动植物检疫毕业论文-基于Candidatus-Liberobacter-asiaticum-β-operon的PCR检测技术研究.doc

华中农业大学毕业论文（或设计）基于Candidatus Liberobacter asiaticum-operon的PCR检测技术研究PCR Detection of Citrus Huanglongbing BacteriumBased on the -operon 目录摘 要II关键词IIAbstractIIKeywordsII1.前言12.材料和方法12.1 植物材料12.2 引物来源12.3 方法22.3.1总核酸的提取22.3.2核酸的检测和凝胶电泳分析22.3.3 PCR的扩增和凝胶电泳分析23 结果和分析23.1不同材料抽提的总DNA的浓度、纯度和完整性23.2 PCR扩增产物的电泳分析44.讨论6参考文献7致谢9附录实验试剂10摘 要以基于柑橘黄龙病病原亚洲菌系-操纵子的特异引物fA2/rJ5进行PCR扩增，依据是否有目标DNA片段的产生来检测柑橘黄龙病菌的存在与否。该检测技术，具有快速、简便、灵敏等特点，可用于柑橘黄龙病的早期诊断，对控制该病害的传播具有重大意义。关键词柑橘黄龙病；-operon；PCR；检测AbstractSpecific primer pairs fA2/rJ5 based on the -operon of Candidatus Liberobacter asiaticum was used for PCR detection of citrus Huanglongbing bacterium, The result was depended on whether the target DNA fragment was existed. This PCR protocol is efficient, convenient and sensitive for early detection of citrus Huanglongbing bacterium, which was very important for the control of the spread of the disease.Keywordscitrus Huanglongbing; -operon; PCR;detectionII 1.前言柑橘黄龙病是柑橘上的一种侵染性病害，引起柑橘产量、品质下降，甚至导致整株橘树枯死，橘园毁灭，给世界柑橘的生产造成极大威胁。20世纪初，在我国的华南地区首先发现了黄龙病，以后在福建、广西、江西、浙江、湖南、四川、云南、海南和台湾相继发现。目前柑橘黄龙病在亚洲、非洲和美洲地区都有发生，存在三种菌系，即亚洲菌系（Candidatus liberobacter asiaticus）；非洲菌系（Candidatus liberobacter africanus）和美洲菌系（Candidatus liberobacter amercanus）。柑橘黄龙病菌是一种韧皮部杆菌（Liberobacter），其病原菌难以得到分离和提纯，主要是通过木虱、接穗和苗木等途径传播。柑橘黄龙病表现的典型症状有3种，即黄化型、系统斑驳型和缺素型，使叶片变黄，影响果实发育，使柑橘产量降低，品质下降，病情严重时使根系腐烂，影响地上植株的生长，最终导致橘树死亡。近年来随着柑橘产业的发展，柑橘苗木调用混乱导致该病发生面积有逐年扩大的趋势；同时由于全球气候变暖影响，传病虫媒越冬范围扩大，也使得该病害的发病范围不断扩大。控制本病害的传播主要有三种措施：一.实行严格检疫，防止带病接穗和苗木的传播。二.建立无病苗木基地，选种无病苗木。三.铲除病株，防治虫媒介体。这些防治方法的有效实施，需要一套快速、灵敏、准确的检测技术相配合。而以往的一些检测方法，灵敏度不高，在一些未显症状的病株体内病原物极低，不能检测出这样低的浓度，只有寻找新的检测技术。通过PCR扩增技术，可以将微量的目标DNA片段进行特异性扩增、放大，既可以检测植株是否感染病原，又能获取大量的纯病原DNA，有利于柑橘黄龙病原的分子生物学研究，这也为防治柑橘黄龙病提供了理论和事实依据。2.材料和方法 2.1 植物材料纽荷尔脐橙（Citrus.sinensis）,表现为斑驳症状，经检测为阳性，在试验中作阳性对照，采自江西赣州；温州蜜柑（C.nushiu.cv.）,为健康柑橘植株叶片，采自华中农业大学柑橘园，在试验中作阴性对照。待检样品均采集于广州萝岗农业技术推广中心柑橘园，品种分别为甜橙（C.sinensis）和椪柑（C.reticulata）,叶片都变现为黄化、缺素症状，疑似感染黄龙病。以上实验材料，清理干净后分装于塑料带中，于-4冰箱中保存，备用。2.2 引物来源参考Hocquellet等1999，根据柑橘黄龙病菌亚洲菌系-operon基因序列设计特异引物fA2/rJ5，同源引物fA2碱基序列为5，-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3，,互补引物rJ5 碱基序列5，-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAA-3，,扩增片段大小为703bp。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2.3 方法2.3.1总核酸的提取 总核酸的提取方法参照丁芳等2004，主要过程为：取0.3g的柑橘叶片中脉（或完整叶片），剪碎后放入研钵中加液氮迅速研磨成粉末状，转入预冷的1.5ml的Eppedorf离心管中，加入800ul的2%CTAB抽提缓冲液（预热65），轻轻振荡摇匀；放入水浴箱中65水浴6090min，每隔10min轻摇1次。12000r/min瞬时离心2min取上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）,充分混匀5min。室温下，12000r/min离心10min，取上清液加等体积的氯仿/异戊醇（1：1），轻轻混匀。室温下，12000r/min离心5min，取上清液加入1/10体积的3M/L NaAc和2倍体积的无水乙醇（预冷）。-20冰箱中放置4h, 在4下16000r/min离心20min，弃上清液，沉淀用95%和75%的乙醇各清洗两次，晾干；视DNA量的多少加入适量的无菌ddH2O溶解。2.3.2核酸的检测和凝胶电泳分析 取1ulDNA溶解液，加入69ulddH2O稀释70倍，用核酸蛋白质检测仪(Amersham sciences,ULTROSTES 2100 PRO)分析总核酸的浓度和纯度； 1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。 2.3.3 PCR的扩增和凝胶电泳分析 PCR反应体系包括：10PCR反应缓冲液2.5L，同源引物和互补引物各1L，10mMoldNTPs0.5L，模板DNA1L，TaqDNA聚合酶0.2L（5U/L），灭菌ddH2O补足总体积25L，混合后置于PCR仪（Bio-Rad，PTC-200）上进行扩增反应。PCR扩增反应程序：95预变性3min；95变性30s，55退火30s，72延伸1min（最后一次10min），进行35次循环。反应完毕后，取PCR的扩增产物5L和10LoadingBuffer 1L混匀，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭（EB）染色后，在凝胶成像系统（Bio-Rad，GelDoc2000）下观察结果、拍照。3 结果和分析3.1不同材料抽提的总DNA的浓度、纯度和完整性核酸蛋白检测仪(Amersham sciences,ULTROSTES 2100 PRO)检测叶片中脉或叶片提取的总DNA的浓度、纯度结果如表1。表1 不同材料提取的总DNA浓度、纯度比较Tab.1 The comparison of the concentration and purity of total DNAfrom different samples抽提样品SamplesDNA浓度（ng/L）DNA Concentration纯度PurityA260/A230A260/A280纽荷尔脐橙.中脉16481.871.95温州蜜柑.中脉10421.761.86甜橙.中脉6761.991.80椪柑.中脉9352.061.83纽荷尔脐橙.叶片13251.781.85温州蜜柑.叶片8621.831.96甜橙.叶片8561.981.86椪柑.叶片10031.851.7中脉或叶片不同材料提取的DNA进行比较分析，两者浓度值接近，A260/A230和A260/A280均在1.85左右，说明纯度很高，符合PCR的扩增的要求。但相比而言，从中脉中提取的DNA比叶片高。电泳结果分析：图1.a显示表明，从叶脉中提取的总DNA电泳带明显、清晰，不含有杂质，没有发生降解现象，DNA结构完整；图1.b中显示表明，从叶片中提取的总DNA电泳带也比较明显，但含有少量的杂质，DNA有轻微的降解现象。这与叶片中富含有酚类、多糖和盐离子有关，对提取的DNA造成了一定的污染。其中甜橙叶片中提取的DNA（泳道7）电泳后出现拖带，含有较多的杂质，DNA也呈现降解；而从甜橙中脉中提取的DNA（泳道3）电泳后没有出现这种结果。经分析，这与叶片老化有关，叶肉组织中色素沉积，累积大量的杂质，核酸结构也不稳定，影响提取的DNA质量。因此，在实验中宜选择中脉作试验材料，且样品不要出现老化现象。图1 不同材料提取的总DNA电泳检测结果 (M.DNA LadderMarker 1.纽荷尔脐橙 2.温州蜜柑 3.甜橙 4.椪柑5.纽荷尔脐橙 6.温州蜜柑 7.甜橙 8.椪柑)Fig.1 Result of total DNA extracted from different materials by agarose gel electrophoresisiM.DNA Ladder Marker 1.Newhall navel orange 2.Mandarin orange 3.Sweet orange 4.Pokan5.Newhall navel orange 6. Mandarin orange 7. Sweet orange 8. Pokan3.2 PCR扩增产物的电泳分析以纽荷尔脐橙作阳性对照，温州蜜柑为阴性对照，分别甜橙和椪柑进行了PCR检测。在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分检测，结果如图2，其中图2.a中泳道1为阳性对照，扩增片段大小为703bp。泳道2和泳道5分别为阴性对照和空白清水对照，无扩增条带形成。泳道3没有特异条带产生，表明甜橙为阴性，没有感染柑橘黄龙病。泳道4中有特异条带形成，与阳性对照的电泳带一致，表明该片段为目标片段，椪柑检测为阳性，感染了柑橘黄龙病菌。图2.b中，泳道1和泳道4均有特异条带形成，泳道2和泳道3都没有产生特异条带，结果与图2.a相同，说明甜橙样品为阴性，椪柑为阳性。图2中两组不同材料的总DNA进行 PCR扩增后，中脉提取的DNA扩增后电泳带较叶片清晰，而叶片提取的DNA扩增后仍有少量杂质，形成模糊的阴影，说明中脉中提取物纯度高，PCR扩增质量比叶片提取物好。其中椪柑提取的总DNA经 PCR扩增后，经电泳得到的特异条带，中脉DNA的条带清晰，叶片DNA的条带弱，比较模糊，同时也证明柑橘黄龙病病原DNA适宜在叶片中脉中提取，PCR扩增的效果很好。在四种实验材料中，纽荷尔脐橙和椪柑有特异条带产生，而温州蜜柑和甜橙没有电泳带出现，说明PCR检测技术具有特异性。2种待检柑橘叶片中脉抽提的总DNA的浓度和纯度如表2所示，浓度值均在2800 ng/uL左右，纯度很好，由于DNA浓度太高，对DNA溶解液进行简单的倍数稀释，分别稀释10倍，总计4份。在相同PCR反应体系中进行扩增，结果如图3；椪柑样品总DNA经10倍稀释后有目标片段（泳道3）产生，扩增条带清晰，扩增片段大小为703bp，检测为阳性；而同样材料的椪柑总DNA（泳道1）却没有扩增产物形成。甜橙样品提取的总DNA和稀释10倍后的DNA（泳道2和泳道4）为模板进行扩增后，均无目标片段产生，结果显示为阴性。经分析，由于DNA浓度过高，抑制PCR扩增反应过程的进行，最终导致没有目标产物形成，而浓度偏低的DNA溶液却有目标产物生成。因此，在柑橘黄龙病检测中，注意试验设计要严谨，模板DNA的浓度要适中，避免浓度过高导致假阴性现象的发生，防止漏检误检。图2 不同材料DNA PCR扩增产物的电泳结果 (M. DNA Ladder Marker1.纽荷尔脐橙 2.温州蜜柑 3.甜橙 4.椪柑 5.灭菌水（CK）)Fig.2 PCR amplification products of DNA extracted from materials by agarose gel electrophoresisiM. DNA Ladder Marker1.Newhall navel orange 2.Mandarin orange 3.Sweet orange 4.Pokan5.Sterile water(CK)表2 两种材料中脉提取的总DNA浓度和纯度Table.2 The concentration and purity of total DNA from two samples样品材料SamplesDNA浓度（ng/L）DNA Concentration纯度PurityA260/A230A260/A280椪柑30131.92甜橙25371.871.94图3 两种材料抽提的DNA浓度稀释PCR分析M. DNA Ladder Marker 1.椪柑（3013ng/L） 2.甜橙（2537ng/L）3.椪柑样品DNA 10倍稀释（300ng/L）4.甜橙样品DNA 10倍稀释（250ng/L）Fig.3 Analysis of PCR amplification of DNA diluted extracted from two samplesM. DNA Ladder Marker 1. Pokan DNA（3013ng/L） 2. Sweet orange DNA（2537ng/L）3.Total DNA from Pokan diluted in the ration of 1；10（300ng/L）4.Total DNA from Sweet orange diluted in the ration of 1；10（250ng/L）4.讨论本实验中，引物fA2/rJ5是针对柑橘黄龙病菌-operon设计的一对特异性引物，可对目标DNA片段进行特异性PCR扩增，依据是否有扩增产物生成来检测柑橘黄龙病菌存在与否。若有目的扩增产物生成，则在凝胶电泳分析时有反应带形成，即可以判定该样品为阳性；如果没有反应带形成，则这个样品为阴性。这样，可以快速、准确地检测植株是否感染柑橘黄龙病病菌。柑橘黄龙病菌是一种韧皮部杆菌，在感病植物体内分布不均匀，主要分布于韧皮部筛管中，在中脉中提取的总DNA浓度含量高；叶片组织中富含有盐离子、酚类、蛋白质和多糖，容易造成DNA污染，因此，从中脉中抽提的DNA 进行PCR扩增后特异条带较其他部位更为明显，检测准确率也更高高。如图1中，中脉DNA的电泳条带比叶片DNA的要清楚，含有的杂质低，纯度高，DNA的质量好。同时在叶片DNA的电泳图中，泳道7（图1.b）的DNA污染严重，含有的杂质高，且出现DNA降解，主要是因为叶片老化有关，叶肉组织中沉积大量色素，DNA也不稳定，容易降解，含有的杂质多。因而，在样品的采集上，应选择新鲜的叶片，同时应该从中脉中抽提总DNA，这样能使DNA的质量提高，有利于更准确的得出实验结果。图2中，虽然两组实验检测结果一致，但是，从叶片中提取的DNA扩增后电泳产生的特异条带模糊，结果不明显。从DNA扩增电泳结果比较分析来看，以叶片为材料提取的DNA含有少量杂质，这与叶片富含有酚类、多糖、蛋白质等物质有关，研磨后在进行水浴过程中易释放污染DNA，经有机溶剂抽提不容易完全剔除，进行PCR扩增时特异条带模糊甚至产生假阴性，可导致PCR检测结果不稳定。图3中，从两种不同的实验样品椪柑和甜橙中脉里，抽提的总DNA浓度达到2500ng/L以上，纯度很好，含有的杂质低，适宜作PCR扩增。经PCR扩增后电泳分析，甜橙样品（泳道2和泳道4）检测为阴性；而椪柑总DNA直接为模板进行PCR扩增后，没有产生特异条带（泳道1），稀释10倍后却产生了特异条带（泳道3）。经分析，两者虽然为同一材料来源的DNA，且在相同的PCR反应体系，只存在浓度上的差异，显然由于浓度太高，导致PCR过程中没有扩增产物生成。因此在PCR反应体系中，模板DNA的浓度不宜太高，否则进行PCR检测过程中会造成目标DNA片段无法正常扩增。为了提高检测灵敏度和检测检测准确性，不仅要求试验材料要新鲜，保存方式要恰当，同时对整个反应体系要进行更合理的优化，科学的设计各个试验步骤，缩短试验过程的周期，这样更有利于有利于黄龙病的早期快速诊断，为柑橘黄龙病的预防提供重要的预警信号。参考文献1 丁 芳，易干军，王国平.应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究J.园艺学报，2004，31（6）：8038062 丁 芳.柑橘黄龙病病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究D.华中农业大学，2006，21（3）：1051083 孔维文，邓晓玲，梁志慧等.柑橘黄龙病病原DNA片段的克隆和序列分析.植物病理学报，2000，30（1）：71754 邓晓玲，梁志慧，唐伟文.快速检测柑橘黄龙病的研究.华南农业大学学报，1999，20（1）:145 邓秀新.世界柑橘品种改良进展J.园艺学报，2005，32（6）：114011466 田亚南，柯 穗，柯 冲.应用多聚酶链式反应技术和定量分析柑橘黄龙病病原.植物病理学报，1996，13（2）：2432507 田亚南，柯 穗，柯 冲.柑橘黄龙病诊断法的研究进展J.福建农业学报，1998，13（1）：27358 李德望，唐伟文，范怀忠。柑橘黄龙病的血清学诊断方法的初步研究。华南农业大学学报，1992，13（2）：16229 邹 敏，宋 震，唐科志等.柑橘黄龙病病原DNA的微量提取方法比较.中国农业科学院柑橘研究所10 邹 敏，周常勇.柑橘黄龙病病原和检测方法研究进展J.植物保护，2005，31（3）：1014 11 肖远辉，丁芳，曾继吾等.柑橘黄龙病和衰退病的同步PCR和RT-PCR检测J.果树学报，2006，23（4）：64264512 孟祥春，钟 云，刘 岩等.柑橘黄龙病PCR快速检测技术的建立与应用J.西北植物学报，2007，27（7）：1461146313 张利平，王中康，夏玉先等.柑橘黄龙病PCR检测快速制样技术比较研究A.中国病理学会14 林传光.关于柑橘黄龙病几个问题的讨论J.植物保护学报，1963（2）：23724115 廖晓兰，朱水芳，赵文军等.柑橘黄龙病病原16SrDNA克隆、测序及实时荧光PCR检测方法的建立J.农业生物技术学报，2004，12（1）：808516 Ayres A J,Massari C A,Lopessa,et a. lCurrent sta-tus of citrus HLB and efforts toward its eradication in So Pau-lo State Brazil,C .Second international Citrus Canker and Huanglongbing Research Workshop. 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