CTLA-4纳米抗体与肿瘤适配体共修饰的双靶向脂质体构建.pdf

医学理论与实践 年第卷第期 纳米抗体与肿瘤适配体共修饰的双靶向脂质体构建万瑞融 王希斌广西医科大学第一附属医院药学部广西南宁市 摘要 目目的的:制备 纳米抗体()/适配体 修饰的脂质体以制备一种能特异性靶向 细胞及肿瘤细胞的双靶向纳米制剂 方方法法:采用薄膜水化法制备得到纳米脂质体然后通过化学键的耦联将氨基修饰到脂质体上 适配体修饰巯基 纳米抗体自身带有巯基将三者进行迈克尔加成反应即可同时偶联纳米抗体和适配体到脂质体表面制备得到双靶向脂质体()运用透射电镜()、粒径和电位仪对 进行表征并通过流式细胞术检测其与活化 细胞及肝癌细胞 的结合情况 结结果果:制备的 为椭圆形的脂质体且表现呈均质、分散特征粒径大小在 左右 结合实验结果直接或间接验证了 与活化 细胞及肝癌细胞的特异性结合能力 结结论论:本研究创新性构建的双靶向脂质体能够特异性结合 细胞和靶细胞为肿瘤靶向治疗提供了一种新策略 基金项目:广西壮族自治区卫生健康委员会科研课题()通信作者:王希斌关键词 纳米抗体 适配体 脂质体 双靶向 肝癌中图分类号:文献标识码:/.:()/.:.().().:.:.免疫疗法是恶性肿瘤继手术、放疗和化疗之外的第四种治疗新方法其中把 淋巴细胞作为肿瘤杀伤的效应细胞称之为过继疗法是肿瘤免疫治疗的良好策略之一 但是传统的 细胞过继治疗肝癌方法难以获得满意的募集效应细胞至肿瘤部位效应同时缺乏靶向识别肿瘤细胞和正常细胞的能力因此需要寻找新的策略来提高 细胞过继治疗的效果双特异性抗体()是指能够同时靶向两个抗原或者一个抗原的两个不同表位的基因工程抗体 由于其特异性和双功能性现已在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中引起广泛关注 适配体是一类分子量小、易于修饰合成、低毒低免疫原性、组织渗透性强等优点的靶向识别分子也已在生物医药领域开展了广泛研究 本项目设想通过 纳米抗体阻断 细胞活化过程中的负性共刺激分子而进一步诱导 细胞的杀伤肿瘤效应同时联合适配体的肿瘤细胞靶向识别能力构建一种新型的 希望其能将更高效能的 细胞靶向募集至肿瘤部位从而发挥肿瘤的特异性杀伤作用 因此本研究利用前期工作已经筛选出的 特异性纳米抗体 结合能特异性结合肝癌细胞 的 适配体制备一种新型的 有望为肿瘤的免疫治疗提供一条有潜在 年第卷第期医学理论与实践临床应用价值的新策略材料与方法.主要材料棕榈酰基硬脂酰基()、双十八烷基溴化铵()、胆固醇()、二硬脂酰基 磷 脂 酰 乙 醇 胺聚 乙 二 醇 ()、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺()购自美国 公司修饰巯基的适配体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成其序列为:.实验仪器高速离心机(德国)冷冻干燥机(德国)小型喷雾干燥器 型激光粒度分析仪(英国)透射电子显微镜(日立日本)流式细胞仪(美国).实验方法.双靶向脂质体的制备()采用薄层水化法制备空载脂质体():将、和()按质量摩尔比 .比例溶解到圆底烧瓶的氯仿溶液中然后使用旋转蒸发仪(设定温度为)旋转蒸发 便可得到脂质薄膜状固体 连同圆底烧瓶将所得脂质薄膜放置于真空干燥仪中干燥过夜除去残留有机溶剂 然后将瓶底的脂质薄膜用/的枸橼酸缓冲液(.)进行水化随后置于 的水浴中超声 再使用液氮和 水浴循环冻融 次 将所得产物装入脂质体挤推器依次通过、的聚碳酸酯膜各 次最后便可得到直径约 的空白脂质体()制备适配体和纳米抗体共修饰的双靶向脂质体:纳米抗体、适配体、脂质体按照质量摩尔比 的比例混合到 溶液中混匀然后 条件下震荡孵育 最后使用 透析后即可获得 ()制备荧光脂质体:在全程避光条件下将纳米抗体、适配体、脂质体、荧光染料按质量摩尔比 混合到 溶液中然后按照制备 一样的步骤进行便可得到带荧光的 ()为了验证双靶向脂质体的体外靶向性能我们还制备了单一修饰的荧光脂质体包括只修饰适配体脂质体()和 只 修 饰 纳 米 抗 体 的 脂 质 体()即在上述空白脂质体中分别只加入适配体或纳米抗体溶液混匀余步骤同前.双靶向脂质体的表征 使用 粒度电位仪测量和分析脂质体的粒径和电位通过透射电子显微镜观察并拍摄脂质体的形态特点.双靶向脂质体体外靶向活性检测 流式细胞仪实验 采用 密度梯度离心法从健康供体的全血中分离出人外周血单核细胞()(已提供知情同意书)将 悬浮于含 的 培养基中 去除未贴壁细胞然后用尼龙羊毛纤维分离 细胞 所有流式细胞实验均在 下进行 使用植物血凝素(/)刺激 细胞然后将 刺激的 细胞在 内用/溶液振荡饱和以避免非特异性结合 在/中加入荧光双靶向脂质体(设置另外一组加入只修饰适配体的脂质体)孵育 洗涤 次后流式细胞仪检测结合情况检测双靶向脂质体与肝癌细胞 和人正常肝细胞 的结合:取对数生长期的 细胞同时设置不能与适配体 结合的 细胞作为对照分别取 细胞于 溶液中重悬然后加入 溶液、胎牛血清和荧光双靶向脂质体 混匀(设置另外一组加入只修饰纳米抗体的脂质体)混匀于、避光条件下孵育 最后使用 洗涤细胞并离心 重复洗涤 次最后重悬细胞进行流式细胞术检测 以上流式细胞术所获得数据均采用 软件进行分析结果.双靶向脂质体的表征通过 观察可以看到(见图)双靶向脂质体 具有圆球形或椭圆球形形态大小均质而且分散性良好 空载脂质体 的平均水化粒径是.在逐步修饰纳米抗体和适配体后平均粒径分别增大至.与.(见图)电位检测显示(见图)无修饰的空载脂质体的平均电位为.由于适配体核酸序列和纳米抗体蛋白表面为负电荷因此在修饰双靶向分子后靶向脂质体电位发生了负向偏移 经过检测双靶向脂质体表面平均电位为.这说明适配体修饰成功图 双靶向脂质体的表征.双靶向脂质体 的电镜图.双靶向脂质体 的粒径分布.双靶向脂质体 的电位图医学理论与实践 年第卷第期 .流式细胞仪分析双靶向脂质体的体外靶向能力为了分析双靶向脂质体 结合 刺激的人 细胞的能力进行了流式细胞术试验 结果表明 只修饰适配体的脂质体 不能结合活化的 细胞而双靶向脂质体 能识别活化的 细胞(见图)说明双靶向脂质体修饰纳米抗体后拥有了靶向结合 细胞上的 位点的能力 同时双靶向脂质体 也能识别表达肝癌 细胞(见图)却无法靶向结合 细胞(见图)说明双靶向脂质体通过修饰适配体后具备了特异性识别肿瘤细胞的能力图 流式细胞仪检测双靶向脂质体的体外靶向能力.双靶向脂质体 与 刺激的人 细胞的结合.双靶向脂质体 与人肝癌细胞 的结合.双靶向脂质体 与人肝细胞 的结合讨论细胞毒性 淋巴细胞相关抗原()受体是第一个用作临床靶标的免疫检查点也是 细胞表面最具代表性的免疫抑制点分子 目前人们利用 抗体阻断 细胞活化过程中 对 细胞活化后的抑制从而促进机体的抗肿瘤免疫应答使获得满意的抗肿瘤效应成为可能 然而传统抗体在实际应用中仍存在问题亟待解决如抗体分子量大在瘤内的穿透性欠佳等因此有必要建立更加高效、穿透力强的新型抗体用于肿瘤治疗 抗体人源化、高效化及小型化均已成为当前抗体药物研究的主要趋势 纳米抗体()是目前可以得到的稳定的可结合抗原的最小单位 纳米抗体是一种小型的基因工程抗体由于它具备良好稳定性、强组织穿透力及较弱的免疫原性使其在肿瘤免疫治疗等方面展现巨大的应用潜力 本课题组前期已筛选出了 特异性的纳米抗体实验证明其与 抗原有较好的结合力与活性具有巨大的应用潜力阻断 对 细胞活化后的抑制还不够如何将肿瘤杀伤效应 细胞富集至肿瘤部位也是目前研究的热点方向 适配体能够通过三维结构以高亲和力特异性结合在靶标上能够为主动靶向肿瘤细胞提供理想的靶向分子被广泛应用于药物靶向治疗及肿瘤检测等领域 因此本研究首次将纳米抗体和适配体联合结合纳米技术以脂质体为连接介质将这两种具有不同靶向效能的小分子连接从而构建一种具有 功能的双靶向脂质体 本 实 验 结 果 初 步 证 明 了 构建成功并且其具有同时靶向结合 活化的 细胞和肿瘤细胞 的能力 但是 是否能将活化 细胞定向募集至肿瘤细胞实现对肿瘤的高效且特异性杀伤还有待本课题组在后续实验中进一步验证总之本研究制备了一种 纳米抗体与肿瘤适配体共修饰的双靶向脂质体 理论上这种脂质体能通过 阻断 淋巴细胞活化过程中的负性共刺激分子而进一步诱导 细胞的杀伤肿瘤效应同时基于适配体对肿瘤细胞的靶向识别能力可以将肿瘤杀伤 淋巴细胞靶向募集至肿瘤部位进行特异性杀伤 而且通过替换靶向不同靶标的适配体可以实现对各种肿瘤的靶向治疗为肿瘤的免疫治疗提供了新思路参考文献 .():.岳雅丽尹骏高向东等.双特异性抗体药物在肿瘤治疗领域的研究进展.中国药科大学学报():.:.():.():.周慧慧陈曲杨晓梅等.纳米抗体在癌症治疗中的研究进展.生命科学():.():.王冠徐文娟姜国胜.纳米抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用及其前景.中国肿瘤生物治疗杂志():.(下转第 页)年第卷第期医学理论与实践小结塞来昔布是一类新型的选择性 抑制剂已被证明是一种临床有效且耐受性良好的抗炎药可缓解 的临床症状和体征 与吲哚美辛、双氯芬酸或萘普生不同塞来昔布缺乏显著的 活性副作用较小不会引起严重的胃或十二指肠溃疡或糜烂具有较高的安全性参考文献 .():.():.():./().():.().:.():.():.():.():.():.():.:.():.:.:.:.()():.():.():.():.:.:.():.:.():.():.:.():.:.收稿日期 (编辑 羽飞)(上接第 页)张益霞樊璐赵鑫等.碳点联合适配体构建荧光“关开”癌胚抗原探针.分析科学学报():.岳琳琳彭鑫鑫李巧凤等.核酸适配体功能化纳米界面用于循环肿瘤细胞捕获与释放.化学通报():.收稿日期 (编辑 倩楠)