NY∕T 554-2023 （代替 NY∕T 554-2002）鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术.pdf

2023?02?17发布2023?06?01实施鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术41中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX11.220CCS B5542023Diagnostic techniques for duck A viral hepatitis 1 and 3中华人民共和国农业农村部发 布代替 NY/T?5542002学兔兔 标准下载N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件代替NY/T 鸭病毒性肝炎诊断技术,与NY/T 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:a)增加了临床症状和病理变化(见第章);b)增加了病毒的分离(见第章);c)增加了DHAV 和DHAV R T P C R(见第章);d)增加了DHAV 和DHAV R T q P C R(见第章);e)增加了DHAV 病毒中和试验(见第章);f)增加了DHAV 血清中和试验(见第章);g)增加了DHAV 和DHAV 抗体的胚胎中和试验(见第 章);h)删除了雏鸭接种/保护试验(见 年版的第章);i)删除了鸭(鸡)胚接种/中和试验(见 年版的第章).本文件推荐的临床症状和病理变化、病毒分离、R T P C R、R T q P C R、病毒中和试验、血清中和试验方法与WOAH推荐的相应方法基本一致.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:华南农业大学、中国农业大学、山东省滨州畜牧兽医研究院.本文件主要起草人:郭霄峰、罗均、张大丙、王笑言、沈志强、王文秀、王金良.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:首次发布为NY/T ;本次为第一次修订.学兔兔 标准下载N Y/T 鸭甲型病毒性肝炎型和型诊断技术范围本文件规定了鸭甲肝病毒型和型在鸭胚中的分离、R T P C R鉴定、R T q P C R鉴定;鸭甲肝病毒型的微量中和试验鉴定、抗体的微量中和试验检测和胚胎中和试验方法;鸭甲肝病毒抗体的胚胎中和试验方法.本文件适用于鸭甲型病毒性肝炎型和型的诊断与检疫.规范性引用文件本文件没有规范性引用文件.术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.缩略语下列缩略语适用于本文件.DHAV:鸭甲肝病毒(D u c kH e p a t i t i sAV i r u s)D E F:鸭胚成纤维细胞(D u c kEm b r y oF i b r o b l a s t s)D E L:鸭胚肝细胞(D u c kEm b r y oL i v e rC e l l s)D E E C:鸭胚上皮细胞(D u c kEm b r y oE p i t h e l i a lC e l l s)C P E:细胞病变(C y t o p a t h i cE f f e c t)DMEM:杜氏改良伊格尔培养基(D u l b e c c o sM o d i f i e dE a g l eM e d i u m)T C I D:半数细胞培养感染量(M e d i a nT i s s u eC u l t u r e I n f e c t i v eD o s e)W/V:重量体积比(W e i g h t/V o l u m e)R T P C R:反转录聚合酶链反应(R e v e r s eT r a n s c r i p t i o n P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n)P B S:磷酸盐缓冲液(P h o s p h a t eB u f f e rS a l i n e)R T q P C R:荧光定量P C R(q u a n t i t a t i v er e a l t i m eP C R)临床诊断 临床症状 该病主要发生于周龄以内的雏鸭,并且以周龄内的雏鸭为主.感染鸭发病急、传播快、病死率高.发病初期,病鸭精神萎靡,食欲减退或废绝,眼半闭呈昏睡状,头触地;h h后,病鸭出现神经症状,表现为运动失调、身体倒向一侧、两脚痉挛,死前头向背部扭曲,两腿伸直、向后张开,呈典型的角弓反张状.最急性病鸭常未见任何异常而突然抽搐痉挛死亡.病理变化 大体病变主要为肝脏肿大、质地易脆,表面呈黄红色或花斑状,并有特征性的点状出血或刷状出血.多数病例可见胆囊肿胀、胆汁充盈,部分病例脾脏肿大.急性病例的组织学病变表现为肝细胞坏死、变性和淋巴细胞浸润,慢性病例或耐过鸭常见不同程学兔兔 标准下载N Y/T 度的空泡变性和淋巴细胞聚集.结果判定凡具有 临床症状和 病理变化的病鸭,初步判定为疑似鸭病毒性肝炎.病毒分离 仪器设备 冷冻台式离心机.照蛋器.恒温培养箱.m L注射器及针头.手术剪.镊子.研钵.耗材 m细菌滤器.试剂 青霉素.链霉素.卡那霉素.P B S溶液,按照附录A的规定配制.甘油生理盐水.胚胎 日龄 日龄DHAV 或DHAV 抗体阴性鸭胚.样品采集 采集感染初期或发病急性期病鸭的肝脏.送检病料置于灭菌的 甘油生理盐水中.样品保存 采集的样品若在 h内处理,可于保存.或尽快置于 以下保存(储存最好).样品处理 组织样品于研钵中研磨后加入倍 倍p H 的P B S溶液,制成组织悬浮液.然后 r/m i n离心 m i n,取上清液作为接种材料.为防止细菌污染,可在样品液中加入青霉素 I U/m L、链霉素 g/m L和卡那霉素 g/m L,于 温箱中作用 m i n.或采用 m细菌滤器对上述病料样品液作滤过除菌.对处理的样品作无菌检验.鸭胚接种 取已处理并且无菌检验合格的样品,经尿囊腔接种 日龄 日龄的非免疫鸭胚,每枚鸭胚接种 m L病毒液,每个样品接种枚枚鸭胚.将已接种病毒的鸭胚置于 恒温培养箱中孵育.弃去接种后 h内死亡的鸭胚.对 h内未死亡的鸭胚,每间隔h观察胚胎的死亡情况.收集 h h死亡鸭胚,放入冰箱中静置h h,待鸭胚血管收缩,进行鸭胚剖检.胚胎病变胚胎大体病变为发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢水肿.胚肝呈黄红色、肿胀,并可能有坏死灶.学兔兔 标准下载N Y/T 病毒收获无菌收取 h h内的死胚或活胚的尿囊液和肝脏,保存备用.R T P C R检测 仪器 冷冻离心机.凝胶成像系统.P C R仪.耗材 R N a s e F r e e离心管.m L的指形管.m L的指形管.试剂 DHAV 上下游引物.DHAV 上下游引物.R NA抽提试剂盒.逆转录酶.d NT P s.T a qD NA酶.琼脂糖.b pD NAL a d d e r.P B S溶液,按照附录A中A 的规定配制.氯仿.的乙醇.R N a s e F r e ed d HO.阳性核酸对照.阴性核酸对照.D H A V的检测 引物DHAV F:AAGAAGGAGAAAAT Y(C或T)AAGGAAG G;DHAV R:T T GAT GT C AT AGC C CAA S(C或G)A C AG C;扩增 D基因片段,长度为 b p.DHAV F:T G GC T AT T GA C TT T GG C TT;DHAV R:T G TT ATG GAC T GGAAC C AC T;扩增 UT R区域,扩增长度为 b p.病料的处理以无菌术式收集病鸭的肝脏,或胚胎的肝脏、尿囊液.肝脏样品在组织研磨器中研磨成乳糜状,加P B S制成(W/V)悬浮液.肝脏悬浮液或尿囊液经 r/m i n离心 m i n,取上清液备用.病毒核酸的抽提 用R NA抽提试剂盒提取病毒的R NA.取 L尿囊液或肝组织研磨上清液于一新的R N a s e F r e e离心管中,加入 L裂解液,剧烈振荡,室温下静置m i n.随后加 L氯仿,剧烈振荡 s,室温下放置m i n.学兔兔 标准下载N Y/T r/m i n离心 m i n,取上清液于另一支离心管中.加入等体积的 乙醇,混匀.再将溶液转移到吸附柱中.r/m i n离心 s,弃掉滤液(溶液较多的情况下,可多次进行).向吸附柱中加入 L去蛋白溶液,r/m i n离心 s,弃掉滤液.向吸附柱中加入 L漂洗液,静置m i n.r/m i n 离心 s,弃掉滤液(重复次).r/m i n离心m i n,弃掉滤液,室温静置数分钟,以彻底晾干漂洗液.将吸附柱转移到一个新的R N a s e F r e e离心管中,加入 L LR N a s e F r e ed d HO,静置m i n.r/m i n离心m i n,收集含R NA的滤液.获得的R NA溶液保存于 或者直接用于R T P C R.R T P C R扩增 一步法R T P C R.取支 m L的指形管,一管加入DHAV 上下游引物(DHAV F和DHAV R)各 p m o l,另一管加入DHAV 上下游引物(DHAV F和DHAV R)各 p m o l.随后分别在两管中依次加入下列试剂,总体积为 L:a)模板,提取样品的总R NAL;b)逆转录酶,L;c)mm o l/Ld NT P s,L;d)T a qD NA酶,L;e)R T P C R缓冲液,L;f)R N a s e F r e ed d HO至 L.于P C R仪中扩增:反转录 m i n;预变性m i n;变性 s,退火 s,延伸 s,共进行 个循环;再延伸m i n.同时,设立D HA V 和D HA V 阳性以及阴性对照.反应结束后电泳检测.P C R产物的电泳检测反应结束后,取L LP C R产物于 的琼脂糖凝胶中电泳,同时以 b pD NAL a d d e r为参照.电泳条件为 V恒压、电泳 m i n.电泳结束后,将凝胶于紫外灯下观察.结果判定 DHAV 阳性对照在 b p处有一条特异的D NA条带,或者DHAV 阳性对照在 b p处有一条特异性条带,阴性对照没有目的带,判定试验成立.待检样品在 b p位置有D NA带,判定为DHAV 阳性,否则为阴性.待检样品在 b p位置处有条带,判定为DHAV 阳性,否则为阴性.如同一待检样品均可扩增出 b p和 b p的条带,阴性无条带,则判定为DHAV 和DHAV 混合感染.R T q P C R检测 仪器 冷冻离心机.恒温水浴箱.荧光定量P C R仪.耗材 R N a s e F r e e离心管.m L的指形管.学兔兔 标准下载N Y/T m L的指形管.试剂 DHAV 上下游引物或DHAV 上下游引物.R NA抽提试剂盒.逆转录酶.d NT P s.T a qD NA酶.R NA酶抑制剂.P B S溶液,按照附录A中A 的规定配制.氯仿.的乙醇.R N a s e F r e ed d HO.S Y B RG r e e nM a s t e rM i x.阳性核酸对照.阴性核酸对照.D H A V检测 引物q DHAV F:T G G T C GAG T C C C AT A C A C T AT AA;q DHAV R:G C C A C A C T T T C C A C T G C C C C T A;扩增长度 b p.q DHAV F:T G G T C GAG T C C C AT A C A C T AT AA;q DHAV R:C T C G G C A C AG GAT C C AAT AAT C;扩增长度 b p.病料处理以无菌术式收集病鸭的肝脏,或胚胎的肝脏、尿囊液.肝脏样品在组织研磨器中研磨成乳糜状,加P B S制成(W/V)悬浮液.肝脏悬浮液或尿囊液经 r/m i n离心 m i n,取上清液备用.病毒核酸的抽提 用R NA抽提试剂盒提取病毒的R NA.取 L尿囊液或肝组织研磨上清液于一新的R N a s e F r e e离心管中,加入 L裂解液,剧烈振荡,室温下静置m i n.随后加 L氯仿,剧烈振荡 s,室温下放置m i n.r/m i n离心 m i n,取上清液,加入等体积的 乙醇,混匀.将溶液转移到吸附柱中.r/m i n离心 s,弃掉滤液(溶液较多的情况下,可多次进行).向吸附柱中加入 L去蛋白溶液,r/m i n离心 s,弃掉滤液.向吸附柱中加入 L漂洗液,静置m i n,r/m i n离心 s,弃掉滤液(重复次).r/m i n离心m i n,弃掉滤液,室温静置数分钟,以彻底晾干漂洗液.将吸附柱转移到一个新的R N a s e F r e e离心管中,加入 L LR N a s e F r e ed d HO,静置m i n.r/m i n,离心m i n,收集含R NA的滤液.获得的R NA溶液保存于 或者直接用于q P C R.R T q P C R扩增 取支 m L的指形管,分别加入R NAL和q DHAV 、q DHAV 下游引物(mm o l/学兔兔 标准下载N Y/T L)各L,混匀,先置 加热m i n,再冰浴m i n.在上述混合液加入下列试剂,总体积为 L:a)d NT PM i x(mm o l/L),L;b)M ML VR T R e a c t i o nB u f f e r,L;c)M ML V反转录酶,L;d)R N a s e抑制剂,L;e)R N a s e F r e ed d HO,L,混匀.置 反应h,在 条件下灭活m i n,获得DHAV 和DHAV 的c D NA.取支 m L的指形管,其中一管加入DHAV c D NAL,q DHAV 上下游引物各L(m o l/L);另一管加入DHAV c D NAL,q DHAV 上下游引物各L(m o l/L);再于每支指形管中加入S Y B RG r e e nM a s t e rM i x预混液 L和d d HOL,混匀.在荧光定量P C R仪中运行扩增:在 预变性m i n;以 变性 s,退火 s;运行 个循环.溶解曲线程序为:s,s;以 /s的速度,从 升至,在 维持 s.结果判定 阴性对照无C t值,无扩增曲线(见附录E中的E );阳性对照C t值,扩增曲线拐点清楚,指数期明显(见E );溶解曲线呈单一峰(见E ),判定试验成立.待检样品无C t值,无扩增曲线,判定为DHAV 或DHAV 阴性.待 检 样 品 以q DHAV F:T G G T C GAG T C C C AT A C A C T AT AA;q DHAV R:G C C A C A C T T T C C A C T G C C C C T A为引物,样品C t值,有特定的扩增曲线,判定为DHAV 阳性.待检样品以q DHAV F:T G G T C GAG T C C C AT A C A C T AT AA;q DHAV R:C T C G G C A C AG GAT C C AAT AAT C为引物,样品C t值,有特定的扩增曲线,判定为DHAV 阳性.C t值 的样品需复检,重复后若无C t值,判定为阴性;否则,判定为阳性.D H A V 微量中和试验 固定血清检测病毒 病毒及血清 待检DHAV 病毒.DHAV 阳性血清.DHAV 阴性血清.鸡血清.耗材 孔细胞培养板.胚胎和细胞 日龄或 日龄DHAV 抗体阴性鸭胚.D E L,按照附录B的规定制备.D E F,按照附录C的规定制备.D E E C,按照附录D的规定制备.试剂 DMEM培养基.营养液,按照附录A中A 的规定配制.学兔兔 标准下载N Y/T 维持液,按照附录A中A 的规定配制.病毒中和试验 用DMEM培养基将待检病毒样品作 倍比稀释,然后分别与等体积的阳性血清、阴性血清混合,作用 m i n.将病毒血清混合液转入已长成单层并已弃去营养液的D E L或D E F或D E E C 孔板中,每孔 L.加入含鸡血清的维持液,每孔 L,每个稀释度重复孔.最后一列孔作为空白对照.将细胞板置于 C O的细胞培养箱内继续培养d d,观察C P E.C P E特征为细胞变圆并坏死.按R e e d M u e n c h法计算病毒的T C I D.结果判定 空白对照孔未出现C P E,判定试验成立.阳性血清试验组的T C I D 阴性血清试验组的T C I D 倍时,判定待检样品为DHAV 阳性.固定病毒检测血清 病毒及血清 DHAV .DHAV 阳性血清.DHAV 阴性血清.待检血清.鸡血清.胚胎和细胞 日龄或 日龄DHAV 抗体阴性鸭胚.D E L,按照附录B的规定制备.D E F,按照附录C的规定制备.D E E C,按照附录D的规定制备.耗材 孔细胞培养板.试剂 DMEM培养基.营养液,按照附录A中A 的规定配制.维持液,按照附录A中A 的规定配制.病毒T C I D 的滴定 用DMEM培养基将DHAV 病毒作 倍比稀释,取适宜稀释度病毒液接种于已弃去培养液并长满D E L或D E F或D E E C细胞的 孔板中,每孔 L,每个稀释度重复孔.最后一列的孔作为空白对照.将细胞板置于 作用h,然后加入含鸡血清的细胞维持液,每孔 L.将细胞板置于 C O培养箱内继续培养d d,按R e e d M u e n c h法计算病毒的T C I D.血清中和试验 将待测血清样品置于 水浴锅内灭活 m i n,然后用DMEM培养基将其作倍系列稀释.将 系列稀释的血清样品、DHAV 阳性血清、阴性血清分别与等体积 T C I D DHAV 病毒混合,作用 m i n.将病毒与血清的混合液转入到已长成单层并已弃去营养液的D E L或D E F或D E E C 孔板中,每孔 L,同时加入含鸡血清的维持液,每孔 L.每个稀释度的血清样品重复孔,阳性、阴学兔兔 标准下载N Y/T 性和空白对照各设置孔.将细胞板置于 C O的细胞培养箱内继续培养d,观察C P E.结果判定 阳性和空白对照孔未出现C P E,而阴性对照孔出现C P E,判定试验成立.血清的中和效价为完全抑制细胞发生病变的最高血清稀释度.抗体中和效价 的血清判定为DHAV 中和抗体阳性.抗体中和效价 的血清判定为DHAV 中和抗体阴性.胚胎中和试验检测D H A V 或D H A V 中和抗体 仪器设备 冷冻台式离心机.恒温培养箱.m L注射器及针头.病毒及血清 DHAV .DHAV .DHAV 阳性血清.DHAV 阴性血清.DHAV 阳性血清.DHAV 阴性血清.待检血清.胚胎 日龄 日龄S P F鸡胚.日龄 日龄DHAV 或DHAV 抗体阴性鸭胚.试剂 P B S溶液,按照附录A中A 的规定配制.青霉素.链霉素.中和试验 以p H 的P B S溶液将青霉素和链霉素分别稀释至 I U/m L和 g/m L.将DHAV 或DHAV 病毒液按的体积比与青霉素和链霉素混合,备用.将DHAV 与等体积的待检血清、DHAV 阳性血清、DHAV 阴性血清混合,置于 温箱中作用 m i n.或将DHAV 与等体积的待检血清、DHAV 阳性血清、DHAV 阴性血清混合,置于 温箱中作用 m i n.以每枚胚 m L病毒血清混合液经尿囊腔接种日龄 日龄S P F鸡胚或 日龄 日龄的非免疫鸭胚,每个样品接种枚枚胚.于 恒温培养箱中孵育.弃去接种后 h内死亡的胚胎.h后每间隔h观察胚胎的死亡情况,收集 h h死亡的胚胎,放入冰箱中静置h h,待胚胎血管收缩,进行剖检.结果判定 阳性血清对照组的胚胎未发生死亡,胚体无病变;而阴性血清对照组胚胎发生死亡,胚胎发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢部水肿.胚肝呈黄红色、肿胀并可能有坏死灶,判定试验成立.学兔兔 标准下载N Y/T 在DHAV 与待检血清混合的试验组中,如未发生胚胎死亡,胚体无病变,判定为待检测血清DHAV 抗体阳性.在DHAV 与待检血清混合的试验组中,如胚胎发生死亡,胚胎发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢部水肿,胚肝呈黄红色、肿胀并可能有坏死灶,判定为待检测血清DHAV 抗体阴性.在DHAV 与待检血清混合的试验组中,如未发生胚胎死亡,胚体无病变,判定为待检测血清DHAV 抗体阳性.在DHAV 与待检血清混合的试验组中,如胚胎发生死亡,胚胎发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢部水肿,胚肝呈黄红色、肿胀并可能有坏死灶,判定为待检测血清DHAV 抗体阴性.综合判定 凡具有 临床症状和 病理变化,并且R T P C R后约 b p处有一条特异的D NA条带,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.凡具有 临床症状和 病理变化,微量中和试验病毒阳性,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.凡具有 临床症状、病理变化,待检样品以q DHAV F:T G G T C GAG T C C C AT A C A C T AT AA,q DHAV R:G C C A C A C T T T C C A C T G C C C C T A为引物,样品C t值,有特定的扩增曲线,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.凡具有 临床症状、病理变化,并且R T P C R后 b p处有一条特异的D NA条带,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.凡具有 的临床症状、病理变化,待检样品以q DHAV F:T G G T C GAG T C C C AT A C A C T AT AA,q DHAV R:C T C G G C A C AG GAT C C AAT AAT C为引物,样品C t值,有特定的扩增曲线,判定为鸭甲型病毒性肝炎型.凡满足 或 的条件,判定为DHAV 中和抗体阳性.凡满足 或 的条件,判定为DHAV 中和抗体阴性.凡满足 的条件,判定为DHAV 中和抗体阳性.凡满足 的条件,判定为DHAV 中和抗体阴性.学兔兔 标准下载N Y/T 附录A(规范性)试剂配制方法A P B S缓冲液配制p H P B S缓冲液所需试剂如下:a)g的氯化钾;b)g的氯化钠;c)g的磷酸二氢钾;d)g的十二水合磷酸氢二钠.以上试剂均为分析纯,溶解于适量双蒸水中,调p H至 ,用双蒸水定容至 m L,保存.A 营养液在 m L的DMEM培养基中加入 m L胎牛血清,再加青霉素至终浓度 I U/m L.以N a HC O调p H至 .A 维持液在 m L的DMEM培养基中加入 m L胎牛血清,再加青霉素至终浓度 I U/m L.以N a HC O调p H至 .学兔兔 标准下载N Y/T 附录B(规范性)鸭胚肝细胞(D E L)的制备B 将 日龄的鸭胚放入超净台内,气室朝上,先用碘酊消毒气室部位,后用酒精棉脱碘;敲开气室部的蛋壳,撕开蛋壳膜、尿囊膜及羊膜,用镊子轻轻取出鸭胚,放入无菌的平皿中.取出肝脏,弃胆囊,用P B S缓冲液清洗次.B 将肝脏转移到无菌的小烧杯中,剪碎;然后,用P B S缓冲液清洗次.向肝脏碎片中加入 胰酶(胰酶的量为组织块的倍倍),然后置于 水浴中m i n m i n.B 弃掉胰酶,用DMEM清洗次,再用m LDMEM吹散组织块;然后,用层无菌纱布或细胞筛过滤.B 过滤后的细胞悬液 r/m i n离心 m i n,弃掉上清液.加少量DMEM培养液,轻轻吹散底部的细胞沉淀.B 用计数板进行细胞计数,计数后的细胞按 个/m L用DMEM培养液进行稀释.转入细胞瓶或细胞培养板中,放入 C O培养箱中进行培养.学兔兔 标准下载N Y/T 附录C(规范性)鸭胚成纤维细胞(D E F)的制备C 将 日龄的鸭胚放入超净台内,气室朝上,先用碘酊消毒气室部位,后用酒精棉脱碘;敲开气室部的蛋壳,撕开蛋壳膜、尿囊膜及羊膜,用镊子轻轻取出鸭胚,放入无菌的平皿中.剪除头、四肢、内脏,用P B S缓冲液清洗次.C 将胚的胴体转移到无菌的小烧杯中,剪碎,然后用P B S缓冲液清洗次.向胴体碎片中加入 胰酶(胰酶的量为组织块的倍倍),然后置于 水浴中m i n m i n.C 弃掉胰酶,用DMEM清洗次,再用m LDMEM吹散组织块;然后,用层无菌纱布或细胞筛过滤.C 过滤后的细胞悬液 r/m i n离心 m i n,弃掉上清液.加少量DMEM培养液,轻轻吹散底部的细胞沉淀.C 用计数板进行细胞计数,计数后的细胞按 个/m L用DMEM培养液进行稀释.转入细胞瓶或细胞培养板中,放入 C O培养箱中进行培养.学兔兔 标准下载N Y/T 附录D(规范性)鸭胚上皮细胞系(D E E C)的制备D 将长满D E E C的细胞培养瓶中的培养液弃去,加入无菌的P B S缓冲液轻摇 s,弃去上清液.D 加入m L在 预热的E D T A 胰酶,温和地摇动细胞瓶m i n,使E D T A 胰酶均匀分布在整个细胞薄层,然后用移液管吸去E D T A胰酶.D 重新加入m LE D T A 胰酶使其分布在整个细胞薄层,于 孵育细胞直至细胞从培养瓶表面分离(m i n m i n),必要时摇动或吹打使细胞充分分离,然后加入m L胎牛血清灭活残余的胰酶.D 加入 m L配置好的含有L 谷氨酰胺和 胎牛血清的D DMEM培养液,轻轻用移液管吹散细胞团.D 每个T 培养瓶中加入m L 个/m L细胞悬液,于 C O培养箱里培养细胞,dd即可生长单层细胞.D 细胞冻存步骤:常规方法冻存,按配冻存液,即份甘油、份血清和份培养基.学兔兔 标准下载N Y/T 附录E(资料性)荧光定量P C R曲线图E 荧光定量P C R阴性扩增曲线见图E .图E 荧光定量P C R阴性扩增曲线图E 荧光定量P C R阳性扩增曲线见图E .图E 荧光定量P C R阳性扩增曲线图E 荧光定量P C R溶解曲线见图E .学兔兔 标准下载N Y/T 图E 荧光定量P C R溶解曲线图学兔兔 标准下载