基于转录组学策略分析川银花...铜绿假单胞菌生物被膜的影响_赵玉婷.pdf

第 卷 第 期 年 月 成都大学学报（自然科学版）（）文章编号：（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；四川省科技厅科技创新苗子工程项目（）作者简介：赵玉婷（），女，硕士研究生，从事天然产物抗感染药物的筛选研究：通信作者：鲁 兰（），女，博士，研究员，从事抗感染小分子药物的筛选及机制研究：基于转录组学策略分析川银花对耐药铜绿假单胞菌生物被膜的影响赵玉婷，廖 黎，王镜雅，杨 晨，鲁 兰（成都大学 四川抗菌素工业研究所，四川 成都）摘 要：采用结晶紫染色法、扫描电镜法观察亚抑菌浓度川银花水煎液对耐药铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响，并从整体水平上运用转录组学技术分析耐药铜绿假单胞菌基因表达情况，对差异基因进行功能富集及通路分析结果显示，转录组测序共筛选出 个差异表达基因，其中下调基因 个，上调基因 个，可为耐药铜绿假单胞菌在临床上感染造成的相关疾病的治疗提供新思路关键词：川银花；转录组学；铜绿假单胞菌；亚抑菌浓度；生物被膜中图分类号：文献标志码：引 言铜绿假单胞菌（，）是极易引起慢性感染的常见病原菌之一 的耐药机制繁多，且极易形成多药耐药（，）菌株，菌株的不断增加，使一线抗菌药物难以治疗 感染 中药在抗感染方面受到越来越多关注，具有多途径、多组分与多靶点的特点，毒副作用小且不易产生耐药性，凸显了其在抗菌治疗中的良好应用前景 川银花为忍冬科忍冬属植物细毡毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎等药理作用 有研究通过性状鉴别、显微鉴别与超高效液相色谱法（）指纹图谱比较了川银花、金银花与山银花的异同，发现 种中药的成分具有一定相似性，且川银花的酚酸类成分占比最大，中药的酚酸类物质是其抗菌的功效成分金银花对、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌与蜡样芽孢杆菌等有一定的抑菌活性 研究发现，金银花对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超广谱 内酰胺酶大肠埃希菌与多重耐药肺炎链球菌等 种儿童呼吸道多重耐药菌具有较好的抑菌效果；金银花水煎剂在体外可通过消除 质粒的方式逆转产金属酶 的耐药性 目前关于川银花抑制临床耐药菌的作用机制研究较少，细菌生物被膜的形成是细菌产生耐药性的典型机制之一，可阻止药物穿入并逃逸宿主的免疫系统，是目前抗耐药性研究的热点 转录组学技术已经成为中药研究中的重要方法，本研究以收集的临床常见致病耐药 菌株为对象，观察川银花的水煎液对 菌株生物被膜的影响，采用转录组学技术从整体水平分析耐药 菌株基因表达情况，探究川银花抑制耐药 菌株生物被膜的作用机制 材 料 仪 器 型超净工作台（上海力申科学仪器有限公司），型立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），型隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），型数显游标卡尺（德清盛泰芯电子科技有限公司），型光吸收酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），型扫描电子显微镜（）（日立高新技术有限公司）材 料川银花，购自成都市荷花池中药材市场，经四川抗菌素工业研究所鲁兰研究员鉴定为忍冬科忍冬属植物细毡毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花；质控菌株（编号，），购自美国标准菌种收藏所；株临床分离 菌株，由四川抗菌素工业研究所提供；（）培养基（批号，），购自北京奥博星生物技术有限责任公司；结晶紫（批号，）、琼脂粉（批号，）、培养基（批号，），均购自索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨（批号，），购自英国 公司；无菌 孔板（批号，），购自无锡耐思生命科技股份有限公司；麦氏比浊仪（批号，），购自广东环凯微生物科技有限公司 方法与结果 药液制备称取川银花 ，用洁净纱布包好放置于煎药壶中，加入超纯水 ，武火煮沸后切换为文火煎 ，倒出取药液，加入 超纯水，按此方法继续煎煮药液，过滤合并 次药液，浓缩至，此时药液浓度为 ，灭菌，使用时现配现用 筛选耐药 菌株将复苏质控菌株 与临床分离 菌株用无菌生理盐水调整菌悬液麦氏比浊度为 ，用无菌棉签伸入菌悬液蘸取适量菌液后，将菌液在（）平皿上涂布均匀，晾干平皿，于平皿合适位置放置美罗培南、亚胺培南与左氧氟沙星药敏纸片，内倒置平板，下培养 菌株的耐药性根据相关的标准来判定，使用游标卡尺准确读取抑菌圈的直径筛选出 株耐 种抗生素的 菌株，名称依次为、和，种抗生素对耐药 和 菌株的抑菌圈直径结果见表 菌株的抑菌圈直径结果均处于质量控制（）范围内，美罗培南和亚胺培南对 株临床 菌株的抑菌圈直径均，左氧氟沙星对 株临床 菌株的抑菌圈直径均 菌物的最低抑菌浓度（）是未见细菌生长时的最低药物浓度表 药物对 和 菌株的抑菌圈直径和 折点药敏纸片菌株抑菌圈直径 解释类别和抑菌圈直径折点 美罗培南（）亚胺培南（）左氧氟沙星（）注：、和 分别表示敏感、中度敏感和耐药 其中，美罗培南对 的 范围为 ，亚胺培南对 的 范围为 ，左氧氟沙量对 的 范围为 川银花水煎液对耐药菌株的 复苏选出的 和 株耐药 菌株，用无菌生理盐水调至菌悬液麦氏比浊度为 ，稀释菌悬液 倍，稀释后的菌悬液用于后续实验采用琼脂二倍稀释法，分别于无菌平皿内加入浓度为 的川银花水煎液 ，（）培养基 ，混匀，使每皿中所含的川银花水煎液终浓度依次为、和 ；另外再配制左氧氟沙星作为阳性对照组，于无菌平皿内加入 浓度为 左氧氟沙星，（）培养基，混匀，使每皿中所含左氧氟沙星的终浓度依次为、.、和 待平皿中的含药琼脂培养基冷却凝固后，用多点接种仪接种稀释好的菌液，并且设立不含药的菌对照组，下培养成都大学学报（自然科学版）第 卷 川银花水煎液对 和 株耐药 菌株的 值见表 左氧氟沙星对 和 株耐药 菌株的 值分别为、和 ，川银花对 和 株耐药 菌珠的 值均为 结合前期的药敏纸片结果，采用 菌株进行后续实验表 川银花水煎液对 和 株耐药 菌株的 值菌株左氧氟沙星（）川银花水煎液（）菌对照组 亚抑菌浓度对菌株生物被膜的影响 在 平皿上将耐药 菌株培养 ，挑取数个单菌落于营养肉汤中，调至菌悬液麦氏比浊度为 ，用营养肉汤稀释 倍备用 在 孔板第 列加入无菌营养肉汤 ，作为菌对照组；第 列分别加入浓度为、的川银花水煎液各 ，每列 个复孔；再在第 列的 个复孔中加入稀释好的菌液，使第 列川银花药物终浓度依次为、，即川银花药物浓度范围为 ；其余孔加入 的营养肉汤培养基 于 恒温培养箱中，培养 培养结束后，吸弃 孔板中每孔的剩余培养液，用灭菌生理盐水漂洗 次，去除浮游菌，加入 浓度为 的结晶紫溶液染色 ，用无菌生理盐水缓慢洗去多余结晶紫，加入 无水乙醇溶解 菌株生物被膜，在波长为 处用酶标仪测定各孔吸光度值 亚抑菌浓度的川银花水煎液对 菌株生物被膜的影响作用见表 与菌对照组相比，川银花水煎液在亚抑菌浓度为 和 （即 和 ）时，对 菌株生物被膜形成有抑制作用（和 ）川银花水煎液浓度在 （即）时，抑制 菌株生长，也抑制其生物被膜形成表 亚抑菌浓度对 菌株生物被膜形成的影响（）川银花水煎液浓度（）值（）（）（）（）（）菌对照组 注：与菌对照组比较，亚抑菌浓度对菌株生物被膜形态学的影响 盖玻片经高压灭菌后置于无菌 孔平底培养板中，每孔 片，斜放在孔中，菌对照组加入 肉汤培养基，低、中和高剂量组分别加入 的含药物质量浓度为、和 的肉汤液体培养基，将 的 的 菌体混悬液加入 孔板中，封口膜密封，孵育 后取出盖玻片，弃去培养基，用高压灭菌的 缓冲液缓缓漂洗各孔盖玻片 次，去除浮游菌，用 的戊二醛固定 ，形态学观察 亚抑菌浓度的川银花水煎液对 菌株生物被膜的作用如图 所示 图显示，川银花对 生物被膜的抑制作用随药物质量浓度增加而加强，其中生物被膜产生量为菌对照组 （A）菌对照组（B）1/8 MIC（D）1/2 MIC（C）1/4 MIC图 亚抑菌浓度下 菌株生物被膜的 图 转录组测序及差异表达基因分析复苏 菌株，置 下培养 ，用灭菌生理盐水调至菌悬液麦氏比浊度为 ，培养基稀释菌量至 左右 在 、第 期 赵玉婷，等：基于转录组学策略分析川银花对耐药铜绿假单胞菌生物被膜的影响 条件下培养 ，测定菌液麦氏比浊度为 左右 设立不含药液的菌对照组，给药组则在培养液加入适量川银花水煎液，使药物终浓度为 （即 ），恒温培养 然后在 、条件下离心 ，吸弃培养液，用灭菌生理盐水洗涤 菌株 次，然后在、条件下离心 ，吸干生理盐水，于 贮存样品，菌对照组和给药组各取 个平行样品检测 用 软件分析 组基因差异表达，下调差异基因筛选标准为 ，；上调差异基因的筛选标准为 ，分析结果表明，给药组与菌对照组进行比较，有 个表达基因发生明显变化，包括上调基因 个，下调基因 个，结果如图 所示 其中，绿色代表下调基因，红色代表上调基因，蓝色代表无显著差异基因302010-log10(P)-5-2-1 14 7log2 FoldChangeP1上调基因 156下调基因 206无显著差异基因 5103图 差异基因分布火山图 差异表达基因 生物富集和 通路分析 差异表达基因 生物富集在 数据库中分析，筛选标准为 ，并绘制生物过程（）、细胞组成（）和分子功能（）结果注释图 差异基因的 通路分析在 数据库中进行在差异表达基因进行 生物富集分析结果中，满足筛选标准的上调基因 和 条目共 个，如图（）所示 主要富集在阴离子跨膜转运、有机酸跨膜转运与羧酸跨膜转运；没有显著富集；主要富集在电子转移活性、血红素结合与 结合等、和 条目中满足筛选标准的下调基因共 个，如图（）所示 大部分富集在 氨基酸代谢过程、氨基酸分解代谢过程、细胞氨基酸分解代谢过程、硫化合物代谢过程、天冬氨酸家族氨基酸代谢过程与氧化还原过程；主要富集在外膜边界质周空间；主要富集在铁离子结合与抗氧化活性等过程阴离子跨膜转运有机酸跨膜转运羧酸跨膜转运电子转移活性血红素结合四吡咯结合辅因子结合氧化还原酶活性NADP 结合010 20（A）上调基因基因数量氧化还原过程天冬氨酸家族氨基酸代谢过程硫化合物代谢过程-氨基酸代谢过程细胞氨基酸分解代谢过程-氨基酸分解代谢过程外膜边界质周空间氧化还原酶用于过氧化物作为受体氧化还原酶活性抗氧化活性辅因子结合铁离子结合010 20 30（B）下调基因基因数量BPMFBPCCMF条目条目图 生物富集分析图 对差异表达基因进行 通路分析，由筛选标准得到 条与上调基因相关的通路，如图（）所示 富集在抗生素的生物合成、不同环境中的微生物代谢、碳代谢、吩嗪生物合成、代谢途径、次级代谢产物的生物合成、糖酵解 糖异生、果糖和甘露糖代谢、磷酸转移酶系统（）、戊糖磷酸途径、精氨酸生物合成、柠檬酸循环（循环）与氮代谢 下调基因得到 条通路，如图（）所示 富集在代谢途径、阳离子抗菌肽（）耐药性、色氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、群体感成都大学学报（自然科学版）第 卷 应、丙氨酸 天冬氨酸 谷氨酸代谢、生物被膜形成、卟啉与叶绿素代谢、碳代谢、赖氨酸降解、甘油磷脂代谢、次级代谢产物的生物合成与芳香族化合物的降解51015205432数量-log10(P)抗生素的生物合成不同环境中的微生物代谢碳代谢吩嗪生物合成代谢途径次级代谢产物的生物合成糖酵解/糖异生果糖和甘露糖代谢磷酸转移酶系统（PTS）戊糖磷酸途径精氨酸生物合成柠檬酸循环（TCA 循环）氮代谢0.1 0.2 0.3富集因数富集因数（B）下调基因（A）上调基因通路代谢途径阳离子抗菌肽（CAMP）耐药性色氨酸代谢氨基糖和核苷酸糖代谢乙醛酸和二羧酸代谢群体感应丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢生物被膜形成-PA卟啉与叶绿素代谢碳代谢赖氨酸降解甘油磷脂代谢次级代谢产物的生物合成芳香族化合物的降解数量102030-log10(P)54320.1 0.2 0.3 0.4通路图 通路分析图 讨 论 是常见的条件致病菌之一，其引起的相关感染性疾病的治疗及严重耐药现象的出现成为临床的棘手问题 研究发现，许多中草药在抗菌、抗病毒及逆转耐药性方面具有确定的活性作用 中药是具有多途径、多组分与多靶点等特点的复杂化合物体系，近年来多组学技术已广泛应用于生物系统的整体变化水平研究中 转录组学技术可以从整体水平上研究中药干预前后细胞或组织中系列的基因变化情况，组学技术的应用更有利于对中药的作用机制进行全面而系统地研究 观察亚抑菌浓度川银花水煎液对临床耐药 菌株生物被膜形成的影响发现，川银花水煎液能抑制 菌株生物被膜的形成，并且生物被膜的形成量随着川银花药物质量浓度增加而减少通过转录组测序技术发现，川银花水煎液作用后，菌株中有 个表达基因发生明显变化，其中 个下调基因，个上调基因群体感应系统（，）是一种细菌细胞间的信号传递机制，在细菌生物被膜形成过程中，具有重要调控作用 下调基因主要富集在代谢途径、耐药性、色氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、群体感应、丙氨酸天冬氨酸 谷氨酸代谢与生物被膜形成 等生物学途径 本研究利用转录组学技术，发现亚抑菌浓度川银花水煎液能抑制耐药 菌株生物被膜的形成，作用的机制可能是通过下调相关基因的表达来影响细菌的 或氨基酸代谢等途径，从而抑制 菌株生物被膜的形成，为耐药 菌株在临床上感染造成的相关疾病的治疗提供新思路参考文献：林佳冰，高晓东，崔扬文，等 上海市 所医院临床病原学标本送检及耐药菌检出现状分析 中华医院感染学杂志，（）：丁烨，戴璐，俞娟 抗铜绿假单胞菌感染治疗方法研究进展 中华医院感染学杂志，（）：，（）：黄梅，谭余庆，罗俊，等 植物类中药抗细菌耐药性的研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：四川省食品药品监督管理局 四川省中药材标准成都：四川科学技术出版社，索彩仙，程学仁，潘礼业，等 忍冬属药材川银花与金银花、山银花的鉴别研究 中国现代中药，（）：张囡，杜丽丽，王冬，等 中药酚酸类成分的研究进展 中国现代中药，（）：赵弘毅，蒋粉荣，陈晓娅，等 中草药对铜绿假单胞菌及其群体感应抑制作用 广西大学学报（自然科学版），（）：，第 期 赵玉婷，等：基于转录组学策略分析川银花对耐药铜绿假单胞菌生物被膜的影响 ，（）：梁晓谊，黄玉环 味中药对儿童呼吸道多重耐药菌的体外药敏试验结果分析 黑龙江医药，（）：刘心伟，王志盛，许晓娜，等 金银花水煎剂对产金属酶铜绿假单胞菌耐药性的体外逆转作用 中华医院感染学杂志，（）：，（）：黄萍妹，胡晓磊，叶长生 转录组学与蛋白组学在三阴性乳腺癌中的预后研究进展 中国肿瘤临床，（）：姜云耀，孙明谦，马博，等 组学技术在现代中药药理研究中的应用与思考 世界科学技术中医药现代化，（）：邹昆，廖黎，陈婉，等 基于 技术分析亚抑菌浓度的四季青对耐药铜绿假单胞菌运动能力的抑制作用 中药药理与临床，（）：何家林，周杨杨，程强，等 四季青对临床铜绿假单胞菌运动能力抑制和生物被膜消除的量效关系 成都大学学报（自然科学版），（）：羿国娟 清热解毒中药抗耐药铜绿假单胞菌生物被膜的药效物质及作用机理研究 成都：成都大学，：，（）：翟贯星，陆璐，陈代杰，等 中药化合物的抗菌及增效作用 中国抗生素杂志，（）：王梦瑜，邵欣欣，李谨彤，等 中药抗菌活性分布规律及影响因素挖掘研究 天然产物研究与开发，（）：康倩君，涂灿，郭兆娟，等 基于转录组学的补骨脂酚致小鼠肝损伤种属差异 中国实验方剂学杂志，（）：张改君，苗静，郭丽颖，等 多组学联用在中药作用机制研究中的应用 中草药，（）：夏霜莉，王维，张冰琳，等 天麻总酚抗大鼠脑缺血再灌注损伤的转录组学分析及实验验证 中草药，（）：贡磊磊，许海玉，王岚，等 基于 高通量测序分析脑心通胶囊抑制炎症反应转录组学特征 中国中药杂志，（）：（责任编辑：伍利华），（，）：（），：；成都大学学报（自然科学版）第 卷