄枯萎病病情指数。Yan 等37发现季也蒙念珠菌 Meyerozyma guilliermondi 菌株 Y-1 处理苹果果实后 4 个病程相关蛋白基因（MdPR1、MdPR5、MdGLU 和 MdCHI）的表达显著提高，苹果轮纹病的发病率显著降低。本研究中，经菌株 Pa2 上清液处理后草莓果实中 FaPR1、FaPR4 以及 FaGR 基因的表达都有不同程度的上调，说明菌株 Pa2 可能通过诱导草莓病程相关基因表达，增强了草莓果实抵御草莓灰霉病菌侵染的能力，从而达到防治草莓灰霉病的效果。本研究发现砖红镰刀菌菌株 Pa2 对草莓灰霉病菌具有较强的抑菌活性，并且菌株 Pa2 上清液可以破坏病菌菌丝细胞膜，诱导草莓果实中抗病相关基因表达。后续我们将对菌株 Pa2 上清液的抑菌物质进行分离和鉴定，为防治草莓灰霉病农药的研制提供相应的理论基础。参 考 文 献 1 Petasch S,Knapp S J,Van Kan J A L,et al.Grey mould of strawberry,a devastating disease caused by the ubiquitous necrotrophic fungal pathogen Botrytis cinereaJ.Molecular Plant Pathology,2019,20(6):877-892.2 Cimen H,Touray M,Gulsen S H,et al.Antifungal activity of different Xenorhabdus and Photorhabdus species against various fungal phytopathogens and identification of the antifungal compounds from X.szentirmaiiJ.Applied Microbiology and Biotechnology,2021,105(13):5517-5528.3 Hassan E A,Mostafa Y S,Alamri S,et al.Biosafe management of Botrytis grey mold of strawberry fruit by novel bioagentsJ.Plants(Basel),2021,10(12):2737 4 王伟宸,赵进,黄薇颐,等.芽胞杆菌代谢产物防治三种常见植物病原真菌的研究进展J.生物技术通报,2023,39(3):59-68.5 童蕴慧,纪兆林,徐敬友,等.灰霉病生物防治研究进展J.中国生物防治,2003,19(3):131-135.6 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