多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究_韩一人.pdf

收稿日期:2022-06-30 基金项目:2022 年研究生双创培育项目，2021 年贵池区科技计划项目（GCKJ202107）和 2021 年校级大学生创新创业训练计划项目（202110364214）共同资助。作者简介:韩一人，硕士研究生。E-mail：*通信作者:陈名君，博士，副教授。E-mail： 安徽农业大学学报,2023,50(3):402-409 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.002 网络出版时间：2023-06-26 15:15:27 URL https:/ 多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究 韩一人1，刘玉军2，陈 歆1，郑先雨3，胡江昕1，陈名君1*(1.安徽农业大学安徽省微生物防治重点实验室，合肥 230036；2.安徽省科学技术研究院，合肥 230031；3.安徽省口腔疾病研究中心实验室，合肥 230032)摘 要：多花黄精是一种著名的中药材，其药用部位（根茎）含有多种内生真菌，是新化合物、新药源和生防制剂的潜在资源。为研究黄山市祁门县多花黄精根茎内生真菌的物种多样性，为其开发利用提供种质资源，采用组织分离法分离培养多花黄精根茎内生真菌，通过经典形态分类学并结合 rDNA ITS 序列比对鉴定分离得到的真菌，并进行物种多样性分析。结果表明，从多花黄精根茎中共分离出 182 株内生真菌，经鉴定为 2 门、5 纲、13 目、28科、33 属和 49 种，另外有 4 株未确定其分类地位。其中子囊菌门(Ascomycota)为优势门，分离频率为 83.52；粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势纲，分离频率为 59.34；肉座菌目(Hypocreales)为优势目，分离频率为 46.70；优势科是麦角菌科(Clavicipitaceae)，分离频率为 33.52；Metapochonia 是优势属，分离频率为 33.52。物种多样性研究结果表明黄山市祁门县多花黄精根茎的内生真菌物种丰富，群落结构复杂，且春季的多花黄精根茎内生真菌的 Shannon-Wiener 指数、Pielou 均匀度指数、Simpson 优势度指数和丰富度指数均高于夏季。关键词：多花黄精；内生真菌；鉴定；多样性 中图分类号：S567.239;Q935 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2023)03-0402-08 Study on species diversity of endophytic fungi in rhizome of Polygonatum cyrtonema HAN Yiren1,LIU Yujun2,CHEN Xin1,ZHENG Xianyu3,HU Jiangxin1,CHEN Mingjun1(1.Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Control,Anhui Agricultural University,Hefei 230036;2.Anhui Academy of Science and Technology,Hefei 230031;3.Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province,Hefei 230032)Abstract:Polygonatum cyrtonema is a famous Chinese herbal medicine,and its medicinal part-rhizome contains a variety of endophytic fungi,which is the potential resource for new compounds,new drug sources and biocontrol preparations.In this study,in order to study the species diversity of endophytic fungi in rhizome of P.cyrtonema in Qimen County,Huangshan City to provide resources for its development and utilization,endophytic fungi from rhizome of P.cyrtonema were isolated and cultured by tissue isolation method and identified by clas-sical classification combined with rDNA ITS sequences analysis and blast,and then their speices diversity was analyzed.As results,a total of 182 endophytic fungi were isolated from the rhizome of P.cyrtonema,which were identified as 2 phyla,5 classes,13 orders,28 families,33 genera and 49 species,and the other 4 strains had not been identified.Ascomycota was the dominant phylum,with a relative isolation frequency of 83.52%;Sordari-omycetes was the dominant class,and the relative separation frequency was 59.34%;the relative isolation fre-quency of Hypocreales was 46.70%;the dominant family was Clavicipitaceae,with a relative separation frequen-cy of 33.52%;Metapochonia was the dominant genus with a relative separation frequency of 33.52%.The results of speices diversity showed that the endophytic fungi were high species diversity and complex in community structure.The shannon-Wiener index,Pielou evenness index,Simpson dominance index and Margalefs index of endophytic fungi in spring were higher than those in summer.Key words:Polygonatum cyrtonema;endophytic fungi;identification;diversity 50 卷 3 期 韩一人等:多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究 403 多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua,J.Bot.(Morot)）隶 属 于 百 合 科（Liliaceae）黄 精 属（Polygonatum），是一种药食同源多年生草本植物1。广泛分布于皖西南各林地，其地下具横生根状茎，肉质肥大，属于“十大皖药”之一2。现代研究表明多花黄精富含多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、木脂素、植物甾醇和多种氨基酸等有效化学成分3。药理研究发现，黄精具有抗氧化衰老4、降血糖5、调血脂6、抗癌排毒7、改善睡眠8、调节免疫9、增强记忆10等作用。多花黄精营养价值十分丰富，其在药膳、保健品、化妆品等方面都具有很高的开发价值，市场前景广阔11。内生真菌指生活在健康组织和器官且不会引起宿主植物明显感染症状的一类微生物群，普遍存在于藻类、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物的组织和器官内部，并且内生真菌数量众多，种群结构多样12-13。这些真菌在漫长的进化中与宿主植物之间建立了特殊的关系，能显著影响植物体内代谢产物的形成，进而影响药用植物的质量与生长量14。在我国，传统中医药文化历史悠久，药用植物资源种类十分丰富，其中蕴含着丰富而独特的内生真菌资源。而内生真菌的研究对于保护野生与濒危药用植物、拓展药用资源、新药研发、生物防治等均有一定意义15。黄精属植物作为重要的药用植物，其相关种的内生真菌研究陆续有报道。李艳玲等16从泰山黄精（Polygonatum sibiricum Delar.Ex Redoute）的根、茎、叶组织块和果实中分离得到 32 株内生真菌，经分子生物学鉴定为 7 个属，其中镰刀菌属（Fusarium）占比 最 高，达 到 31.3%。谭 伟 等17从 滇 黄 精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl）中共分离得到内生真菌 37 株，分为 4 属 7 种，镰刀菌属也为优势属。蔡媛等18采用高通量测序对不同地区的黄精内生菌群落结构进行分析，得知黄精内生真菌分 7门、27 纲、70 目、132 科和 187 属。这表明黄精属药用植物内生真菌资源非常丰富，有待进一步挖掘。另外，采自不同产区或地区的同种植物的内生菌多样性也有所差异19。黄精属植物主要以根状茎为入药部位，且黄精根腐病是制约其产量和质量的重要因素，因此系统研究安徽祁门自然分布的多花黄精根茎内生真菌，对其物种多样性的评估、药用价值以及生物防治潜力的挖掘具有重要意义。1 材料与方法 1.1 样地设置和标本采集 调查样地位于安徽省黄山市祁门县新安镇仙寓山自然保护区（29 96 N，117 27 E）。该地属于亚热带季风温湿气候，光照充足，四季分明。年均气温 15.6，年降水量 1 600 mm 以上。土壤主要为紫色页岩等风化而成的黄壤或红黄壤，含有较丰富的矿质元素。该地区植被类型为亚热带常绿阔叶天然林，自然环境优越，植被茂密，且多花黄精资源丰富。根据多花黄精自然分布特点，在海拔 600 m左右采用随机采样法采集样品，于春季（3 月）和夏季（8 月）采集多花黄精根茎。将采集的样品放入自封袋内，并与冰袋一起装入泡沫盒子中，带回实验室后立即进行分离培养。1.2 多花黄精内生真菌的分离及纯化 选取上述采集新鲜健康的多花黄精根茎，用无菌水和毛刷清洗，去除表面泥土污垢，再放入数控超声清洗器中清洗 20 min，置于无菌滤纸上晾干。放入无菌台中进行表面消毒，首先用 75%乙醇浸泡3 min，后用 3%次氯酸钠浸泡 2 min，再放入 75%乙醇浸泡 30 s，最后用无菌水冲洗 3 次，放置无菌滤纸上擦干根茎表面水分。用无菌刀片削去根茎表皮，将根茎组织切成 5 mm 5 mm 的薄片，放置于PDA 培养基（马铃薯 200 g L-1、葡萄糖 20 g L-1、琼脂 20 g L-1）上，每个平皿放置 4 个组织薄片，每样品重复 3 次，并以漂洗液涂布于 PDA 培养基上作为对照，将其置于 25（L/D 为 12 h/12 h）培养箱中培养。待培养基中组织块长出菌丝后，用无菌接种针将菌丝挑至新的 PDA 培养基中于 25 培养箱中培养。若有杂菌污染则将菌丝挑取一点转至新的 PDA 培养基继续培养，多次重复直至获得单一菌落。每天观察菌落形态特征，如菌落颜色、质地、分泌物等，并记录。1.3 多花黄精内生真菌的鉴定 1.3.1 形态学鉴定 将分离纯化后的内生真菌接种于 PDA 培养基上，置于 25 恒温培养箱中培养。每日观察记录各菌株菌落形态、颜色、质地、有无色素等特征，并在光学显微镜下对菌丝、孢子和产孢结构进行观察，依据真菌鉴定手册20 进行分类鉴定，并结合相关文献进行形态鉴定。1.3.2 分子鉴定 将纯化后的菌株接种到铺有玻璃纸的 PDA 培养基上，置于 25 恒温培养箱中培养3 5 d，刮取菌丝 0.10 0.15 g 备用。采用改良的CTAB 法对菌株基因组 DNA 进行抽提。ITS-PCR 扩增：PCR 反应体系为 25 L，2 Taq PlusMasterMix 12.5 L，正反向引物（ITS4：5-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3；ITS5：5-GGAAGTAA AAGTCGTAACAAGG-3）（0.01 mol L-1）各 1 L，404 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 1.5 L 模板 DNA 和 9 L 超纯水。PCR 扩增程序：95 预变性 3 min，95 变性 15 s，48 退火15 s，72 延伸 1 min，循环 34 次；循环结束后 72 延伸 5 min。将 PCR 扩增的产物在 1.0琼脂糖凝胶上电泳分离，EB 染色后于凝胶成像系统检测拍照并送至华大基因（北京）公司进行测序。测序结果使用Chromas 软件校对。将 ITS-rDNA 序列提交到 NCBI中的 Nucleotide 数据库中进行比对，选取相似度最高的序列作为参考。根据 Landeweer 等21认为通过 ITS区域比对，序列相似性大于 99%，鉴别为相同种；序列相似性大于 95%且小于 99%，鉴别为相同属；序列相似性小于 95%，鉴别为相同科。1.4 数据统计与分析 本研究采用分离率(isolation rate，IR)22、分离频率（isolation frequency，IF）23以及微生物多样性指数来分析内生真菌在多花黄精根茎中的分布情况和种群结构。多样性指数包括香农指数24(Shannon-Weiner diversity index，H)，指数的值越大，则多样性越高，种群的复杂程度也越高；均匀度指数25（Pielous evenness index，E）表示某一群落或生境中全部物种个体数目的分配状况，可表示各物种个体数目分配的均匀程度；辛普森指数26（Simpsons diversity，D）是在群落的类群组成基础上进一步推算出来以表达群落组成状况的指标，优势度指数越大，表明生物群落内不同种类生物数量分布越不均匀，优势生物的生态功能越突出。为能全面评估样品中的物种丰富度，采用丰富度指数（Margalefs index，M）；为掌握群落间的相似程度，采用相似性指数27（Srensons similarity coefficients，Cs）。具体公式如下：%IR100=样品组织块总数分离得到的内生真菌数%IF100=株数分离得到所有内生真总真菌株数分离得到某一属的内生=-=niPiPiH1)ln(S/HJln=-=niPiD12)(1 M=(S1)/log2N Cs=2j/(a+b)式中，Pi 为某种属内生真菌菌株数目与全部菌株数的比值，S 为内生真菌的物种数，N 为菌株总数，j 是两种组织中具有的相同内生真菌种类数，a 是一个季节中内生真菌的种类数，b 是另一季节中内生真菌的种类数。2 结果与分析 2.1 多花黄精内生真菌初步鉴定结果 本研究从多花黄精根茎共分离出内生真菌 182株，总分离率为 45.45%。根据菌株的形态学特征，如菌落形态、颜色、质地、有无色素等（图 1），并用光学显微镜观察其菌丝显微特征、孢子形状大小、产孢结构等特征；结合 ITS 序列 Blast 比对结果（表1）进行内生真菌种类初步鉴定，将分离得到的内生真菌归类为 2 门、5 纲、13 目、27 科、33 属和 49 种。A-a(HJ-102):Cladosporium allicinum;B-b(HJ-22):Cladosporium anthropophilum;C-c(HJ-164):Peniophora cinerea;D-d(HJ-121):Colletotrichum liriopes;E-e(HJ-101):Metapochonia bulbillosa;F-f(HJ-79):Schizophyllum commune.A-F:菌落正面；a-f:菌落背面。图 1 部分内生真菌菌落形态 Figure 1 Partial endophytic fungal morphology 50 卷 3 期 韩一人等:多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究 405 表 1 多花黄精内生真菌 ITS 序列比对结果 Table 1 Comparison results of ITS sequences of endophytic fungi from P.cyrtonema 菌株号 比对结果 相似度/%GenBank 登录号 菌株数 HJ-79 Schizophyllum commune（裂褶菌）99.53 MH857808.1 18 HJ-94 Cylindrobasidium laeve 99.87 DQ097354.1 1 HJ-93 Peniophora pseudoversicolor（假杂色隔孢伏革菌）99.68 MH864303.1 1 HJ-164 Peniophora cinerea（灰质隔孢伏革菌）99.37 MW505970.1 1 HJ-30 Irpex lacteus（白耙齿菌）100.00 MF101401.1 3 HJ-90 Trametes hirsuta（毛栓菌）100.00 KF573024.1 1 HJ-157 Porostereum spadiceum（枣红孔韧菌)99.52 KJ668473.1 1 HJ-142 Phyllosticta capitalensis(首都叶点霉)100.00 LC542594.1 2 HJ-62 Neofusicoccum parvum(新壳梭孢菌)100.00 MF314150.1 2 HJ-13 Cladosporium tenuissimum(极细枝孢霉)100.00 MH864840.1 1 HJ-22 Cladosporium anthropophilum(枝孢霉属)99.82 MF574171.1 3 HJ-102 Cladosporium allicinum(枝孢霉属)100.00 MH863126.1 2 HJ-49 Juxtiphoma eupyrena 99.63 MH859842.1 1 HJ-59 Alternaria alternata(细链格孢菌)100.00 MH863109.1 2 HJ-107 Periconia pseudobyssoides(假丝黑团孢)99.68 MH864303.1 1 HJ-115 Torula fici(串状酵母菌属)99.61 MZ956794.1 1 HJ-46 Setophoma sp.（棘壳孢菌属）100.00 MW412737.1 1 HJ-55 Phaeosphaeria sp.(球腔菌属)100.00 OM262233.1 12 HJ-28 Penicillium virgatum(柳条青霉)100.00 JF439503.1 2 HJ-33 Penicillium expansum(扩展青霉)100.00 MH879249.1 1 HJ-53 Penicillium citrinum(桔青霉)100.00 MH864240.1 2 HJ-116 Aspergillus flavus(黄曲霉)100.00 MH865341.1 1 HJ-73 Aspergillus chevalieri(谢瓦曲霉)100.00 MH857265.1 1 HJ-54 Talaromyces muroii(篮状菌属)99.82 MT487843.1 2 HJ-122 Talaromyces rugulosus(细皱篮状菌)99.00 MT872098.1 1 HJ-139 Pezicula ericae(欧石楠无柄盘菌)99.82 KR859172.1 2 HJ-163 Pezicula sp.(无柄盘菌属)100.00 KR859271.1 2 HJ-88 Botrytis cinerea(贵腐霉菌)100.00 MW798777.1 1 HJ-42 Phialocephala sp.98.18 KF156325.1 1 HJ-101 Metapochonia bulbillosa(球芽异普克尼亚菌)99.68 AB378552.1 56 HJ-154 Metarhizium robertsii(罗伯茨绿僵菌)100.00 KU983799.1 5 HJ-103 Volutella citrinella(桔黄周刺座霉)99.83 HQ897821.1 2 HJ-143 Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)100.00 MK673879.1 11 HJ-161 Fusarium redolens(芳香镰刀菌)100.00 MT446126.1 1 HJ-34 Fusarium proliferatum(层生镰刀菌)100.00 MT466521.1 3 HJ-147 Clonostachys rosea(粉红粘帚菌)100.00 MH864507.1 3 HJ-161 Clonostachys rogersoniana（罗杰斯粘帚菌）99.11 MH421855.1 2 HJ-148 Purpureocillium lilacinum(淡紫紫孢菌)99.80 HQ842818.1 1 HJ-173 Tolypocladium sp.(弯颈霉属)95.18 MN882832.1 1 HJ-151 Colletotrichum fioriniae(油茶炭疽病)100.00 MH865668.1 2 HJ-24 Colletotrichum gloeosporioides(胶孢炭疽菌)100.00 MH863548.1 2 HJ-36 Colletotrichum spaethianum(白蜡树炭疽菌)100.00 MW924459.1 6 HJ-121 Colletotrichum liriopes(麦冬炭疽菌)100.00 MK644098.1 3 HJ-126 Colletotrichum camelliae(茶树炭疽菌)99.82 MK058490.1 1 HJ-40 Gibellulopsis nigrescens（变黑轮枝菌）99.82 KM268711.1 2 HJ-91 Neurospora sp.(脉孢菌属)99.83 MG664722.1 1 HJ-23 Diaporthe unshiuensis（间座壳属）100 MK942681.1 3 HJ-19 Diaporthe pseudomangiferae（间座壳属）100 KX866901.1 1 HJ-43 Scopulariopsis brevicaulis（梨孢帚霉属）100 MN886599.1 2 406 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 表 2 多花黄精根茎内生真菌种群分布 Table 2 Species distribution of endophytic fungi in rhizome of P.cyrtonema 门 纲 目 科 属 种 菌株数 分离频率/%Basidiomycota 担子菌门 Agaricomycetes 伞菌纲 Agaricales 伞菌目 Schizophyllaceae 裂褶菌科 Schizophyllum 裂褶菌属 Schizophyllum commune 裂褶菌 18 9.89 Physalacriaceae 泡头菌科 Cylindrobasidium Cylindrobasidium laeve 1 0.55 Russulales 红菇目 Peniophoraceae 隔孢伏革菌科 Peniophora 隔孢伏革菌属 Peniophora pseudoversicolor 假杂色隔孢伏革菌 1 0.55 Peniophora cinerea 灰质隔孢伏革菌 1 0.55 Polyporales 多孔菌目 Irpicaceae 鳞毛蕨科 Irpex耙齿菌属 Irpex lacteus 白耙齿菌 3 1.65 Polyporaceae 蘑菇目多孔菌科 Trametes 栓菌属 Trametes hirsuta 毛栓菌 1 0.55 Phanerochaetaceae 原毛平革菌科 Porostereum Porostereum spadiceum 枣红孔韧菌 1 0.55 Ascomycota 子囊菌门 Dothideomycetes 座囊菌纲 Botryosphaeriales 葡萄座腔菌目 Phyllostictaceae 叶状体科 Phyllosticta 叶点霉属 Phyllosticta capitalensis 首都叶点霉 2 1.10 Botryosphaeriaceae 葡萄座腔菌科 Neofusicoccum Neofusicoccum parvum 新壳梭孢菌 2 1.10 Cladosporiales Cladosporiaceae Cladosporium 枝孢霉属 Cladosporium tenuissimum 极细枝孢霉 1 0.55 Cladosporium anthropophilum 3 1.65 Cladosporium allicinum 2 1.10 Pleosporales 格孢腔菌目 Periconiaceae Periconia 黑团孢霉属 Periconia pseudobyssoides 假丝黑团孢 1 0.55 Torulaceae Torula 串状酵母菌属 Torula fici 串状酵母菌 1 0.55 Phaeosphaeriaceae Setophoma Setophoma sp.1 0.55 Phaeosphaeria 球腔菌属 Phaeosphaeria sp.12 6.59 Didymellaceae 亚隔孢壳科 Juxtiphoma Juxtiphoma eupyrena 1 0.55 Pleosporaceae 格孢菌科 Alternaria 链格孢属 Alternaria alternata 细链格孢菌 2 1.10 Eurotiomycetes 散囊菌纲 Eurotiales 散囊菌目 Aspergillaceae 曲霉科 Penicillium 青霉属 Penicillium virgatum 柳条青霉 2 1.10 Penicillium expansum 扩展青霉 1 0.55 Penicillium citrinum 桔青霉 2 1.10 Aspergillus 曲霉属 Aspergillus flavus 黄曲霉 1 0.55 Aspergillus chevalieri 谢瓦曲霉 1 0.55 Trichocomaceae 发菌科 Talaromyces 篮状菌属 Talaromyces muroii 2 1.10 Talaromyces rugulosus 细皱篮状菌 1 0.55 Leotiomycets 锤舌菌纲 Helotiales 柔膜菌目 Dermateaceae 暗色孢科 Pezicula 无柄盘菌属 Pezicula ericae 欧石楠无柄盘菌 2 1.10 Pezicula sp.2 1.10 Mollisiaceae 软盘菌科 Phialocephala Phialocephala sp.1 0.55 Sclerotiniaceae Botrytis Botrytis cinerea 贵腐霉菌 1 0.55 Sordariomycetes 粪壳菌纲 Hypocreales 肉座菌目 Clavicipitaceae 麦角菌科 Metapochonia Metapochonia bulbillosa 球芽异普克尼亚菌 56 30.77 Metarhizium 绿僵菌属 Metarhizium robertsii 罗伯茨绿僵菌 5 2.75 Nectriaceae 赤壳科 Volutella 周刺座霉属 Volutella citrinella 桔黄周刺座霉 2 1.10 Fusarium 镰刀菌属 Fusarium oxysporum 尖孢镰刀菌 11 6.04 Fusarium redolens 芳香镰刀菌 1 0.55 Fusarium proliferatum 层生镰刀菌 3 1.65 Bionectriaceae 生赤壳科 Clonostachys 螺旋聚孢霉属 Clonostachys rosea 粉红粘帚菌 3 1.65 Clonostachys rogersoniana 罗杰斯粘帚菌 2 1.10 50 卷 3 期 韩一人等:多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究 407 续表 2 门 纲 目 科 属 种 菌株数 分离频率/%Ophiocordycipitaceae 线虫草科 Purpureocillium 紫孢菌属 Purpureocillium lilacinum 淡紫紫孢菌 1 0.55 Tolypocladium 弯颈霉属 Tolypocladium sp.1 0.55 Glomerellales 小丛壳目 Glomerellaceae 小丛壳科 Colletotrichum 炭疽菌属 Colletotrichum fioriniae 油茶炭疽病 2 1.10 Colletotrichum gloeosporioides 胶孢炭疽菌 2 1.10 Colletotrichum spaethianum 白蜡树炭疽菌 6 3.30 Colletotrichum liriopes 麦冬炭疽菌 1 0.55 Colletotrichum camelliae 茶树炭疽菌 1 0.55 Plectosphaerellaceae 癣囊腔菌科 Gibellulopsis Gibellulopsis nigrescens 变黑轮枝菌 2 1.10 Sordariales 粪壳菌目 Sordariaceae 粪壳菌科 Neurospora 脉孢菌属 Neurospora sp.1 0.55 Diaporthales 间座壳目 Diaporthaceae 间座壳科 Diaporthe 间座壳属 Diaporthe unshiuensis 蜜桔间座壳 3 1.65 Diaporthe pseudomangiferae 假芒果间座壳 1 0.55 Microascales 小囊菌目 Microascaceae 小囊菌科 Scopulariopsis 梨孢帚霉属 Scopulariopsis brevicaulis 短尾帚霉 2 1.10 未知分类地位 4 2.20 2门 5纲 13目 28科 33属 49种 182株 100 表 3 春夏季多花黄精根茎内生真菌多样性指数和相似性指数 Table 3 Diversity index and similarity index of endophytic fungi in rhizome of P.cyrtonema in spring and summer 季节 分离率(IR)/%香农指数(H)均匀度指数(J)辛普森指数(D)丰富度指数（M）相似性指数（Cs）春季 45.42 2.91 0.81 0.90 5.17 0.46 夏季 46.79 2.59 0.77 0.82 4.52 2.2 多花黄精内生真菌的种群结构 从门水平上来看，分离得到的内生真菌有子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，其中子囊菌门分离频率为 83.52%，是优势门，而担子菌门分离频率为 14.29%。从纲水平上看，粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势纲，分离频率为 59.34%。其 次 座 囊 菌 纲(Dothideomycetes)和 伞 菌 纲(Agaricomycetes)分 离 频 率 分 别 为15.38%和14.29%，散囊菌纲(Eurotiomycetes)和锤舌菌纲(Leotiomycets)分别为 5.49%和 3.30%。从目水平上看，肉座菌目(Hypocreales)为优势目，分离频率为 46.70%；其次伞菌目(Agaricales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、小丛壳目(Glomerellales)的分离频率较高，分别为 10.44%、9.89%和 8.79%。红菇目(Russulales)、多孔菌目(Polyporales)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、Cladosporiales、散囊菌目(Eurotiales)、柔 膜 菌 目(Helotiales)、粪 壳 菌 目(Sordariales)、间座壳目(Diaporthales)和小囊菌目(Microascales)的分离频率依次为 1.10%、2.75%、2.20%、3.30%、5.49%、3.30%、0.55%、2.20%和 1.10%。从 科 水 平 上 看，优 势 科 是 麦 角 菌 科(Clavicipitaceae)，分离频率为 33.52%；其次裂褶菌科(Schizophyllaceae)、Phaeosphaeriaceae、赤壳科(Nectriaceae 和小丛壳科(Glomerellaceae)的分离频率较高，依次为 9.89%、7.14%、9.34%和 7.69%，其余 23 科分离频率均低于 4%。从属水平上看，异普克尼亚属（Metapochonia）是优势属，分离频率为 30.77%；其次裂褶菌属(Schizophyllum)、球腔菌属（Phaeosphaeria）、镰刀菌属(Fusarium)和炭疽属(Colletotrichum)的分离频率较高，依次为 9.89%、6.59%、8.24%和 7.69%。其余 28 属的分离频率均低于 4%。从 种 水 平 上 看，球 芽 异 普 克 尼 亚 菌（Metapochonia bulbillosa）是优势种，分离频率为30.77%；其次裂褶菌(S.commune)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的分离频率较高，分别为 9.89%和6.04%。其他种的分离频率不高且相差不大(表 2)。2.3 多花黄精根茎内生真菌春夏季物种多样性和相似性比较分析 通过比较分析可知，多花黄精根茎内生真菌在春季和夏季的分离率差别不大，春季和夏季的Shannon-Wiener 指数(H)、Pielou 均匀度指数(J)、Simpson 优势度指数(D)、丰富度指数（M）的数值均较高，表明多花黄精根茎具有较高的内生真菌408 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 物种多样性，种群结构较复杂，且春季的各项指数均略高于夏季（表 3）。两个季节共有的属有 10 个（表 4），春季独有的属有 13 个，夏季独有的属有10 个，相似度仅为 0.46，表明春季与夏季的多花黄精根茎内生真菌种类差异较大。表 4 春夏季多花黄精内生真菌的种群数量和分离频率 Table 4 Populations and isolation frequency of endophytic fungi in rhizome of P.cyrtonema in spring and summer 属 春季 夏季 菌株数 分离频率/%菌株数 分离频率/%Metapochonia 异普克尼亚属 27 14.84 29 15.93 Schizophyllum 裂褶菌属 18 9.89 0 0 Diaporthe 间座壳属 4 2.20 0 0 Phaeosphaeria 球腔菌属 12 6.59 0 0 Neofusicoccum 2 1.10 0 0 Scopulariopsis 梨孢帚霉属 2 1.10 0 0 Irpex 耙齿菌属 2 1.10 1 0.55