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第第 三三 章章 酶化学酶化学(Chemistry of Enzyme)(Chemistry of Enzyme)第1页本章重点及难点本章重点及难点重点：重点：了解酶作为生物催化剂特点、国际命名；了解酶催化作用机理；掌握酶促反应动力学中米氏方程及Km意义、应用，掌握影响酶促反应动力学原因及与影响酶催化高效性原因之间区分。掌握别构酶特点及核酶、同工酶、诱导酶等概念。难点：难点：酶催化作用机理、各原因对酶促反应速度影响及酶促反应动力学应用。第2页第一节第一节 通通 论论第3页一、酶学研究历史一、酶学研究历史n公元前两千多年，我国已经有酿酒记载。公元前两千多年，我国已经有酿酒记载。n一一百百余余年年前前，Pasteur认认为为发发酵酵是是酵酵母母细细胞胞生生命命活活动动结结果。果。n1877年，年，Kuhne首次提出首次提出Enzyme一词。一词。n1897年年，Buchner弟弟兄兄用用不不含含细细胞胞酵酵母母提提取取液液，实实现现了发酵。了发酵。n1926年，年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。n1982年年，Cech首首次次发发觉觉RNA也也含含有有酶酶催催化化活活性性，提提出出核酶核酶(ribozyme)概念。概念。n1995年年，Jack W.Szostak研研究究室室首首先先报报道道了了含含有有DNA连连 接接 酶酶 活活 性性 DNA片片 段段，称称 为为 脱脱 氧氧 核核 酶酶(deoxyribozyme)。第4页 二、什么是酶？二、什么是酶？酶是由活细胞产生，能在体内或体外起一样催化作用一酶是由活细胞产生，能在体内或体外起一样催化作用一类含有活性中心和特殊构象生物大分子，包含蛋白质和核酸，类含有活性中心和特殊构象生物大分子，包含蛋白质和核酸，是生物催化剂。是生物催化剂。三、酶与普通催化剂共性及特征三、酶与普通催化剂共性及特征 1、共性、共性（1）不发生质、量改变，但能）不发生质、量改变，但能 改变反应速度改变反应速度（2）不改变反应平衡点，但能）不改变反应平衡点，但能 缩短反应时。缩短反应时。（3）可降低反应活化能）可降低反应活化能（4）只能催化热力学允许反应）只能催化热力学允许反应 2、个性、个性（1）极高催化效率）极高催化效率（2）高度专一性）高度专一性（3）易失活）易失活（4）酶活性可调控）酶活性可调控（5）催化作用与结构相关）催化作用与结构相关第5页 酶专一性类型酶专一性类型1.结构专一性结构专一性 酶酶对对所所催催化化分分子子（底底物物，Substrate）化化学学结结构构特殊要求和选择特殊要求和选择 类别：绝对专一性和相对专一性类别：绝对专一性和相对专一性2.立体异构专一性立体异构专一性 酶酶除除了了对对底底物物分分子子化化学学结结构构有有要要求求外外，对对其其立立体异构也有一定要求体异构也有一定要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性类别：旋光异构专一性和几何异构专一性第6页四、酶作用专一性四、酶作用专一性假说假说(1)、锁钥学说、锁钥学说（模板学说）（模板学说）(2)、多位点亲和理论、多位点亲和理论(3)、诱导契合学说、诱导契合学说第7页(3)、诱导契合学说、诱导契合学说第8页五、酶命名和分类五、酶命名和分类1.命名：命名：习惯命名；系统命名习惯命名；系统命名2.国际系统分类法及编号国际系统分类法及编号 *国国际际生生物物化化学学会会酶酶学学委委员员会会（Enzyme Commsion）将将酶酶分分成成六六大大类类：1.氧氧化化还还原原酶酶类类，2.转转移移酶酶类类，3.水水解解酶酶类类，4.裂裂解酶类解酶类，5.异构酶类异构酶类，6.合成酶类合成酶类 *每一个酶有一个编号每一个酶有一个编号,如乙醇脱氢酶如乙醇脱氢酶 EC 1.1.1.27 大类大类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号第9页 第二节第二节 酶分子结构与功效酶分子结构与功效第10页酶酶简单酶简单酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。结合酶结合酶酶蛋白酶蛋白辅助因子辅助因子（简单蛋白质简单蛋白质）（结合蛋白质）（结合蛋白质）（apoenzymeapoenzyme）（cofacter)cofacter)辅酶辅酶（coenzyme)coenzyme)辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)全酶全酶(holoenzyme(holoenzyme）=酶蛋白酶蛋白+辅助因子辅助因子一、酶组成一、酶组成第11页*各部分成份在催化反应中作用各部分成份在催化反应中作用q酶蛋白决定反应专一性酶蛋白决定反应专一性q辅助因子决定反应种类与性质辅助因子决定反应种类与性质金属酶金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。失。金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme)金属离子为酶活性所必需，但与酶结合不甚金属离子为酶活性所必需，但与酶结合不甚紧密。紧密。第12页辅助因子分类辅助因子分类（按其与酶蛋白结合紧密程度）（按其与酶蛋白结合紧密程度）辅酶辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤方透析或超滤方法除去。法除去。辅基辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，不能用紧密，不能用透析或超透析或超滤方法除去滤方法除去。第13页或称活性部位，或称活性部位，酶分子中直接和底物结酶分子中直接和底物结合并起催化反应空间局限（部位）。合并起催化反应空间局限（部位）。1.酶活性中心酶活性中心（结合部位和结合部位和结合部位和结合部位和催化部位）催化部位）二、酶分子结构特征二、酶分子结构特征 结合部位结合部位 酶分子中与底物酶分子中与底物结合部位或区域普通结合部位或区域普通称为结合部位，称为结合部位，结合部位决定酶专一性。第14页n催化部位催化部位 酶分子中促使底物发生化学改变部位称为催化部位，催化部位决定酶所催化反应性质。第15页活性中心特点活性中心特点n 活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只有几个活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只有几个aaaa残基组成。残基组成。n 酶活性中心是个三维实体，是在酶高级结构中形成，酶活酶活性中心是个三维实体，是在酶高级结构中形成，酶活 性中心性中心aaaa残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠 近。近。n 酶与底物结合是活性部分与底物形状发生诱导锲合过程。酶与底物结合是活性部分与底物形状发生诱导锲合过程。n 酶活性部位位于酶分子表面一个裂缝内，底物分子就结合到这酶活性部位位于酶分子表面一个裂缝内，底物分子就结合到这 个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。n 酶活性中心是可运动性，酶活性中心与底物结合经过次级键。酶活性中心是可运动性，酶活性中心与底物结合经过次级键。第16页AspHisSer胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶活活性性中中心心活性中心主要基团活性中心主要基团:His57,Asp102,Ser195第17页 2.2.必需基团必需基团指酶表现催化活性不可缺乏基团，指在活性指酶表现催化活性不可缺乏基团，指在活性中心之外一些区域，不与底物直接作用。中心之外一些区域，不与底物直接作用。第18页底底 物物 活性中心以外活性中心以外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 第19页三、与酶高效率相关主要原因（策略）三、与酶高效率相关主要原因（策略）1、邻近与定向效应邻近与定向效应 2、诱导契合与底物扭曲变形诱导契合与底物扭曲变形 3、共价催化共价催化 4、酸碱催化酸碱催化 5、微环境影响、微环境影响第20页酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化功效基团酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化功效基团第21页胰凝乳蛋白酶反应详细机制（胰凝乳蛋白酶反应详细机制（1）结合底物结合底物His57 质子供体质子供体形成共价形成共价ES复合物复合物C-N键断裂键断裂底物底物第22页胰凝乳蛋白酶反应详细机制（胰凝乳蛋白酶反应详细机制（2）羰基产物释放羰基产物释放四面体中间物四面体中间物瓦解瓦解水亲核攻击水亲核攻击羧基产物释放羧基产物释放第23页第三节第三节酶促反应动力学酶促反应动力学第24页本节需要处理问题n底物浓度与酶促反应速度影响n酶浓度对酶促反应速度影响npH对酶促反应速度影响n温度对酶促反应速度影响n激活剂对酶促反应速度影响n抑制剂对酶促反应速度影响第25页一、底物浓度对反应速度影响一、底物浓度对反应速度影响（一）、曲线基本含义（一）、曲线基本含义I.单底物、单产物反应单底物、单产物反应II.酶酶促促反反应应速速度度普普通通在在要要求求反反应应条条件件下下，用用单单位时间内底物消耗量和产物生成量来表示位时间内底物消耗量和产物生成量来表示III.反反应应速速度度取取其其初初速速度度，即即底底物物消消耗耗量量很很小小（普通在（普通在5以内）时反应速度以内）时反应速度IV.底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度v在其它原因不变情况下，底物浓度对反应速在其它原因不变情况下，底物浓度对反应速 度影响呈矩形双曲线关系。度影响呈矩形双曲线关系。第26页当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。SSV VVmaxVmax第27页伴随底物浓度增高伴随底物浓度增高反应速度不再成正百分比加速；反反应速度不再成正百分比加速；反应为混合级反应。应为混合级反应。SSV VVmaxVmax第28页当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。反应为零级反应。SSV VVmaxVmax第29页（二）米氏方程式（二）米氏方程式第30页第31页中间产物中间产物 1.1.快速平衡理论与稳态平衡理论快速平衡理论与稳态平衡理论E+S k1k2k3ESE+P快速平衡理论 19 Michaelis和Meuten 提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假定ES分解成产物逆反应可忽略不计，所以在“快速平衡”理论基础上推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间定量关系，称为米氏方程。稳态平衡理论 1925年Briggs和Haldane提出，反应进行一段时间后，ES浓度增加到一定值时，ES也在不停分解，只有当ES生成速度与分解速度相等时，ES浓度才保持不变，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。第32页 2.什么是米氏方程式？19Michaelis和Menten在快速平衡理论基础上提出反应速度与底物浓度关系数学方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)，1925年Briggs和Haldane在稳态平衡理论基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程S：底物浓度：底物浓度 V：反应速度：反应速度 Vmax：最大反应速度：最大反应速度m：米氏常数：米氏常数第33页米米氏氏方方程程推推导导令令：将将（4）代入代入（3），则，则：ES生成速度生成速度：，ES分解速度分解速度：即即：则则：(1)经整理得经整理得：因为酶促反应速度由因为酶促反应速度由ES决定，即决定，即，所以所以(2)将将（2）代入代入（1）得得：(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于稳态稳态时时：当当Et=ES时时，(4)所以所以 第34页当反应速度为最大反应速度二分之一当反应速度为最大反应速度二分之一当反应速度为最大反应速度二分之一当反应速度为最大反应速度二分之一时时时时 Km值推导值推导KmS*Km值等于酶促反应速度为最大反应速度二分值等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物浓度，单位是之一时底物浓度，单位是mol/L。2Km+S Vmax VmaxSV VmaxmaxV VSSKKmmV Vmaxmax/2 /2 第35页Km意义意义 Km值值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物浓度。物浓度。意义：意义：a)Km是酶特征性常数之一；是酶特征性常数之一；b)Km可表示酶对底物亲和力；可表示酶对底物亲和力；c)同一酶对于不一样底物有不一样同一酶对于不一样底物有不一样Km值。值。第36页 Vmax意义意义定义：定义：Vmax是酶完全被底物饱和时反应速度，是酶完全被底物饱和时反应速度，与酶浓度成正比。与酶浓度成正比。意义：意义：Vmax=K3 E 假如酶总浓度已知，可从假如酶总浓度已知，可从Vmax计算计算 酶酶 转换数转换数，即动力学常数，即动力学常数K3。第37页LineweaverLineweaverBurkBurk作图法作图法 双倒数作图法双倒数作图法。1 1 K Km 1 1m 1 1 =+V V V Vmax S max S V Vmaxmax取米氏方程式倒数形式：取米氏方程式倒数形式：1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km3.3.米氏常数米氏常数KmKm测定测定第38页二、酶浓度对酶促反应速度影响二、酶浓度对酶促反应速度影响 当当SE，酶酶可可被被底底物物饱饱和和情情况况下下，反反应应速速度度与与酶酶浓浓度度成成正正比比关关系系式式为为：V=K3 E第39页三、温度对酶促反应速度影响三、温度对酶促反应速度影响n(1)、一方面是温度升高,酶促n 反应速度加快；n(2)、其次,温度升高,酶n 高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失；n(3)、所以大多数酶都有一个最n 适温度。在最适温度条件n 下,酶促反应速度最大。第40页四四、pH对酶促反应速度影响对酶促反应速度影响第41页五、激活剂五、激活剂对酶作用影响对酶作用影响 金属离子：金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：阴离子：Cl-、Br-有机分子有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA定义：凡是能提升酶活性物质，称为酶激活剂。定义：凡是能提升酶活性物质，称为酶激活剂。类别：类别：第42页六、抑制剂对酶反应影响六、抑制剂对酶反应影响n酶抑制作用酶抑制作用 有些物质能与酶分子上一些必须基团结合（作用),使酶活性中心化学性质发生改变，造成酶活力下降或丧失。n失活作用失活作用 凡可使酶变性而引发酶活力丧失作用。n抑制剂抑制剂 能够引发酶抑制作用化合物。n抑制剂特点抑制剂特点 a.在化学结构上与被抑制底物分子或底物过渡状态相同。b.能够与酶活性中心以非共价或共价方式形成比较稳定复合体或结合物。第43页二者区分：二者区分：n抑制剂对酶抑制作用有选择性，一种抑制剂只能引起一种酶或一类酶活性丧失活降低，而蛋白质变性剂可使全部酶变性失活。n在抑制剂与酶结合而导致抑制作用中，抑制剂一般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶底物分子或底物过渡态相似（结构上）。其次能够与酶活性中心以非共价键或共价方式形成比较稳定复合体或结合物，而变性剂则作用方式较多。第44页抑制作用类型抑制作用类型 非专一性不可逆抑制非专一性不可逆抑制 不可逆抑制作用不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制专一性不可逆抑制 抑制作用抑制作用 竞争性抑制竞争性抑制 可逆抑制作用可逆抑制作用 非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制第45页(1)不可逆抑制作用 抑制剂与酶反应中心活性基团以共价形式结合，引发酶永久性失活。第46页非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂 抑抑制制剂剂作作用用于于酶酶分分子子中中一一类类或或几几类类基基团团，这这些些基基团中包含了必需基团，因而引发酶失活。团中包含了必需基团，因而引发酶失活。类型类型：第47页专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心一些基团不可逆结合，引发酶活性丧酶活性中心一些基团不可逆结合，引发酶活性丧失。失。实例：有机磷杀虫剂实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第48页（2）可逆性抑制作用抑抑制制剂剂通通常常以以非非共共价价键键与与酶酶或或酶酶-底底物物复复合合物物可可逆逆性性结结合合，使使酶酶活活性性降降低低或或丧丧失失；抑抑制制剂剂可可用用透透析析、超滤等方法除去。超滤等方法除去。竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 第49页竞争性可逆抑制竞争性可逆抑制一些抑制剂化学结构与底物相同，因而能与底物竟争与酶活一些抑制剂化学结构与底物相同，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。性中心结合。竟争性抑制通常能够经过增大底物浓度，即提升底物竞争能竟争性抑制通常能够经过增大底物浓度，即提升底物竞争能力来消除。力来消除。动力学：动力学：VmaxVmax不变；不变；KmKm值增加，酶与底物亲和力降低。值增加，酶与底物亲和力降低。磺胺类药品设计磺胺类药品设计 第50页第51页竞争性抑制曲线竞争性抑制曲线第52页 磺胺类药品抑菌机制磺胺类药品抑菌机制与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞竞争二氢叶酸合成酶争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸第53页非竞争性可逆抑制非竞争性可逆抑制定义：定义：酶可同时与底物及抑制剂结合，引发酶分子构酶可同时与底物及抑制剂结合，引发酶分子构象改变，并导至酶活性下降。因为这类物质并不是与象改变，并导至酶活性下降。因为这类物质并不是与底物竞争与活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。底物竞争与活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。动力学：动力学：VmaxVmax减小，减小，KmKm不变，酶与底物亲和力不变。不变，酶与底物亲和力不变。金属离子，金属离子，EDTAEDTA等等 第54页第55页非竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线第56页n定义：抑制剂不与酶结合，只与ES复合物结合，引、起酶活性下降。n动力学：km降低，酶对底物亲和力增加，最大反应 速度降低，也无法经过改变底物浓度而改 变反应抑制剂影响。n举例：多底物反应中反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用第57页第58页反竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线第59页（一）、酶分离纯化普通标准与蛋白质相同 1、材料预处理；、材料预处理；2、破碎细胞；、破碎细胞；3、蛋白质粗提（与杂质分开）；、蛋白质粗提（与杂质分开）；4、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、有机溶剂法）；、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、有机溶剂法）；5、粗制品纯化（凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法）。、粗制品纯化（凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法）。七、酶分离纯化和活力测定七、酶分离纯化和活力测定第60页1.酶活力（酶活力（enzyme activity,也称酶活性）也称酶活性）（二）、酶活力与测定（二）、酶活力与测定 酶催化一定化学反应能力，用在一定条件下酶所催化反酶催化一定化学反应能力，用在一定条件下酶所催化反应反应速度来表示。应反应速度来表示。酶活力大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（酶活力大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit,U），就是表示酶量多少单位。其表示方法与全部测定方法），就是表示酶量多少单位。其表示方法与全部测定方法相关。相关。第61页习惯上沿用单位如习惯上沿用单位如:乳酸乳酸+NAD+丙酮酸丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶活力可用乳酸脱氢酶活力可用丙酮酸增加量丙酮酸增加量表示，也可用表示，也可用340nm光吸收增加量光吸收增加量来表示。来表示。第62页2.酶活力单位表示方法酶活力单位表示方法 国际单位国际单位(IU)：1961年年 在最适条件下，每分钟催化在最适条件下，每分钟催化1mol底物降低或产物生产底物降低或产物生产所需酶量为一个国际单位。所需酶量为一个国际单位。催量单位催量单位(katal)：1972年年 指在最适条件下，每秒钟使指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所底物转化为产物所需酶量。需酶量。1Kat6107IU，能够以纳，能够以纳Kat、微、微Kat来进行来进行换算。换算。第63页3测定酶活力时应注意几点测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度）应测反应初速度（2）酶反应速度普通用单位时间）酶反应速度普通用单位时间 内产物增加量来表示。内产物增加量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、）测酶活力时应使反应温度、pH、离子、离子 强度和底物浓度等原因保持恒定。强度和底物浓度等原因保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使）测定酶反应速度时，应使SE。产产物物浓浓度度P(t)第64页4.酶活力测定方法酶活力测定方法（1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometry）该法要求酶底物和产物在紫外或可见光部分该法要求酶底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不一样。光吸收不一样。如氧化还原酶类。如氧化还原酶类。简便、快速、准确。简便、快速、准确。一个样品可屡次测定，有利于动力学研究。一个样品可屡次测定，有利于动力学研究。可检测到可检测到10-9mol/L水平改变。水平改变。优点：优点：第65页习惯上沿用单位如习惯上沿用单位如:乳酸乳酸+NAD+丙酮酸丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶活力可用乳酸脱氢酶活力可用丙酮酸增加量丙酮酸增加量表示，也可用表示，也可用340nm光吸收增加量光吸收增加量来表示。来表示。第66页（2）荧光法（）荧光法（fluorometry）该法要求酶反应底物或产物有荧光改变。该法要求酶反应底物或产物有荧光改变。主要优点：灵敏度很高，能够检测主要优点：灵敏度很高，能够检测10-12mol/L样品。样品。酶蛋白分子中酶蛋白分子中Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅残基以及一些辅酶、辅基，如基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。等都能发出荧光。例：乙醇例：乙醇+NAD+乙醛乙醛+NADH+H+乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶第67页（3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay)第一个酶产物为第二个酶底物，这两个酶系第一个酶产物为第二个酶底物，这两个酶系统在一起反应。统在一起反应。P1无光吸收或荧光改变，偶联后无光吸收或荧光改变，偶联后,P2有有光吸收或荧光改变。光吸收或荧光改变。第68页例：测己糖激酶活性例：测己糖激酶活性 葡萄糖葡萄糖+ATP 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸+ADP 己糖激酶己糖激酶葡糖葡糖-6-磷酸磷酸+NADP 葡萄糖酸葡萄糖酸-6-磷酸磷酸+NADPH+H+G-6-P脱氢酶脱氢酶第69页5.酶比活力（酶比活力（specific activity，也称比活性），也称比活性）比活力：比活力：指每指每mgmg蛋白质所含有酶活力，普通用蛋白质所含有酶活力，普通用U/mgU/mg蛋白蛋白 质来表示。质来表示。比活力有时也可用每比活力有时也可用每g或每或每ml酶含多少个活力单位来表示。酶含多少个活力单位来表示。比活力总活力单位数比活力总活力单位数蛋白质蛋白质总毫克数总毫克数 活力单位数活力单位数mg蛋白质蛋白质 (杂蛋白杂蛋白:包含酶蛋白及含非酶蛋白）包含酶蛋白及含非酶蛋白）比活力是酶纯度衡量主要指标之一比活力是酶纯度衡量主要指标之一第70页终点法（终止法）：测定完成一定量反应所需要时间，普通 测产物生成量比很好。动力学方法（连续法）：测定一定时间内所起化学改变量，灵敏度较高。6、测定酶活力普通方法第71页 1.纯化倍数 2.比活力 3.回收率 （三）、怎样衡量纯化酶质量（三）、怎样衡量纯化酶质量 第72页 第第 四四 节节 酶调整酶调整第73页一一、酶原与酶原激活酶原与酶原激活酶原酶原酶原酶原 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶无活性前体，以前体物质称为酶原。无活性前体，以前体物质称为酶原。无活性前体，以前体物质称为酶原。无活性前体，以前体物质称为酶原。酶原激活酶原激活酶原激活酶原激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化过在一定条件下，酶原向有活性酶转化过在一定条件下，酶原向有活性酶转化过在一定条件下，酶原向有活性酶转化过程。程。程。程。第74页 酶原激活机理酶原激活机理酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶活性中心形成或暴露出酶活性中心 一个或几个特定肽键断裂，水解掉一个或几个特定肽键断裂，水解掉一个或几个短肽一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下第75页赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝S SS SS SS S464618183 3甘甘异异缬缬组组丝丝S SS SS SS S肠激酶肠激酶肠激酶肠激酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶活性中心活性中心活性中心活性中心胰蛋白酶原激活过程胰蛋白酶原激活过程胰蛋白酶原激活过程胰蛋白酶原激活过程第76页 酶原激活生理意义酶原激活生理意义防止细胞产生酶对细胞进行本身消化，并防止细胞产生酶对细胞进行本身消化，并使酶在特定部位和环境中发挥作用，确保体内使酶在特定部位和环境中发挥作用，确保体内代谢正常进行。代谢正常进行。有酶原能够视为酶储存形式。在需要时，有酶原能够视为酶储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性酶，发挥其催化作用。酶原适时地转变成有活性酶，发挥其催化作用。第77页二、变构酶二、变构酶 变构酶（别构酶）变构酶（别构酶）有些酶能够与一些化合物（称为变构剂）发生非共价结合，引发酶分子构象改变，对酶起到激活或抑制作用，这类酶通常称为。结构特点结构特点 活性中心（结合部位和催化部位）和变构中心（特殊调控部位）。注意：注意：变构中心不是酶活性中心组成部分。变构中心不是酶活性中心组成部分。第78页酶别构（变构）效应示意图酶别构（变构）效应示意图效应剂效应剂别别构构中中心心活性活性中心中心第79页调整物调整物：也称效应物，普通指是酶底物或底物类似物：也称效应物，普通指是酶底物或底物类似物 或代谢终产物。或代谢终产物。别构效应别构效应：调调整整物物与与别别构构中中心心结结合合后后，诱诱导导出出或或稳稳定定住住酶酶分分子子某某种种构构象象，使使酶酶活活性性中中心心对对底底物物结结合合和和催催化化作作用用受受到到影影响响，从从而而调调整整酶反应速度代谢过程，这种效应称为别构效应。酶反应速度代谢过程，这种效应称为别构效应。正效应物：指效应物结合使酶活性升高，也称别构激活剂。正效应物：指效应物结合使酶活性升高，也称别构激活剂。负效应物负效应物:指效应物结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。指效应物结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。第80页（1 1）常为多个亚基组成寡聚体；）常为多个亚基组成寡聚体；（2 2）含有别构效应；）含有别构效应；（3 3）动力学曲线）动力学曲线不符合米曼方程双曲线；不符合米曼方程双曲线；（4 4）酶分子上含两个中心或部位：活性中心）酶分子上含两个中心或部位：活性中心 （活性部位）和别构中心（别构部位）。（活性部位）和别构中心（别构部位）。1963年，年，Monod等首次提出别构酶概念。等首次提出别构酶概念。他认为别构酶应具备以下特征：他认为别构酶应具备以下特征：第81页 同促效应同促效应：配体相同。当一个效应物与酶结合后，配体相同。当一个效应物与酶结合后，影响另一相同效应物与酶结合。影响另一相同效应物与酶结合。异促效应异促效应：配体不一样。当一个效应物与酶结合后，配体不一样。当一个效应物与酶结合后，影响另一不一样效应物与酶另一部分结合。影响另一不一样效应物与酶另一部分结合。别构效应种类别构效应种类1 1、依据配体性质分、依据配体性质分第82页2、协同效应协同效应 一个效应物分子与变构酶结合，对第二个效应一个效应物分子与变构酶结合，对第二个效应 物分子结合产生影响，这种效应为协同效应。物分子结合产生影响，这种效应为协同效应。正协同效应正协同效应：指效应物分子与变构酶结合后，本身构指效应物分子与变构酶结合后，本身构 象发生改变，有利于后续底物分子或调整象发生改变，有利于后续底物分子或调整 物分子结合。物分子结合。负协同效应负协同效应：指效应物分子与变构酶结合后，本身构指效应物分子与变构酶结合后，本身构 象发生改变，不利于后续底物分子或调整象发生改变，不利于后续底物分子或调整 物分子结合。物分子结合。第83页别构酶调整两种模型别构酶调整两种模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序改变依次序改变序变模型（序变模型（KNW）：）：1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer 提出。提出。第84页齐变模型（齐变模型（MWCMWC）：）：19651965年由年由MonodMonod、WymanWyman和和ChangeuxChangeux提出。提出。S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）T状态（对称亚基）状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基对称亚基对称亚基齐步改变齐步改变第85页别构酶与非调整酶动力学曲线比较第86页别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase第87页ATCase活性调整机理活性调整机理 有催化活性构象有催化活性构象 无催化活性构象无催化活性构象 第88页三、三、同工酶同工酶*定义定义指同一个属中由不一样基因或等位基因编码指同一个属中由不一样基因或等位基因编码多肽链组成单体、纯聚体或杂交体，能多肽链组成单体、纯聚体或杂交体，能催化相同催化相同化学反应，而其分子结构、理化性质乃至免疫学化学反应，而其分子结构、理化性质乃至免疫学性质不一样一组酶。性质不一样一组酶。第89页H HH HH HH HH HH HH H MMH HH HMMMMH HMMMMMMMMMMMMMMLDHLDH1 1 (H(H4 4)LDHLDH2 2(H(H3 3M)M)LDH LDH3 3(H(H2 2MM2 2)LDHLDH4 4(HM(HM3 3)LDHLDH5 5 (M(M4 4)乳酸脱氢酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶举例：举例：举例：举例：乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH(LDH1 1 LDHLDH5 5)第90页乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线第91页问答题问答题1、影响酶促反应原因有哪些？它们是怎样影响？、影响酶促反应原因有哪些？它们是怎样影响？2、试比较酶竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用异同。、试比较酶竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用异同。3、什什么么是是米米氏氏方方程程，米米氏氏常常数数Km意意义义是是什什么么？试试求求酶酶反反应应速速度度到到达达最最大大反应速度反应速度99时，所需求底物浓度（用时，所需求底物浓度（用Km表示）表示）4、什什麽麽是是同同工工酶酶？为为什什麽麽能能够够用用电电泳泳法法对对同同工工酶酶进进行行分分离离？同同工工酶酶在在科科学学研究和实践中有何应用？研究和实践中有何应用？5、举例说明酶结构和功效之间相互关系。、举例说明酶结构和功效之间相互关系。6、称称取取25毫毫克克某某蛋蛋白白酶酶制制剂剂配配成成25毫毫升升溶溶液液，取取出出1毫毫升升该该酶酶液液以以酪酪蛋蛋白白为为底底物物,用用Folin-酚酚比比色色法法测测定定酶酶活活力力,得得知知每每小小时时产产生生1500微微克克酪酪氨氨酸酸。另另取取2毫毫升升酶酶液液，用用凯凯式式定定氮氮法法测测得得蛋蛋白白氮氮为为0.2毫毫克克。若若以以每每分分钟钟产产生生1微微克克酪酪氨氨酸酸酶酶量量为为一一个个活活力力单单位位计计算算，依依据据以以上上数数据据，求求出出（1）1毫毫升升酶酶液液中中含含有有蛋蛋白白质质和和酶酶活活力力单单位位数数；（2）该该酶酶制制剂剂比比活活力力；（3）1克克酶酶制制剂剂总总蛋蛋白含量和酶活力单位数。白含量和酶活力单位数。名词解释名词解释活活性性中中心心 全全酶酶 酶酶原原 活活力力单单位位 比比活活力力 米米氏氏方方程程 Km 诱导契合变构效应诱导契合变构效应 ribozyme 辅酶和辅基辅酶和辅基 固定化酶固定化酶第92页