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广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量测定的研究109广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量测定的研究龚登美，植春婷，张淼，谢凤凤，朱华*（广西中医药大学，南宁 530200）基金项目：广西壮瑶药重点实验室（桂科基字201432号）；广西产5种壮瑶药材质量标准与产品开发研究项目（桂科计字2021196号）；广西中医药大学-中南大学壮瑶药研究联合实验室（桂科计字2021238号）；广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心（桂发改高技函20202605号）；广西壮瑶药协同创新中心项目（桂教科研201320号）；广西第八批特聘专家项目（壮瑶药质量标准研究，桂人才通字201913号）第一作者：龚登美，从事中药品种、质量及资源开发*通讯作者：朱华，博士，教授，博士生导师，从事中药品种、质量及资源开发【摘 要】目的：测定广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量，为评价广西拳卷地钱质量及开发提供理论基础。方法：采用紫外分光光度法，三乙胺-甲醇显色，以芹菜素为对照品制定标准曲线，测定广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量。结果：1.拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量测定是以芹菜素为对照品，测定波长为275nm，在0.060mg/mL0.100mg/mL范围内线性关系良好（R2=0.9995），加样回收率在96.5%104.15%之间，平均回收率为100.94%（RSD=2.49%，n=8）。2.拳卷地钱提取纯化后总黄酮的含量在0.135mg/g0.19mg/g之间，贺州市昭平县产地含量最高，南宁市马山县产地含量最低。结论：通过广西不同产地拳卷地钱总黄酮的出膏率及含量进行比较，初步筛选出广西拳卷地钱质量较好的产地，为广西产地钱质量提供实验依据。【关键词】广西产拳卷地钱；总黄酮；含量测定Study on the Determination of total flavonoids after extraction and purification of Marchantia convoluta from different areas of GuangxiGong Dengmei，Zhi Chunting，Zhang Miao，Xie Fengfeng，Zhu Hua*（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200）【Abstract】Objective：to determine total flavonoids after extraction and purification of Marchantia convoluta from different areas in Guangxi，so as to provide a theoretical basis for evaluating the quality and development of Marchantia convoluta in Guangxi.Methods：The standard curve was established by UV spectrophotometry with triethylamine-methanol coloration，using apigenin as reference substance，the flavonoids was determined after extraction and purification of Marchantia convoluta from different areas in Guangxi.Results：1.The content of flavonoids was determined by using apigenin as reference substance，the determination wavelength was275 nm，the linear relationship was good in the range of 0.060 mg/mL0.100 mg/mL（R20.9 995），and the recovery was 96.5%104.15%.The average recovery was 100.94%（RSD=2.49%，n=8）.2.The content of total flavonoids was between 0.135 mg/g0.19 mg/g after extraction and purification.The content of total flavonoids in Zhaoping County of Hezhou City was the highest，and the content of total flavonoids in Mashan County of Nanning City was the lowest.Conclusion：Based on The extraction rate and content of total flavonoids from Marchantia convoluta in different producing areas of Guangxi were compared，the study has preliminarily selected the origin of the good quality of Marchantia convoluta in Guangxi，and provides the experimental basis for the quality of the Marchantia convoluta in Guangxi.【Keywords】Marchantia convoluta produced by Guangxi；total flavones；content determination苔藓植物门（Bryophyta）是植物界中的一个重要门类，占世界植物总数5%。地钱（Marchantia polymorpha L.）是苔藓植物中最常见的传统中草药质量标准Identification&SourceGendingSwhyenz 110之一，味淡，性凉，归肝经。拳卷地钱（Marchantia convoluta Gao et Chang）广泛分布于西藏、广西、贵州等高寒山区，具有清热利湿，解毒敛疮的功效，主治湿热黄疸、肝炎等。经调查广西境内拳卷地钱资源较为丰富，为民间常用中草药。黄酮有多方面的生理活性，母核由两个苯环，通过3个碳原子（A与B环）相互连接而成。目前，国内外对地钱的研究主要集中于化学成分和药效研究等方面。地钱的化学成分主要包括萜类、黄酮类等1，其中黄酮类是研究的重点。朱华等2用高效液相方法，以芹菜素、斛皮素、木犀草素为标准物，证实拳卷地钱中含有这3种物质。黄酮类化合物是许多中草药的有效成分，广泛具有抗炎和抗氧化作用，对保护肝脏有着良好的效果。为进一步系统规范广西产拳卷地钱质量，初步筛选出质量好的产地，测定广西产拳卷地钱的总黄酮含量，本课题拟采用紫外分光光度法，测定11批广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量，为评价拳卷地钱的质量和开发拳卷地钱药材提供理论基础及科学依据。1 仪器与材料1.1 仪器仪器信息详见表1。表1 使用的各类仪器信息实验仪器名称型号生产厂家分析天平Sartorius SQP赛多利斯科学仪器（北京）有限公司移液器GilsonPipetmanP1 000 L吉尔森公司移液器Gilson Pipetman P200 L吉尔森公司数控超声波清洗器KQ-500DA昆山市超声波仪器有限公司纯水/超纯水一体机Merck Millipore Direct-Q3，5，8德国，默克集团鼓风干燥箱DHG-9 240A上海一恒科学仪器有限公司电热恒温水浴锅HWS-28上海齐欣科学仪器有限公司紫外-可见分光光度计UV2 600岛津仪器（苏州）有限公司1.2 材料1.2.1 对照品及药材对照品：芹菜素，20 mg，99.2%，中国食品药品检定研究院，生产批号111901-20160。药材：从广西区内采集11批不同产地药材，经韦松基教授鉴定其为拳卷地钱（Marchantia convoluta Gao et Chang）。药材详细采集信息见表2。表2 11批不同产地拳卷地钱药材编号样品来源采集时间A1拳卷地钱贺州市昭平县2017.05A2拳卷地钱梧州市苍梧县2018.03A3拳卷地钱贵港市港北区2018.05A4拳卷地钱贺州市八步区2018.04A5拳卷地钱河池市环江县2017.05A6拳卷地钱南宁市马山县2017.05A7拳卷地钱梧州市蒙山县2018.04A8拳卷地钱桂林市平乐县2017.05A9拳卷地钱桂平市平南县2017.05A10拳卷地钱玉林市容县2018.04A11拳卷地钱南宁市宾阳县2017.051.2.2 主要试剂甲醇，国药集团化学试剂有限公司，20170613；乙醇，国药集团化学试剂有限公司，20170215；三乙胺，天津市大茂化学试剂厂，20170801；水为超纯水。2 方法与结果2.1 提取工艺将11批前期处理好的拳卷地钱药材进行提取，提取工艺流程如下：250 g样品称重，溶剂是80乙醇水溶液，并回流提取3次，每次0.5 h，料液比为1 15，过滤合并滤液减压蒸馏回收乙醇，蒸至约400 mL转入蒸发皿蒸至膏状。萃取硅胶柱层析法纯化拳卷地钱总黄酮提取物，干法装柱，将膏状提取物与硅胶11比例拌样，以70%甲醇为洗脱液，减压蒸馏回收甲醇，余液浓缩至膏状进行冷冻干燥后测定总黄酮含量。2.2 样品总黄酮含量测定按照“2.1”项下方法将11批次前期处理好的拳卷地钱药材分别进行提取纯化，得到11份不同批次膏状拳卷地钱总黄酮提取物，结果见3。本研究采用三乙胺芹菜素显色法，用紫外分光光度计对样品中总黄酮的含量进行测定。广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量测定的研究111表3 11批不同产地药材出膏率编号样品来源膏（g）出膏率（%）A1拳卷地钱贺州市昭平县12.104.48%A2拳卷地钱梧州市苍梧县10.404.16%A3拳卷地钱贵港市港北区7.002.80%A4拳卷地钱贺州市八步区7.202.88%A5拳卷地钱河池市环江县15.006.00%A6拳卷地钱南宁市马山县5.532.21%A7拳卷地钱梧州市蒙山县10.424.17%A8拳卷地钱桂林市平乐县10.004.00%A9拳卷地钱桂平市平南县9.373.74%A10拳卷地钱玉林市容县15.006.00%A11拳卷地钱南宁市宾阳县11.004.40%2.3 对照品溶液的制备精密称取芹菜素对照品0.58 mg，芹菜素对照品已被干燥至恒重，置于25 mL容量瓶中，加入适量纯甲醇溶液使其溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得芹菜素对照品溶液，浓度为0.023 2 mg/mL。2.4 供试品溶液的制备精密称定拳卷地钱总黄酮浸膏提取物（A10）0.2 g，置锥形瓶中，加入25 mL甲醇，密塞摇匀，超声溶解5 min，过滤，取续滤液2 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得拳卷地钱供试品溶液。2.5 测定波长的选定精密量取芹菜素对照品溶液2 mL、供试品溶液5 mL，分别置10 mL容量瓶中，按照确定的显色条件，用紫外分光光度计进行扫描，扫描范围为200800 nm。芹菜素对照品溶液光谱图及拳卷地钱供试品溶液图。5.8904.0002.000Abs.10.000-0.507200.00300.00400.00500.00600.002nm.图1 芹菜素对照品溶液光谱图5.8904.0002.000Abs.10.000-0.507200.00300.00400.00500.00600.002nm.图2 拳卷地钱总黄酮供试品溶液光谱图图1至图2由可看出2个溶液的吸收光谱图大致相同，对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均在275 nm左右，故选定检测波长为275 nm。2.6 标准曲线的绘制精密称定芹菜素对照品2 mg，加入纯甲醇定容至10 mL，其浓度为0.2 mg/mL。精密量取0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1 mL芹菜素母液分别置于10 mL容量瓶中，加5 mL1%的三乙胺溶液，用相对应溶剂定容至10 mL，用紫外分光光度计在275 nm处测定吸光度。绘制标准曲线，以芹菜素浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，得到线性回归方程为Y=3.236 01X0.007 464 23，实验结果表明芹菜素对照品在0.060 mg/mL0.100 mg/mL范围内线性关系良好。结果见表4，图3。表4 芹菜素标准溶液线性关系考察结果体积（mL）0.60.70.80.91.0浓度（mg/mL）0.0600.0700.0790.0900.100吸光值0.2020.2350.2640.2990.332质量标准Identification&SourceGendingSwhyenz 1122.7 精密度试验89（A10）0.2 g，按“2.6”项下方法连续测定吸光度6次。结果RSD为0.69，表明该仪器稳定，精密度良好。2.8 重复性试验精密称定拳卷地钱总黄酮浸膏提取物（A10）0.2 g共6份，按2.6项下制备拳卷地钱供试品溶液，用紫外分光光度计于275 nm波长处测定其吸光度，记录数据，平均吸光度为0.166，计算RSD值为3.13%，实验结果表明方法具有良好的重复性。2.9 稳定性试验精密量取同一拳卷地钱总黄酮提取物2 mL，按2.6项下方法，在275 nm波长处，分别在5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min测定吸光度考察拳卷地钱总黄酮2 h内的稳定性，记录结果并计算，RSD值为0.18%，实验结果表明该试验溶液在2 h内是稳定的。2.10 加样回收试验选取重复性试验的广西容县拳卷地钱总黄酮提取物0.2 g，按“2.4项”下的方法制备供试品溶液，样品的芹菜素含量为0.775 mg；依次称定0.1 g产于容县的拳卷地钱总黄酮提取物样品8份，称定0.772 mg芹菜素对照品用纯甲醇溶解定容10 mL棕色容量瓶中备用，精密移取2 mL配备的对照品与样品瓶中拳卷地钱总黄酮提取物的混合，按2.2.4项下方法，分别测定吸光度，并计算平均回收率。结果平均回收率为100.94%，RSD为2.49%，实验结果表明本方法准确度良好。结果见表5。表5 加样回收试验结果（n=8）编号样品溶液中总黄酮含量/mg加入标准品的量/mg测得/mg回收率%平均回收率%RSD%10.7760.7721.52096.50100.942.4920.7750.7721.553100.7830.7740.7721.53898.8340.7700.7721.561101.8150.7720.7721.549100.2660.7770.7721.575103.6370.7730.7721.579104.1580.7720.7721.556101.553 拳卷地钱总黄酮提取的研究3.1 显色方法的考察方法1：硝酸铝显色法 取芹菜素标准品溶液和拳卷地钱总黄酮提取物样品溶液各2 mL，用Al（NO3）3-Na2NO2-NaOH颜色反应（NaOH 6 mL），加纯甲醇定容至25 mL，全波长扫描。方法2：三乙胺-纯甲醇显色法 取芹菜素标准品溶液和拳卷地钱样品溶液各2 mL，加5 mL1%三乙胺，加纯甲醇定容至10 mL，全波长扫描。结论：测定采用1%三乙胺-甲醇显色法，操作简单图3 芹菜素标准曲线和回归方程标准曲线浓度（mg/mL）0.3450.3000.2500.2000.1890.0600.0700.0800.0900.100ADSy=3.236 01x+0.007 464 23R2=0.999 50广西不同产地拳卷地钱提取纯化后总黄酮含量测定的研究113易行，具有良好的准确性。3.2 样品提取条件的考察3.2.1 溶解溶剂、显色剂加入量的考察用甲醇、80%甲醇和不同浓度的乙醇对拳卷地钱总黄酮进行溶解，考察溶解溶剂的不同吸收波长。结果表明甲醇溶解率相较于不同浓度的乙醇更好。纯甲醇溶液溶解的对照品与供试品最大吸收波长最接近，故选择纯甲醇溶液作为溶解溶剂。显色剂加入2 mL、3 mL、5 mL对总黄酮提取率的影响。实验结果表明加入5 mL1%三乙胺显色剂的吸光度显色灵敏，结果稳定，故选择加入5 mL1%三乙胺。3.2.2 取样量的考察实验对比了1 mL、2 mL、3 mL取样量对地钱总黄酮提取率的影响，实验结果表明2 mL取样量的吸光度值较理想，故选取2 mL为取样量。3.2.3 提取方法的确定拳卷地钱总黄酮的提取方法是称定0.2 g浸膏，精密加入25 mL纯甲醇溶液，超声溶解5 min；取样量为2 mL，加入显色剂量为5 mL，定容溶剂是纯甲醇溶液。4 各批次拳卷地钱总黄酮含量测定各批次的拳卷地钱总黄酮提取物共11份，用移液管精密量取2 mL拳卷地钱总黄酮供试品溶液，置10 mL棕色容量瓶中，加入5 mL1%三乙胺溶液，并用纯甲醇溶液定容至刻度，用紫外分光光度计在275 nm波长处，测定、记录吸光度，代入相应的线性回归方程，计算各批次拳卷地钱的总黄酮含量，结果见表6。表6 各批次拳卷地钱总黄酮含量（mg/g）编号取样量（g）出膏率（%）Abs含量（mg/mL）含量（%）A10.2 0014.48%0.1350.19095.00%A20.1 9954.16%0.1270.18592.50%A30.1 9972.80%0.1100.16080.00%A40.2 0032.88%0.1240.18090.00%A50.2 0016.00%0.1340.16092.00%A60.2 0002.21%0.0960.13567.00%A70.2 0014.17%0.1130.16582.50%A80.1 9964.00%0.1010.14572.50%A90.1 9973.74%0.1280.18592.50%A100.1 9986.00%0.1170.17085.00%A110.1 9994.40%0.1260.18090.00%5 结论通过广西不同产地拳卷地钱总黄酮的出膏率及含量进行比较，可知出膏率高的产地总黄酮含量不一定高，且初步筛选出广西拳卷地钱黄酮含量较高的产地为贺州市昭平县，对开发和利用拳卷地钱药材具有重要意义。紫外分光光度法操作简单易行，具有良好的准确性、专属性，且方便快速，可作为拳卷地钱总黄酮含量测定的方法，为推进开发利用广西产拳卷地钱资源提供理论基础和科学依据。参考文献1肖建波，朱华，钟世安等.反相高效液相色谱法用于拳卷地钱中黄酮类化合物的分离和测定J.分析试验室，2005，24（4）：17-19.2朱华，肖建波，邹登峰，等.硅胶柱色谱/RP-HPLC/LC-ESIMS分离纯化鉴定拳卷地钱中芹菜素-7-O-D-葡萄糖醛酸苷J.天然产物研究与开发，2005，17（1）：38-41.