FL2200-型液相色谱仪标准操作规程.doc

起 草审 核批 准颁 发日 期日 期日 期生 效分 发1、目的：建立一个FL2200型液相色谱仪的标准操作规程，以规范其操作。2、范围：本规程合用于本公司的FL2200型液相色谱仪标准操作。3、职责：仪器操作者：负责该仪器的操作、清洁，并及时向上级、计量管理员报告仪器的异常情况；仪器维护保养人：负责仪器定期清洁、保养工作；计量管理员：负责维护该仪器的正常运营，指导并协助培训仪器的操作、保养，及时解决设备的异常情况。4、操作程序：4.1：基本规定4.1.1安装仪器的房间应通风良好,否则会引起中毒或不良刺激,也也许引起火灾,由于液相色谱仪所使用的溶剂大多是易燃且有毒的.4.1.2严禁在仪器附近吸烟,使用明火或其他火源,或安装其他任何发射或也许发射火花的设备,房间内应配备灭火装置或设备,以备紧急时防止火灾的发生.4.1.3房间内应配备自来水龙头或其他冲洗设备.假如溶剂进入眼睛或有毒溶剂溅到皮肤上,应立即用清洁的水冲洗.4.1.4避免在有腐蚀性气体或大量粉尘的地方安装本仪器,否则会影响仪器正常运转,并缩短仪器使用寿命.4.1.5实验室温度需控制在20左右,建议安装空调. 4.1.6电源电压为交流220V,功率为200W;房间内有良好的接地线.4.2开机4.2.1开机前准备配制流动相,配好后用有机膜过滤并超声15分钟4.2.1.1配制乙腈:水=1:9；4.2.1.2配制乙腈:缓冲盐（称取2.18g辛烷磺酸钠和1.92柠檬酸溶解在1000ml娃哈哈水中）=1：94.2.2打开泵、检测器和电脑，启动工作站；设立检测样品所需的各种条件；点击新建,创建项目，设立项目名称、样品名称、实验人等，点下一步，设定分析方法，下一步，设定仪器条件，下一步，设定检测器，下一步，设定仪器条件，下一步，项目创建结束，完毕。4.2.3上流动相停泵状态下把不锈钢吸滤头放于10%乙腈水里打开放空阀点击“系统清洗”5分钟后泵停止关闭放空阀按“泵启动”10%乙腈水过渡20分钟按“泵停止”把不锈钢吸滤头放于流动相中打开放空阀点击系统清洗5分钟后泵停止关闭放空阀点击“泵启动”稳定30分钟查看基线（点击工作站界面的开始，然后立即点击取消）等基线在此状态下成一稳定的直线，说明已经走平可直接进样。4.2.4配制样品称取2mg样品，溶解在50ml流动相里，用超声波超声让样品完全溶解就行。再用一次性针头过滤器把样品过滤到称量瓶中，进样10-20L。4.3关机4.3.1清洗柱子停泵状态下把不锈钢吸滤头放于10%乙腈水里打开放空阀点击系统清洗5分钟后泵停止关闭放空阀按“泵启动”10%乙腈水过渡40分钟（可以小流量长时间清洗）按“泵停止”把不锈钢吸滤头放于纯乙腈中打开放空阀点击“系统清洗”5分钟后泵停止关闭放空阀点击“泵启动”清洗30分钟。4.3.2柱塞杆清洗液配制甲醇：水=3:7 过滤下就可以用了，一天清洗一次30-60分钟就行。一次配制300ml就行，太多流动相放久了容易变质。5、仪器的使用维护及注意事项5.1输液泵5.1.1高压输液泵的重要技术性能项 目技 术 性 能泵类型双柱塞串联往复泵流量设定范围（0.0015.000）ml/min（压力在1.040Mpa）最小流量调节每步增量0.001ml/min（5.0019.999）ml/min（压力在1.020Mpa）流量设定值误差1%（0.12.0）ml/min范围内，输液泵空载或柱压小于20Mpa时2%（2.0019.999）ml/min范围内，使用流量校正系数补偿后流量反复性误差RSD0.3%以水为流动相，流量在（0.54.0）ml/min柱压Mpa环境温度20压力范围040Mpa压力示值误差1Mpa或2%压力保护限值误差1Mpa 在（540）MP范围内5.1.2泵的使用和维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：防止任何固体微粒进入泵体，由于尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最佳在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2m或0.45m）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。流动相不应具有任何腐蚀性物质，具有缓冲液的流动相不应保存在泵内，特别是在停泵过夜或更长时间的情况下。假如将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就也许析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒同样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充足清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有助于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。流动相应当先脱气，以免在泵内产气愤泡，影响流量的稳定性，假如有大量气泡，泵就无法正常工作。5.1.3假如输液泵产生故障，须查明因素，采用相应措施排除故障：没有流动相流出，又无压力指示。因素也许是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个也许因素是密封环磨损，需更换。压力和流量不稳。因素也许是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时也许是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。压力过高的因素是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力减少的因素则也许是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行5.2进样器进样装置规定：密封性好，死体积小，反复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。六通阀使用和维护注意事项：样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。5.3色谱柱 5.3.1柱型号:4.6*250mm,5um5.3.2柱的使用和维护注意事项色谱柱的对的使用和维护十分重要，稍有不慎就会减少柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的忽然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的忽然升高或减少也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应当缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为所有是水，反之亦然。一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速减少柱效。选择使用适宜的流动相（特别是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。避免将基质复杂的样品特别是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预解决或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以并且应当经常更换。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保存在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。假如下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时反复注射100200l四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对严禁将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。色谱柱使用过程中，假如压力升高，一种也许是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种也许是大分子进入柱内，使柱头被污染；假如柱效减少或色谱峰变形，则也许柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出12mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样解决后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。每次工作完后，最佳用洗脱能力强的洗脱液冲洗，当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物也许会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔45天开机冲洗15分钟。5.4紫外检测器5.4.1紫外检测器技术信息项 目重要性能指标波长范围190700mm波长精度0.1nm波长带宽8nm流过池体积8ul光程10mm基线噪音0.5*10-5AU(波长为254nm、流过池内为空气)基线漂移1*10-4AU/h（波长为254nm、流过池内为空气）5.4.2与检测器有关的故障及其排除流动池内有气泡假如有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，假如气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰”，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充足的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。假如气泡停留在流动池内，也也许使噪音增大，可采用忽然增大流量的办法除去气泡（最佳不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增长太多，以免流动池破裂。流动池被污染无论参比池或样品池被污染，都也许产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；假如污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。光源灯出现故障紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，也许产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。倒峰倒峰的出现也许是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，假如组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。假如流动相中具有紫外吸取的杂质，使用紫外检测器时，无吸取的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的锋利峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。5.5流动相5.5.1流动相的性质规定一个抱负的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特性。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子互换树脂和排阻色谱填料有时碰到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸取，或吸取很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。粘度要低（应2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，减少柱效，还会使柱压降增长，使分离时间延长。最佳选择沸点在100以下的流动相。对样品的溶解度要适宜。假如溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不仅影响了纯化分离，且会使柱子恶化。样品易于回收。应选用挥发性溶剂。5.5.2流动相的脱气HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，忽然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还也许与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反映。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误5.5.3流动相的滤过所有溶剂使用前都必须经0.45m（或0.22m）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。5.5.4流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，也许导致柱效减少。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。5.6样品测定5.6.1流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保存时间为615分钟为宜）。所以建议第一次检查时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达成，请注意充足平衡柱。5.6.2样品配制：溶剂；容器：塑料容器常具有高沸点的增塑剂，也许释放到样品液中导致污染，并且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化解决。5.6.3记录时间：第一次测定期，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便拟定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否尚有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，拟定是否会影响主峰的测定。5.6.4进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）5计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检查时请注意。5.6.5计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检查时请注意。5.6.6仪器的使用：流动相滤过后，注意观测有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。柱在线时，增长流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。假如第二天仍使用，可用水以低流速（0.10.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。此外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充足的柱，应先用含510%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。5.7波长及流动相的选择5.7.1波长选择：一方面在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸取光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸取度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。5.7.2流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。