拔脓生肌软膏的药效学及皮肤安全性评价.pdf

.():./.():.():.():.():.拔脓生肌软膏的药效学及皮肤安全性评价范华娜邹国发陶曙红郭丽冰尹永芹陈景胜陈艳芬(广东药科大学中药学院广州)摘 要 目的 考察拔脓生肌软膏()治疗皮肤感染性创面的药理学作用并初步评价其皮肤安全性为进一步研发和安全应用提供参考 方法 采用无特定病原体()级小鼠和大鼠建立金黄色葡萄球菌诱导的细菌性感染皮肤创面模型随机分为基质组 小、中、大剂量组龙珠组百多邦组给予相应药物涂抹后考察 对大、小鼠细菌性皮肤感染创面的治疗作用主要观察创面愈合率、创面病理形态、皮肤细菌逆培养细菌含量、皮肤创面组织中羟脯氨酸以及大鼠皮肤创面组织中白细胞介素()及肿瘤坏死因子()的含量采用小鼠扭体及耳肿胀实验考察 的抗炎镇痛作用采用皮肤刺激性实验和过敏性实验考察 对新西兰兔、豚鼠皮肤给药的安全性 结果与基质组比较 治疗后能显著促进皮肤创面愈合改善创面组织病理形态显著增加皮肤组织中羟脯氨酸含量抑制创面感染部位的细菌生长抑制炎症降低、的含量(.或.)大剂量能显著抑制小鼠耳肿胀(.)中、大剂量均能显著减少扭体次数(.或.)对新西兰兔、豚鼠皮肤实验结果显示没有明显的刺激性和过敏性安全性良好 结论 具有一定的抗炎镇痛及促进皮肤创面愈合作用该制剂符合中药外用软膏的安全性要求关键词 拔脓生肌软膏抗菌作用抗炎作用镇痛作用创面愈合安全性中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()()().()()().(.).(.)(.).医药导报 年 月第 卷第 期 .金黄色葡萄球菌()是引起医院和社区获得性感染的最常见的病原体之一 感染发病率较高的人群被 定植通常存在于宿主(人和动物)的鼻孔、皮肤或黏膜中是造成皮肤创面感染的主要原因之一严重时会引起感染性心内膜炎、骨髓炎、菌血症和肺炎等疾病甚至危及患者生命 目前临床主要使用抗菌药物治疗但存在细菌耐药性的风险导致该病的治疗越来越困难因此在临床上亟需寻找新的有效、安全的抗菌制剂中医学认为皮肤创面感染属“疮疡”范畴遵循“外科之法最重外治”多采用清热利湿、消肿拔脓、敛疮生肌等进行辨证论治 拔脓生肌软膏()是由多枝雾水葛总黄酮提取物制备而成前期研究表明该植物提取物和制剂具有解毒排脓等作用 为了更好地开发和应用该中药制剂满足临床用药需求本研究将提取物制备成/型软膏剂并按照中药外用制剂的药效学与安全性评价原则进行主要药效学研究和初步的皮肤安全性评价旨在开发一种疗效确切、安全的治疗细菌性皮肤感染现代中药软膏制剂 材料与方法.实验动物雄性昆明种小鼠 周龄体质量 雄性 大鼠体质量 豚鼠体质量 雌雄兼用 均为无特定病原体()级由广州中医药大学实验动物中心提供生产许可证号:(粤)新西兰收稿日期 修回日期 基金项目广东省公益研究与能力建设专项资金资助项目()广 东 省 科 技 厅 疾 病 防 治 项 目()广东省科技厅广东省中医药科学院联合项 目()广 东 省 科 技 计 划 项 目()作者简介 范华娜()女广东梅州人硕士研究方向:中药抗皮肤感染及药物安全性:作者简介(并列第一作者)邹国发()男广东韶关人硕士研究方向:皮肤感染动物模型构建及中药抗感染:通信作者 陈艳芬()女湖南安仁人教授硕士生导师博士主要从事中药药效评价与作用机制研究:兔普通级体质量.动物房室温 相对湿度光照维持 昼夜循环正常饲养 后供试实验内容和过程符合实验动物伦理要求.药物与试剂 由广东药科大学制备(批号:总黄酮含量约)营养琼脂、营养肉汤培养 基(广 东 环 凯 微 生 物 科 技 有 限 公 司 批 号:、)双氯芬酸二乙胺乳胶剂(扶他林北京诺华制药有限公司批号:规格:)龙珠软膏(马应龙药业集团股份有限公司批号:规格:)莫匹罗星软膏(百多邦中美天津史克制药有限公司批号:规格:)羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所批号:)肿瘤坏死因子()、白细胞介素()试剂盒(武汉华美生物工程有限公司批号:、)苏木精伊红()染液(武汉谷歌生物科技批号:).仪器与设备 恒温培养箱(上海博讯实业有限公司型号:)紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司型号:)单人双面洁净工作台(苏州净化设备有限公司型号:)摇床(苏州华利达实验设备有限公司型号:)匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司型号:)电子天平(日本岛津公司型号:感量:.)低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂型号:)电热恒温水浴锅(上海市新苗医疗器械制造有限公司型号:)全自动酶标仪(型号:)病理切片机(上海徕卡仪器有限公司 型号:)倒置显微镜(型号:).对大、小鼠细菌性皮肤创面感染的药效作用.菌悬液的制备 本实验所用 为标准菌株由广东药科大学病原生物学与免疫学实验室分离保存将 接种到营养肉汤培养基中在、振荡培养过夜然后再转种在琼脂平板上 过夜培养 至对数生长期选取生长良好的适量细菌使用无菌.氯化钠溶液快速洗涤菌落悬浮细菌至.并于 内完成后续接种.造模、分组及给药 造模方法参考文献并 结合实验室前期经验动物背部脱毛 后.氯化钠溶液清洗干燥消毒经腹腔注射.戊巴比妥钠(.)麻醉后在背部脱毛区制作 个直径约为.的圆形印记沿边缘剪下皮肤在小鼠、大鼠伤口周缘分别注入.菌液.、.动物模型构建成功后可见背部造模区明显渗出炎性分泌物伴有红肿随后将模型小鼠按照随机数字表法分为基质组龙珠组百多邦组 小(.)、中(.)、大()剂量组每组 只 各组给予相应药物每只.涂抹创面每天给药 次连续给药 将模型大鼠随机分为基 质 组 龙 珠 组 百 多 邦 组 小(.)、中(.)、大(.)剂量组每组 只 各组给予相应药物每只.涂抹创面每天给药 次连续给药 .创面愈合率测定造模成功后每日观察大、小鼠创面愈合情况并摄像记录进行 软件分析计算创面面积 并按公式计算各组的创面愈合率 创面愈合率()(/)其中 为创面愈合率为第 天创面面积为原始创面面积.创面皮肤病理观察 大、小鼠分别给药、和、处死用手术刀取下动物背部创面皮肤于中性甲醛溶液固定 经石蜡包埋后切片使用 法进行染色在光学显微镜下观察各组皮肤病理形态学变化.皮肤细菌逆培养采用平板计数法测定创面部位细菌含量 大、小鼠分别给药、和、处死分别取各组动物背部创面皮肤按每.皮肤加入无菌.氯化钠溶液 比例进行匀浆将匀浆液 依 次 稀 释 至、分别取稀释倍数为、稀释液 于一次性平板中每个稀释度设置 块平板 将营养琼脂液体倒入平板凝固后放置 培养箱培养 选取菌落数范围在 之间的平板进行计数.羟脯氨酸含量测定 大、小鼠分别给药、和、处死随机取各组动物适量的创面皮肤制成质量分数 的组织匀浆液按试剂盒说明书操作使用酶标仪于波长 处测量吸光度()值计算各组大鼠皮肤组织中羟脯氨酸的含量.和 含量测定 给药后 各组随机选取大鼠 只同“.节”方法制备组织匀浆液按酶联免疫吸附测定()试剂盒说明书步骤使用酶标仪于波长 处测定 值绘制标准曲线后计算各组大鼠皮肤组织中 和 含量.对小鼠的抗炎镇痛作用.二甲苯致小鼠耳肿胀实验选取雄性小鼠 只随机分为 组:基质组龙珠组扶他林组 小(.)、中(.)、大()剂量组每组 只 小鼠腹部脱毛各给药组和基质组每只给予.每天 次连续涂抹给药 按照文献方法末次给药 吸取二甲苯 涂抹小鼠右耳廓两面致炎左耳不涂作为正常对照 后将小鼠处死剪下左、右耳并用打孔器在双耳相同部位取下圆耳片称量并计算耳廓肿胀度 肿胀度()右耳片质量左耳片质量.醋酸致小鼠扭体实验分组方法同上 参考文献方法末次给药 每只小鼠腹腔注入.醋酸(.)记录小鼠 内的扭体次数.皮肤安全性评价.皮肤刺激性实验一次给药的皮肤刺激实验:于给药前 将新西兰兔背部脊柱两侧脱毛每侧脱毛面积为 随机分为正常皮肤组与破损皮肤组每组 只破损皮肤组用无菌针尖将皮肤划破见有渗血为宜用作刺激实验 采用同体自身左右对比左侧去毛后涂抹()右侧涂抹等量基质软膏作为对照并使用纱布和胶布固定给受试物 后用温水清除残留的药物肉眼观察并记录新西兰兔、涂药区域有无红斑和水肿等情况然后按照皮肤刺激反应评分标准和强度标准评估皮肤的刺激强度以及观察其活动、摄食、呼吸、精神状态、体质量、大小便等情况 刺激反应评分标准:轻度红斑勉强可见为 分中度红斑明显可见为 分重度红斑为 分紫红色红斑并有焦痂形成为 分轻度水肿勉强可见为 分中度水肿明显隆起为 分重度水肿皮肤隆起 并轮廓清楚为 分严重水肿皮肤隆起约 并范围扩大为 分 刺激反应强度标准:分值.为无刺激性.为轻度刺激性.为中度刺激性.为强刺激性多次给药皮肤刺激实验:每天给药 次连续 实验方法与评价仍按一次给药实验进行.皮肤过敏性实验 豚鼠雌雄兼并随机分为 组:基质组、二硝基氯苯(.)组(阳性对照)、()组每组 只 给药 前将豚鼠背部两医药导报 年 月第 卷第 期侧脱毛处理面积约 致敏接触:豚鼠左侧治疗组予以相应的药物每只涂抹.基质组给予等量基质涂抹 用药 后用温水清除豚鼠背部受试药物实验后 和 对豚鼠重复操作观察并记录豚鼠涂药皮肤区域的水肿及红斑情况 激发接触:于末次给药致敏后 同上述操作于、再次观察豚鼠皮肤变态反应现象按皮肤变态反应评分标准计分然后依据致敏发生率对豚鼠皮肤变态反应进行评估.统计学方法 采用 .版软件对数据进行统计分析 数据以均数标准差()表示多组间均数比较采用单因素方差分析方差齐用采用 检验方差不齐则用 分析 以.为差异有统计学意义 结果.对小鼠细菌性皮肤创面感染的影响.创面愈合率 药物干预 后与基质组比较、组及阳性对照组皮肤创面愈合率增高(.).、.、.或.说明 在早期具有促进皮肤愈合的作用 结果见图.基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组图 组小鼠的创面愈合情况().().皮肤病理学观察 染色结果显示给药 后基质组皮肤各层结构完全消失皮下组织大量炎症细胞浸润成散在分布治疗 皮肤结构仍不完整表层存在少量炎症细胞各给药组皮肤结构较完整炎症细胞减少新生肉芽组织大量纤维增生出现毛囊、皮脂腺 结果见图.皮肤细菌逆培养给药 与基质组比较、组及百多邦组皮肤细菌含量明显降低(.).给药 组与龙珠组、百多邦组疗效相当皮肤细菌含量均显著降低(.).提示 具有抑制细菌生长的作用 结果见图.皮肤创面组织中羟脯氨酸含量变化 与基质组比较给药 组、龙珠组和百多邦组较基质组皮肤羟脯氨酸的含量均显著增加(.).给药 、组龙珠组百多邦组较基质组皮肤中羟脯氨酸的含量均有明显升高(.).或.且羟脯氨酸水平与 存在量效关系提示 具有促进创面修复功能 结果见图.对大鼠细菌性皮肤创面感染的影响.创面愈合率给药 后各组不同时间点的创伤面积有不同程度缩小与基质组比较给药后皮肤创面愈合显著加速愈合率升高(.).或.提示各药物具有促进大鼠皮肤愈合的作用 在治疗前期龙珠组和百多邦组治疗效果优于 组治疗后期 组创面愈合能力优于龙珠组、百多邦组说明 在治疗大鼠创面愈合后期作用更佳结果见图.皮肤病理学观察 给药 基质组皮肤各层结构完全消失创面伴有大量块状的炎症细胞浸润给药 创面周围仍有炎症细胞浸润成聚状分布 药物治疗后炎症细胞浸润减少肉芽组织出现成纤维细胞增生较多胶原纤维排列有序可见毛囊、皮脂腺 见图.皮肤细菌逆培养 给药、与基质组比较.基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组图 组小鼠皮肤创面组织病理形态().().基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组 与基质组比较.与基质组比较.图 组小鼠皮肤创面细菌含量和 含量变化(和).()()医药导报 年 月第 卷第 期.基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组图 组大鼠的创面愈合情况().().基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组图 组大鼠皮肤创面组织病理形态().()各给药组皮肤中的细菌含量均明显降低(.).、.说明药物具有较好抑菌作用且给药第 天后的抑菌作用更强 结果见图.皮肤创面组织中羟脯氨酸含量变化 药物治疗、与基质组比较各组药物治疗后羟脯氨酸含量显著增加(.).、.或 .且 干预后创面羟脯氨酸含量高于龙珠组和百多邦组 给药 后羟脯氨酸含量明显高于第 天表明 随时间增加可更好促进创面胶原合成增加创面愈合能力 结果见图.大鼠皮肤创面组织中 和 含量 药物治疗 检测大鼠皮肤创面组织中 和 的水平 结果见图 与基质组比较除 组外各给药组炎症因子 和 含量均显著降低(.).、.或.表明药物可能通过减少释放促炎因子缓解创面过度的炎症反应从而促进创面愈合.对小鼠抗炎镇痛的药效研究结果与基质组比较龙珠组和扶他林组均能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀 组小鼠耳肿胀也受到显著抑制(.).或.提示 具有较明显的抗急性炎性肿胀作用镇痛实验结果表明与基质组比较扶他林组小鼠疼痛明显受到抑制 能减少小鼠的扭体次数且抑制疼痛作用的程度与药物剂量有关给予的剂量越大抑制疼痛的作用越强(.).或.组差异无统计学意义 见图.对皮肤安全性评价结果.皮肤刺激性实验结果 一次给药的皮肤刺激实验结果表明 涂药后正常皮肤中的基质组无刺激 .基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组 与基质组比较.与基质组比较.图 组大鼠皮肤创面细菌含量和 含量变化(和).().基质组.组.组.组.龙珠组.百多邦组 与基质组比较.与基质组比较.图 组大鼠皮肤创面组织中 和 含量().()医药导报 年 月第 卷第 期 .基质组.组.组.组.龙珠组.扶他林组 与基质组比较.与基质组比较.图 组小鼠抗炎镇痛效果比较().()性 组 内有轻微刺激性 后刺激性消失基质和软膏组 内有轻微刺激性 后刺激性消失 实验过程中新西兰兔活动、摄食、呼吸、精神状态、大小便等情况均正常多次给药的皮肤刺激实验结果与上述结果一致 见表 表 皮肤刺激反应实验结果.组别与受试物刺激反应总分 刺激强度评分 正常皮肤组 基质.破损皮肤组 基质.皮肤过敏性实验结果基质组与 组变态反应的平均值均为 致敏率为 豚鼠皮肤不产生红斑水肿消失 表明 对皮肤无致敏性而、二硝基氯苯组有强致敏性致敏率为 讨论皮肤创面愈合是一个复杂、动态和系统的过程主要包括止血、炎症、增殖和组织重塑 个阶段其中炎症反应是抑制创面愈合过程的关键因素 愈合过程中皮肤细菌感染会进一步导致愈合延迟 近年来抗菌药物是细菌性皮肤创面感染治疗的首选药物但其易引起过敏性休克还有可能会引起二重感染以及耐药菌的产生加重了临床治疗的难度 中药及其提取物因其副作用小且不易产生耐药等优点常用于抗感染和促创面愈合治疗 因此开发有效安全的抗感染、促愈合中药制剂仍是临床医学领域的热点中医学认为创面感染属“疮疡”范畴其病因病机多为外邪侵入体导致人体免疫失衡气血不畅经脉闭阻郁久化热热盛肉腐积聚成脓 古代医家在其治疗方面积累了丰富的经验特别是外治法具有确切的疗效和独特优势 晋代的刘涓子鬼遗方详细记载大量治疗感染性创面的方药外科精义强调膏药贴敷治疗:“若脓溃之后要在逐臭腐排恶汁去死肌生良肌”因此清热解毒、拔脓祛腐、敛疮生肌是治疗创面感染的关键疗法软膏剂作为传统制剂中的一种是药物与基质制成的半固体外用制剂其中/型软膏剂有释放和皮肤渗透速率较快、涂展方便、易清洗等特点被广泛用于皮肤外科疾病的治疗 在传统中医药外治法中药物通过经皮吸收直接作用于患处可避免首关效应且起效快还能减小药物对胃肠道及心血管系统的影响局部治疗有较好效果 是本课题组通过富集多枝雾水葛总黄酮有效部位并优化工艺形成的软膏剂前期研究证实多枝雾水葛黄酮类成分具有较好的抗炎、解毒、排脓等作用 因此笔者通过建立大、小鼠细菌性皮肤创面感染模型以及进行新西兰兔、豚鼠的皮肤刺激性和过敏性实验研究了 的治疗效果和安全性以期为临床提供安全有效的新型外用制剂本研究发现 能抑制醋酸导致的小鼠疼痛对小鼠耳肿胀具有显著抗炎作用特别是 镇痛抗炎效果更佳 评价皮肤感染与损伤程度的一个重要指标是观察创面皮肤表征 诱导的皮肤创面感染实 验证实了 能提高创面愈合率并减少创面细菌含量 在皮肤愈合过程中成纤维与胶原纤维含量对皮肤的修复起重要作用 羟脯氨酸主要存在于皮肤和结缔组织是胶原合成的重要原料可反映胶原蛋白的含量 本研究结果表明 明显增加组织中羟脯氨酸含量 皮肤组织中细胞的生成和结构变化可以反映皮肤愈合的程度病理结果显示 干预后呈现和外观相同的动态愈合趋势炎症细胞浸润减少肉芽组织和成纤维细胞增生胶原纤维排列有序有利于促进皮肤创面组织重塑皮肤屏障破坏后易造成 入侵通过多重促炎信号级联反应在局部和全身引发强烈的炎症反应因而可产生大量的 和 等炎症细胞因子 可由巨噬细胞、成纤维细胞等多种细胞分泌产生是一种可造成多功能炎症损伤的细胞因子在创伤愈合的初始炎症阶段发挥着重要的作用 是一种多效性的细胞因子具有免疫双向调节作用在维持炎症性疾病和对病原体免疫反应方面发挥着重要的作用 但 表达过多、相对或绝对缺乏都可引起疾病近年来 功能在免疫抑制和免疫刺激下调节机体的平衡已成为新的研究热点 本研究中与基质组比较各给药组均能降低、的含量且、具有明显的抑制作用表明 在早期可通过减少释放促炎因子缓解创面过度的炎症反应这些结果与罗伦才等研究结果一致 此外徐强等采用皮肤脓肿大鼠模型研究发现 对炎症反应的调控起着重要作用药物在治疗早期给药组的 水平明显低于模型组中期治疗过程中给药组在创周组织内的 水平呈上升趋势并在治疗后期高于模型组 提示 在慢性感染性疾病发展中可能处于动态变化的过程综上所述 具有促进细菌性感染皮肤创面愈合作用其机制可能与抑制炎症因子、的释放有关局部用药对皮肤有较好的安全性本研究结果为该制剂的临床推广应用奠定了基础参考文献 .():.:.:.:.():.:.():.:.曹珍薛璇玑张新新等.临床常见耐药细菌及其天然抗生素增效剂的研究进展.中草药():.李开莹谢郁峰陈艳芬等.多枝雾水葛不同提取物对小鼠皮下脓肿的作用.广东药学院学报():.江炜邹国发古炽明等.小鼠皮肤脓肿模型构建及多枝雾水葛的药效评价.医药导报():.():.():.():.宋玮陈倩倩唐宋琪等.皮粘散及其拆方外用对慢性皮肤溃疡模型大鼠创面愈合及创面组织/信号通路的影响.中医杂志():.张泉龙马晓花邱建国等.独一味总环烯醚萜苷胶囊的主要药效学及急性毒性.中成药():.欧凯西刘捷赵玉民等.风热清口服液的抗炎镇痛药效作用及其机制研究.中国中医基础医学杂志():.韩江云王春龙李建平等.种提取方法对清咽润喉复方有效成分含量及抗炎镇痛作用的影响.中成药():.罗超罗越周琳等.软膏剂制备及皮肤安全性的研究进展.黑龙江畜牧兽医():.罗超吴诗艺王士杰等.三黄软膏的皮肤安全性研究.黑龙江畜牧兽医():.韩苗苗李君霞刘金磊等.红花续断膏的皮肤安全性研究.食品与药品():.医药导报 年 月第 卷第 期 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