2型糖尿病大鼠血清中蛋白结合态铜和锌水平的测定_秦旭.pdf

基础研究 型糖尿病大鼠血清中蛋白结合态铜和锌水平的测定秦旭，李军，胡勇，于春，黄磊，娄波，罗茹丹，徐纬（贵州医科大学 公共卫生与健康学院 环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳）摘 要目的 探讨 型糖尿病（）大鼠血清中蛋白结合态铜（）、锌（）的水平。方法 只成年（）大鼠随机分为对照组（，普通饲料）和 模型组 ，高糖高脂饲料，腹腔注射链脲佐菌素（）诱导造模，分别取 组大鼠心脏血离心检测血清中的、元素总形态及非蛋白结合形态；于 制作、元素的标准曲线，获取检定限和定量限；通过精密度实验，计算、总含量、非蛋白结合态含量及相对标准偏差（）；采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法检测血清、总形态含量和非蛋白结合态含量，计算蛋白结合态含量。结果、元素在标准曲线范围内的相关系数（）.，均，加标回收率为 ；与对照组相比，模型组大鼠血清中 总形态含量和蛋白结合态含量均升高（.），总形态含量和蛋白结合态含量均降低（.），、总形态含量和蛋白结合态元素含量的比值均升高（.）；大鼠血清 总形态含量和蛋白结合态含量与 总形态含量和蛋白结合态含量呈负相关关系（.）。结论 大鼠血清中、总形态变化主要由蛋白结合态变化引起，测定 种元素的蛋白结合态含量较总形态含量可以更好地反映它们在 过程中的生物学作用。关键词糖尿病，型；大鼠；血清；铜；锌；元素；蛋白结合态；含量分析中图分类号.文献标识码 文章编号（）：，（，）（）（）（）（）（，），（），（），（），第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目教育部高等教育司创新训练项目（）；贵州省科技计划项目（黔科合 字）；贵州省区域内一流学科建设项目 公共卫生与预防医学（黔教科研发）通信作者：引用本文：秦旭，李军，胡勇，等 型糖尿病大鼠血清中蛋白结合态铜和锌水平的测定 贵州医科大学学报，（）：，（），（）（.）（.），；糖尿病（，）是一种代谢异常所导致的高血糖病，的发病以 型（，）为主，型（）和其它类型 少 见。研 究 表 明，铜（，）、锌（，）等微量元素与 关系密切，其增加或缺失都会使胰岛素的合成和释放受到影响。既往研究中，学者们主要关注血清中微量元素总量与 的关系，很少关注元素的形态。微量元素在血清中的存在形态为蛋白结合态和非蛋白结合态，与蛋白质结合而存在的元素形态为蛋白结合态元素，其它存在形态的元素均为非蛋白结合态元素。与非蛋白结合态元素相比，元素蛋白结合态在机体内发挥的生物学作用更稳定。因此，相较于测定元素总形态含量而言，检测血清中蛋白结合态元素含量更能准确反映元素在 发生发展过程中的作用，对 的辅助诊断和治疗具有更重要的价值。蛋白结合态元素与 的关系的研究比较缺乏，因此，本研究以 大鼠为研究对象，采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法（，）检测 大鼠血清中、蛋白结合态含量，初步探讨、元素的蛋白结合态在 大鼠元素含量分析中的价值，可供临床 的诊疗和基础研究时参考使用。材料与方法.实验材料.动物来源清洁级成年 （）健康大鼠 只，雌雄各半，体质量 ，由学校实验动物中心提供 （黔）。.主要仪器与试剂 连续光源火焰 石墨炉原子吸收光谱仪（德国耶拿），离心机（上海卢湘仪 .），电子天平（梅特勒 ），血糖仪（珠海柯诺）；、单元素标准储备溶液 （国家有色金属中心），硝酸（优级纯，重庆川东化工），无水乙醇（优级纯，天津市鑫宇精细化工），链脲佐菌素（，；上海皓鸿），柠檬酸和柠檬酸三钠（上海）。.检测方法.造模及分组 参考文献建立 大鼠模型。采用随机数字表法将大鼠随机分为对照组（雌雄各 只，普通饲料喂养）和 模型组（雌雄各 只，高糖高脂饲料喂养），喂养 周；对照组大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液，模型组腹腔注射 的 且诱导；空腹采集 组大鼠尾静脉血液检测空腹血糖（，），取 次平行 检测的均值，以.作为成模标准。.取样取“.”项下 组大鼠心脏血，静置，于 下 离心 取血清，分别放入.离心管内，储存于 超低温冰箱内待检。.样品检测 取“.”项下 组大鼠血清 加入离心管中，加硝酸 ，混匀静置，蒸馏水稀释至 ，充分混匀，采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定、含量；再取 组大鼠血清 加入.离心管内，分别加（，下同）的乙醇 混匀，静止，下 离心 ，上清液用.一次性水系过滤器过滤，取滤液 ，加 硝酸 ，充分混匀，采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定、含量；、元素贵 州 医 科 大 学 学 报 卷总形态含量与非蛋白结合态含量之差即为蛋白结合态含量。.标准储备溶液的配置取 的、标准储备液各 ，硝酸稀释，定容到 容量瓶中，摇匀，配成 的标准储备液；取 的、标准储备液各，定容到 的容量瓶中，摇匀，配成 的标准储备液。.标准曲线用 的硝酸作为稀释液，仪器自动将“.”项下 的、标准储备液稀释为、及 的单元素标准质量浓度溶液系列。.检出限和定量限按“.”项下的实验方法制备空白溶液，根据仪器工作条件连续测量 次，分别以测定值的 倍和 倍标准偏差值（）除以标准曲线的斜率（）得到各元素含量的检出限（）和定量限（）。.精密度实验按“.”项下的方法分别制备 份对照组大鼠血清、元素总形态和非蛋白结合态元素血清样品，根据仪器工作条件进行测定，计算、总含量、非蛋白结合态含量及相对标准偏差（，）。.回收实验 取“.”项下对照组大鼠血清制备均质血清 和 各 份，各自均分为 组；取 和 的血清各 组，按“.”项下的实验方法分别处理为对照组大鼠血清、元素总形态样品和非蛋白结合态样品，采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定血清本底值，测定值分别取均数即为总形态样品和非蛋白结合态样品本底值；另取血清 分为 组，按加标量为本底值比加标值低（.）、中（.）及高（.）的 个比例进行加标，后续步骤按“.”项下的实验方法进行，采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定 组血清、元素含量；取剩余 血清 组，加标量同上，后续步骤按“.”项下实验方法进行，采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定加标后 组血清、元素含量。.统计学分析采用 .统计软件对数据进行统计分析，组间比较采用独立样本 检验，结果以均数 标准差（）表示；相关性分析采用斯皮尔曼相关进行分析，结果以相关系数（）表示；.为差异有统计学意义。结果.标准曲线、检出限和定量限把、的质量浓度作为横坐标、吸光度作为纵坐标、绘制标准曲线，结果表明，标准曲线的相关系数均在.以上，、标的质量浓度均在 内与对应的吸光度呈线性关系，、元素线性关系良好，该标准曲线对待测元素可以准确定量。见表。表 、元素线性参数、检出限和定量限 ，元素校准方程检出限（）定量限（）.精密度和回收率采用连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定对照组大鼠血清、元素总形态样品含量和非蛋白结合态含量，对对照组大鼠血清、元素总形态样品含量和非蛋白结合态含量进行精密度和加标回收率实验，并计算测定值的 和加标回收率，结果表明，、元素总形态含量和非蛋白结合态含量 测量值均小于；、元素总形态和非蛋白结合态低、中、高加标回收率的范围为 ，能满足加标回收率范围 的要求。见表。表 、元素总形态含量和非蛋白结合态精密度和回收率实验结果 形态元素 精密度 加标回收率 低中高总形态.非蛋白结合态.血清中不同形态、元素的含量结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血清 总形态含量和蛋白结合态含量均升高（.），但非蛋白结合态含量无变化（.）；与对照组相比，模型组大鼠 总形态含量和蛋白结合态含量均降低（.），但非蛋白结合态含量变化无差异（.）。见表。期秦旭等 型糖尿病大鼠血清中蛋白结合态铜和锌水平的测定表 对照组和 模型组大鼠血清中不同形态、的含量（）（）组别总形态（）非蛋白结合态（）蛋白结合态（）对照组.模型组.血清中不同形态、含量的比值结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血清中 和 总形态含量和蛋白结合态含量比值均升高（.），但非蛋白结合态 和 含量比值变化无差异（.）。见表。表 对照组和 模型组大鼠血清不同形态 比值（）（）组别 比值总形态非蛋白结合态 蛋白结合态对照组.模型组.血清中不同形态、含量的相关性结果显示，所有大鼠血清中 总形态含量和蛋白结合态含量与 总形态含量和蛋白结合态含量呈负相关关系（.），而非蛋白结合态 含量与非蛋白结合态 无相关性（.）。见表。表 大鼠血清中不同形态、含量的相关性 元素形态总形态.非蛋白结合态.蛋白结合态.讨论 作为一种严重影响人群健康的慢性非传染性疾病，一旦患病无法治愈。随着经济的发展，人民生活水平的提高，生活方式改变以及人口老龄化，我国 患病率快速增长，增长速度高于亚洲其它国家，给社会带来沉重的负担。根据调查数据显示，我国成人 患病率已经达到.，患者总人数也已经达到了.亿。、是人体不可或缺的必要营养物质，对胰岛素的合成、分泌、贮存、活性以及能量代谢起着重要作用。既往研究主要通过检测血清中元素总形态含量来研究机体元素代谢水平，但由于血清中元素总形态含量易受到饮食、环境等因素的 影响；此外，关于患者或 大鼠血清中、总形态含量研究结果并不统一，存在一定程度的偏差，而元素的蛋白结合形态相对稳定，不易受到上述因素的影响。因此，分析 血清中元素蛋白结合态含量对进一步探明元素与 的关系具有重要的价值。本研究以 大鼠为对象，采用连续光源火焰 石墨炉原子吸收光谱仪检测 大鼠血清中、总形态含量和非蛋白结合态元素含量，从元素蛋白结合态的角度分析大鼠血清中、含量与 发生和发展的关系，结果显示，大鼠血清中 总形态含量升高，总形态元素含量降低，、总形态元素含量比值升高，总形态元素含量与 总形态元素含量呈负相关关系，提示 大鼠血清中、元素出现紊乱。相关研究表明，铜在机体中参与了多种酶活性及生物代谢，主要以结合铜蓝蛋白的形式影响生物代谢，锌与 型糖尿病的关系非常密切，直接参与了人体内胰岛素的合成、储存及分泌；元素分布在胰岛 细胞颗粒中，能够提高胰岛素的稳定性，并调节胰岛素降糖作用；主要靠金属硫蛋白缓冲体系保持动态平衡，当 发生时，机体内肠道中 元素的吸收率提高、积蓄量增加，与 元素竞争同一载体蛋白 金属硫蛋白并产生拮抗作，导致 元素含量减少，进而引起 大鼠血清中、元素紊乱。提示 大鼠血清中、元素出现紊乱可能与蛋白结合态的元素有关。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷进一步分析 大鼠血清中、非蛋白结合态元素含量，发现 大鼠血清中、元素含量无明显变化，、非蛋白结合态元素含量比值亦无明显变化，非蛋白结合态元素含量与 非蛋白结合态元素含量也无明显的相关性，提示 大鼠血清中、非蛋白结合态含量未发生紊乱。相关研究表明，不同元素的化学形态生物效应差别很大，它们决定了元素在生物体内的化学行为，表现出不同的生物学效应，元素蛋白结合态相较于非蛋白结合态在体内比较稳定且发挥着重要的生物学作用，如有铜蓝蛋白（抗氧化剂作用）、血蓝蛋白（运输氧）、超氧化物歧化酶（歧化反应）、血红蛋白（运输氧）等。由此推测，在大鼠 的发生过程中，非蛋白结合元素可能未发挥主要的生物效应，可能与大鼠 的发生无直接的关联。结合元素总形态和非蛋白结合态元素含量的研究结果，分析元素蛋白结合态研究结果显示，大鼠血清中 蛋白结合态含量升高，蛋白结合态含量降低，、蛋白结合态元素含量比值升高，蛋白结合态元素含量与 蛋白结合态元素含量呈现负相关关系，提示 大鼠血清中蛋白结合态、元素发生紊乱，大鼠血清中总形态元素、的紊乱是由于蛋白结合态、元素的紊乱引起。相关研究显示，与 型糖尿病的关系非常密切，直接参与了人体内胰岛素的合成、储存及分泌；在细胞中大部分与蛋白紧密结合，只有一小部分以游离形式存在，到目前为止，已发现 多种 活化的金属蛋白酶和 多种 依赖性转录因子；人体内 稳态主要靠金属硫蛋白 硫蛋白缓冲体系、转运蛋白和 铁转运体蛋白家族两大 转运系统，金属硫蛋白 硫蛋白缓冲体系重点参与 的跨膜转运，而 转运蛋白和 铁转运体蛋白家族主要参与 的储存及运输；金属硫蛋白是具有抗氧化特性的 结合蛋白，可以保护细胞和组织免受氧化应激，其表达可降低高血糖诱导的器官中的氧化应激、糖尿病并发症风险。另有研究表明，铜在机体内主要以结合铜蓝蛋白的形成存在，与了多种酶活性及生物代谢，与 在人体中相互拮抗，如果体内 元素增多，则会影响 元素的吸收使其大量丢失，促使糖尿病及其并发症的发生和发展。由此推测，在大鼠 发生过程中，蛋白结合形态、元素在大鼠 发生过程中发生了显著变化。综上所述，大鼠血清中、总形态的变化主要是由蛋白结合态变化引起，与非蛋白结合态含量变化无直接关联，蛋白结合形态、元素在大鼠 发生过程中发挥了重要的生物学作用。以上研究结果提示，下一步研究工作应重点关注元素的蛋白结合态的含量变化，可忽略元素非蛋白结合态含量变化。参考文献 ，：，：张雨辰，张雅琴 糖尿病类型及并发症的研究进展 基因组学与应用生物学，（）：薛婵 微量元素与糖尿病的关系浅谈 基层医学论坛，（）：张步爱，刘良琼 型糖尿病患者全血微量元素与血糖的关系 综合医学论坛，（）：龚频，刘萌，李晓凡，等 型糖尿病大鼠各组织及体液中锌、镁、铜、铁、钙五种元素的变化规律 陕西科技大学学报，（）：麦高阳，李鲁强，杜欣媚，等 绝经后 型糖尿病患者血清微量元素和电解质与空腹血糖和糖化血红蛋白的相关性分析 慢性病学杂志，（）：徐纬，李军，胡勇，等 连续光源火焰原子吸收光谱法同时测定血清中锌、铜、铁蛋白结合态含量 理化检验 化学分册，（）：陆少君，曾伟斌，臧林泉 型糖尿病大鼠模型制备实验研究 广东药科大学学报，（）：李贤，王惠群，吴延莉，等 贵州省 型糖尿病和糖尿病前期流行现状及影响因素分析 中国慢性病预防与控制，（）：马书丽，许燕君，孟瑞琳，等 广东省 岁及以上居民血压及超重 肥胖对糖尿病的影响 中华疾病控制杂志，（）：李建彬，郭向娇，武恩平，等 郑州市成年居民糖尿病流行现状及相关因素分析 中国慢性病预防与控制，（）：黎衍云，杨沁平，吴菲，等 上海市 岁及以上居民 型糖尿病流行现状及影响因素分析 中国慢性病预防与控制，（）：（下转第 页）期秦旭等 型糖尿病大鼠血清中蛋白结合态铜和锌水平的测定 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张瑞华，杨海平，刘彬 沉默 基因表达对皮肤鳞状细胞癌细胞系 信号通路活化及细胞侵袭的影响 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