MHSP65-TCL疫苗对不同病理类型三阴性乳腺癌治疗效果的差异.pdf

本文引文格式:孙悦,王耀辉,杨继文,等.MH S P 6 5-T C L疫苗对不同病理类型三阴性乳腺癌治疗效果的差异J.右江民族医学院学报,2 0 2 4,4 6(1):6 5-7 1,8 4.【论著与临床报道】MH S P 6 5-T C L疫苗对不同病理类型三阴性乳腺癌治疗效果的差异孙悦1,王耀辉1,杨继文2,储博文3,王俊3,董博翰1(1.皖南医学院微生物学与免疫学教研室,安徽 芜湖 2 4 1 0 0 0;2.皖南医学院弋矶山医院核医学科,安徽 芜湖 2 4 1 0 0 0;3.皖南医学院临床学院,安徽 芜湖 2 4 1 0 0 0)摘 要:目的 评估及比较改良后的结核分枝杆菌热休克蛋白6 5-肿瘤细胞裂解物(MH S P 6 5-T C L)疫苗对不同类型三阴性乳腺癌的疗效和差异。方法 首先,生物信息学分析不同病理类型三阴性乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润活化情况;其次,分析三阴性乳腺癌细胞中R A C K 1、B c l-2、C TNN B L 1等细胞活化因子,及细胞凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L在三阴性乳腺细胞中的丰度及其影响免疫细胞活化的信号通路。进而,在制备MH S P 6 5-T C L去除T C L中的P D L 1或增加T C L中B c l-2,再通过体内外抗肿瘤实验,检测、比较两种方法治疗不同类型三阴性乳腺癌效果的差异。结果 蛋白表达丰度的检测,MD A-MB-4 5 3细胞中HMG B 1的表达量是最高的,但B c l-2表达最低,结合各类型三阴性乳腺癌淋巴浸润,体外杀伤实验以及体内动物实验,3种不同类型的三阴性乳腺癌细胞尤其是L A R型细胞系MD A-MB-4 5 3,主要依赖HMG B 1抑制免疫细胞。从T C L中去除HMG B 1可以更为有效地提高MH S P 6 5-T C L的抗肿瘤效果。结论 阐明MH S P 6 5-T C L疫苗对各类型三阴性乳腺癌疗效差异及机制,并建立起一种三阴性乳腺癌治疗的新方法。关键词:三阴性乳腺癌;生物信息学;肿瘤细胞裂解物;免疫细胞浸润;抗肿瘤疫苗中图分类号:R 7 3 7.9 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1-5 8 1 7(2 0 2 4)0 1-0 0 6 5-0 8d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-5 8 1 7.2 0 2 4.0 1.0 1 2E f f i c a c yd i f f e r e n c e so fMH S P 6 5-T C Lv a c c i n e i nt h e t r e a t m e n t o ft r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e ro fd i f f e r e n tp a t h o l o g i c a l t y p e sS u nY u e1,W a n gY a o h u i1,Y a n gJ i w e n2,C h uB o w e n3,W a n gJ u n3,D o n gB o h a n1(1.D e p a r t m e n t o fM i c r o b i o l o g ya n dI mm u n o l o g y,W a n n a nM e d i c a lC o l l e g e,W u h u2 4 1 0 0 0,A n h u i,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o fN u c l e a rM e d i c i n e,Y i j i s h a nH o s p i t a l o fW a n n a nM e d i c a lC o l l e g e,W u h u2 4 1 0 0 0,A n h u i,C h i n a;3.S c h o o l o fC l i n i c a lM e d i c i n e,W a n n a nM e d i c a lC o l l e g e,W u h u2 4 1 0 0 0,A n h u i,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T oe v a l u a t ea n dc o m p a r et h ee f f i c a c ya n dd i f f e r e n c e so f t h eMH S P 6 5-T C L(m o d i-f i e dm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sh e a t-s h o c kp r o t e i n6 5t u m o rc e l l l y s a t e)v a c c i n ef o rd i f f e r e n tt y p e so f t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r.M e t h o d s F i r s t l y,b i o i n f o r m a t i c sw a su s e dt oa n a l y s e i mm u n ec e l l i n f i l t r a t i o na n da c-t i v a t i o n i nt h e t u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t o f d i f f e r e n tp a t h o l o g i c a l t y p e so f t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r.S e c o n d-l y,t h i ss t u d ya n a l y z e d t h e a b u n d a n c eo f c e l l-a c t i v a t i n g f a c t o r s s u c ha sR A C K 1,B c l-2,C T NN B L 1,a n da p o p t o-s i s-i n d u c i n gf a c t o r sP D L 1,HMG B 1,F a s-Li nt r i p l e-n e g a t i v eb r e a s tc a n c e rc e l l sa n dt h e i rs i g n a l i n gp a t h w a y sa f f e c t i n g i mm u n ec e l l a c t i v a t i o n.T h e n,w ep r e p a r e dMH S P 6 5-T C Lt or e m o v eP D L 1f r o m T C Lo r t o i n c r e a s eB c l-2 i nT C L,a n dt h e nt e s t e da n dc o m p a r e dt h ee f f e c t so f t h e s e t w om e t h o d s i nt r e a t i n gd i f f e r e n t t y p e so f t r i-p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r t h r o u g h i nv i v oa n d i nv i t r oa n t i-t u m o r a s s a y s.R e s u l t s T h e e x p r e s s i o no fHMG B 1w a s t h eh i g h e s t i nMD A-MB-4 5 3c e l l s,b u t t h ee x p r e s s i o no fB c l-2w a st h e l o w e s t.C o m b i n e dw i t hl y m p h a t i ci n v a s i o no f v a r i o u s t y p e so f t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r,i nv i t r ok i l l i n ga s s a y s a n d i nv i v oa n i m a l e x p e r i m e n t s,56第4 6卷 第1期 右江民族医学院学报 V o l.4 6N o.12 0 2 4年2月 J o u r n a l o fY o u j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t yf o rN a t i o n a l i t i e s F e b.2 0 2 4基金项目:安徽省教育厅自然科学研究项目(K J 2 0 1 9 A 0 4 1 5);安徽省高校优秀青年人才支持计划(重点)(g x y q Z D 2 0 1 9 0 4 0);皖南医学院2 0 2 0年青年卓越人才培养项目(w y q n y x 2 0 2 0 0 1)第一作者:孙悦,硕士,研究方向:免疫学,E-m a i l:2 4 2 7 2 6 3 3 4 9q q.c o m 通讯作者:董博翰,博士,教授,硕士研究生导师,研究方向:肿瘤免疫学,E-m a i l:2 4 0 1 5 1 5 6 3q q.c o mt h r e ed i f f e r e n t t y p e so f t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s tc a n c e rc e l l s,(e s p e c i a l l yt h eL A Rc e l l l i n eMD A-MB-4 5 3)m a i n l yr e l i e do n HMG B 1t os u p p r e s si mm u n ec e l l s.R e m o v a lo fHMG B 1f r o m T C Lc o u l di m p r o v et h ea n t i-t u m o re f f e c to fMH S P 6 5-T C L m o r ee f f e c t i v e l y.C o n c l u s i o n T h i ss t u d ye l u c i d a t e st h ed i f f e r e n c ei ne f f i c a c ya n dm e c h a n i s mo fMH S P 6 5-T C Lv a c c i n eo ne a c ht y p eo f t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r,a n de s t a b l i s h e s an e wm e t h-o df o r t h e t r e a t m e n to f t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r.K e yw o r d s:t r i p l e-n e g a t i v eb r e a s t c a n c e r;b i o i n f o r m a t i c s;t u m o r c e l l l y s a t e;i mm u n e c e l l i n f i l t r a t i o n;a n-t i-t u m o rv a c c i n e 三阴性乳腺癌(T N B C)是指雌激素受体(E R)、孕激素受体(P R)和人表皮生长因子受体(HE R 2)均阴性的一种特殊类型乳腺癌1。T N B C约占所有乳腺癌的1 5%,其许多生物学特性和基底细胞样型乳腺癌相似,但两者之间存在某些基因表达谱和免疫表型上的差异,因此亦不能完全等同。T N B C因缺乏内分泌及抗HE R 2治疗的靶点,尚无针对性的标准治疗方案,是乳腺癌治疗中的难点2。目前,T N B C的内科治疗仍以放化疗为主。但由于这些治疗方法都存在一定的副作用,因此人们一直在尝试寻找更为新颖的方法以治疗该疾病。其中,抗肿瘤的免疫治疗是比较有前途的一个方向3-4。抗肿瘤免疫治疗主要是利用肿瘤抗原或者一些免疫因子作用于机体,通过诱导特异性和非特异性抗肿瘤免疫作用来治疗肿瘤疾病5。目前,人们发现的可以诱导机体产生抗肿瘤免疫作用的物质很多,肿瘤细胞裂解物(t u m o rc e l l l y s a t e,T C L)就是其中一种6-9。本课题组此前的研究,利用结核分枝杆菌热休克蛋 白6 5(m y c o b a c t e r i a l h e a t s h o c k p r o t e i n 6 5,MH S P 6 5)联合肺癌细胞裂解物,在体外直接混合制备了结核 分 枝 杆 菌 热 休 克 蛋 白6 5-肿 瘤 细 胞 裂 解 物(MH S P 6 5-T C L)疫苗。该疫苗中MH S P 6 5可以有效地帮助肿瘤抗原进入免疫细胞进而在实验小鼠体内诱导产生特异性及非特异性的抗肿瘤免疫作用,最终成功地抑制了L e w i s肺癌皮下移植瘤在小鼠体内的生长并延长了荷瘤小鼠的生存期6。这证明将T C L同MH S P 6 5进行联合应用是抗肿瘤疫苗制备的一个有效策略。为了研究肿瘤细胞裂解物疫苗对乳腺癌的治疗效果及不同类型乳腺癌对该治疗方法反应性的差异。在本研究中,利用生物信息学的方法分析T N B C细胞中R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等细胞活化因子,及细胞凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L在影响抗肿瘤免疫作用的可能机制,并选取其中的关键因子,在制备MH S P 6 5-T C L是给予 去 除 或 过 表 达,以 增 强MH-S P 6 5-T C L的抗T N B C作用。1 资料与方法1.1 生物信息学分析1.1.1 T N B C组织中免疫细胞浸润情况分析 使用免疫 肿 瘤 生 物 学 研 究 的 计 算 工 具I O B RD O I:1 0.3 3 8 9/f i mm u.2 0 2 1.6 8 7 9 7 5,基于表达谱使用R软件 包I O B R选 择 了 C I B E R S O R T(D O I:1 0.1 0 3 8/n m e t h.3 3 3 7),E S T I MAT E(D O I:1 0.1 0 3 8/n c o mm-s 3 6 1 2),q u a n T I s e q(D O I:1 0.1 1 8 6/s 1 3 0 7 3-0 1 9-0 6 3 8-6),T I ME R(D O I:1 0.1 1 8 6/s 1 3 0 5 9-0 1 6-1 0 2 8-7),I P S:1 0.1 0 1 6/j.c e l r e p.2 0 1 6.1 2.0 1 9,MC P C o u n t e r(D O I:1 0.1 1 8 6/s 1 3 0 5 9-0 1 6-1 0 7 0-5),x C e l l(D O I:1 0.1 1 8 6/s 1 3 0 5 9-0 1 7-1 3 4 9-1),E P I C(D O I:1 0.7 5 5 4/e L i f e.2 6 4 7 6)方法计算了每个样本的(2 0种)免疫浸润细胞评分。T I ME R是一个全面的资源,用于系统地分析不同类型癌症的免疫浸润。该版本的网络服务器提供了通过多种免疫去卷积方法估算的免疫浸润丰度。1.1.2 R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等细胞活化因子,及细胞凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L凋亡信号转导通路分析 使用G e n e MANN I A分析T N B C组织中同R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1、P D L 1、HMG-B 1、F a s-L等分子在信号通路、物理作用、共表达、共分布等方面的相关的信号通路分子,结合相关文献的查阅,归纳上述分子在T N B C免疫微环境中影响免疫细胞活性的可能信号通路。1.1.3 T N B C细胞系中R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等细 胞 活 化 因 子,及 细 胞 凋 亡 诱 导 因 子P D L 1、HMG B 1、F a s-L表达的丰度分析 C C L E(C a n c e rC e l lL i n eE n c y c l o p e d i a)是一个由B r o a d研究所领导的肿瘤基因组学研究项目。它收集并整理了14 5 7个细胞系的全能数 据。本 研究利用C C L E数据集 分析 了T N B C细胞系中6种蛋白质(B C L 2、C D 2 7 4、C T NN-B L 1、F A S L G、HMG B 1、R A C K 1)的表达水平。1.1.4 T N B C的R NA s e q数据信息分析 从癌症基因组图谱(T C GA)数据集(h t t p s:/p o r t a l.g d c.c o m)获得了1 6 0个T N B C的R NA s e q数据(l e v e l 3)和相应的临床信息。使用S p e a r m a n的相关分析来描述非正态分布的定量变量之间的相关性。P0.0 5认为差异有统计学意义;使用K-M P l o t t e r工具计算了R i s k-S c o r e的最佳截断值,设置了高低蛋白表达组,基于此将患者分成高低两组,进一步使用R软件包s u r v i v a l的s u r v f i t函数分析 两组的预后 差异,利用l o g r a n kt e s t方法评估了不同组样本之间的预后差异显著性,662 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期最终观 察 到 显 著 的 预 后 差 异(P=1.2 e-0 6,P=0.0 0 1 7)。1.2 体外实验检测乳腺癌细胞裂解物活化的免疫细胞对T N B C细胞的杀伤作用 制备MD A-MB-2 3 1、MD A-MB-4 5 3和C A L 1 2 03种T N B C细胞裂解物,培养人P BMC细胞,将3种T N B C细胞裂解物,分别作用于人P BMC细胞,每21 05个细胞制备的裂解物作用于11 06个P BMC细胞,3 7孵育4 8h。收集刺激活化的P BMC细胞进行细胞计数。然后按4 51、1 51、51的效靶比,以不同乳腺癌细胞作为靶细胞、P BMC细胞作为效应细胞将二者混合进行杀伤,3 75%C O2孵箱中共孵育4h,同时要设立单独靶细胞对照培养孔。4h后,弃掉培养上清中的悬浮细胞,收集贴壁细胞并用台盼蓝进行染色计数其中的活的乳腺癌细胞。按下面的公式判断细胞毒性:细胞毒性%=(靶细胞对照孔细胞数-实验孔细胞数)/靶细胞对照孔细胞数1 0 0%。1.3 体内实验检测乳腺癌细胞裂解物活化的免疫细胞抗乳腺癌作用 分为4组:P B S对 照组、未改良MH S P 6 5-T C L免疫组(MH S P 6 5-T C L)、HMG B 1去除的MH S P 6 5-T C L免疫组(HMG B 1-/MT),B c l-2过表达的MH S P 6 5-T C L免疫组(B c l-2+/MT),每组5只鼠。3种乳腺癌细胞(MD A-MB-2 3 1、MD A-MB-4 5 3、C A L 1 2 0)均按此分组。人乳腺癌鼠模型建立裸鼠右后肢皮下接种51 05个乳腺癌细胞,待肿瘤大小生长至肉眼可见,并大小均匀方可进行后续实验。根据不同的组别,P B S对照组,每只小鼠的注射剂量为1 5 0LP B S;P BMC细胞免疫组,每只小鼠的免疫剂量为11 06P BMC细胞/1 5 0微升P B S。肿瘤接种部位为右后肢腹股沟,免疫注射部位为腹腔,每隔7d免疫1次,连续免疫3周。同时每隔3d测量肿瘤大小,并观察裸鼠的生存期。1.4 统计学方法 所有统计分析都用S P S S2 0.0软件进行,单因素方差分析被用来比较多组的差异。当方差齐性时,采用t检验来分析两组之间差异;当方差不齐时,用秩和检验分析两组之间差异。计数资料采用2检验进行比较。P0.0 5被认为差异有统计学意义。2 结果2.1 生物信息学分析不同病理类型T N B C肿瘤微环境中免疫细胞的浸润活化情况 T N B C主要分为3种类型B a s a l、L A R、M e s e n c h y m a l-l i k e。不同病理类型的T N B C由于癌细胞本身的生物学特征不同,因此会导致相应肿瘤组织的微环境当中,免疫细胞的出现及激活的情况也各不相同。为了对这样的推测给予验证,本研究组采用利用生物信息学数据库进行分析,结果发现:3种病理类型的T N B C组织中,固有免疫细胞尤其是巨噬细胞活化较为明显,尤其是B a s a l型T N-B C组织中,M 0、M 1、M 2型细胞的比例分别达到了1 8.6%、1 3.2%和1 3.5%(见图1 A)。但相比较而言,B细胞、T细胞的表达在各种T N B C组织中都很低,尤其是L A R型T N B C中,检测不到C D 8+T细胞(占总免疫细胞比例为0%),但却有较高的T r e g细胞的表达,其比例为2.7%(见图1 B)。然而,与之相反,M e s e n c h y m a l-l i k e型检测不到T r e g细胞的表达(见总免疫细胞比例的0%)(见图1 C)。注:A为B a s a l型T N B C;B为L A R型T N B C;C为M e s e n c h y m a l-l i k e型TN B C。图1 生物信息学分析3种病理类型TN B C组织中免疫细胞浸润762 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期2.2 生物信息学分析R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等细胞活化因子,及细胞凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L诱导免疫细胞凋亡的信号通路 不同T N B C肿瘤微环境中,免疫细胞表达活化情况的差异,可能同肿瘤细胞产生的某些细胞活化或抑制因子影响免疫细胞的生存状态有关。为此,进一步分析了T N B C细胞表达的R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等细胞活化因子,及细胞凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L同免疫细胞凋亡的 相 关 性 及 其 可 能 的 信 号 通 路。结 果 显 示:HMG B 1同N F-B有密切联系,可以激活N F-B信号转导通路,从而诱导凋亡(见图2 A)。P D L-1主要通过抑制Z A P 7 0-A k t通路引发细胞凋亡(见图2 B)。F a s-L主要通过抑制F A B L G通路引发凋亡(见图2 C)。B c l-2也同凋亡关系密切,该因子主要通过抑制B A X分子,抑 制 细 胞 增 殖 导 致 凋 亡 的 发 生(见 图2 D)。R A C K 1主要通过抑制-c a t e n i n活化细胞(见图2 E),而C T NN B L 1则通过WNT通路促进细胞活化(见图2 F)。注:A为HMG B 1;B为P D L-1;C为F a s-L;D为B c l-2;E为R A C K 1;F为C T NN B L 1。图2 生物信息学分析细胞活化因子和凋亡诱导因子影响T N B C组织中细胞凋亡的信号通路2.3 不同病理类型T N B C细胞系中,R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等 细 胞 活 化 因 子 及 细 胞 凋 亡 诱 导 因 子P D L 1、HMG B 1、F a s-L表达丰度分析 T N B C细胞表达的细胞活化或抑制因子可以影响免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润情况。而不同病理类型的T N B C组织之所以免疫浸润的情况不同可能和不同T N B C组织中各种细胞活化影响因子的表达量差异有关。为此,本研究分析了多种病理类型T N B C细胞中R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等细胞活化因子,及细胞凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L表达的丰度情况。结果发现:在凋亡诱导的因子中HMG B 1的平均表达丰度高达9.0 7(见图3 A),而P D L 1和F a s-L的表达丰度分别为1.1 8 7、0.0 4 3(见图3 B、图3 C),在细胞活化因子中,B c l-2的平均表达丰度最低只有1.4 3(见图3 D),而R A C K 1和C T NN B L 1在T N B C细胞系中的平均表达丰度分别达1 0.8 7和5.3 7(见图3 E、图3 F)。862 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期注:A为HMG B 1;B为P D L-1;C为F a s-L;D为B c l-2;E为R A C K 1;F为C T NN B L 1。图3 生物信息学分析细胞活化因子和凋亡诱导因子在TN B C细胞系中的表达丰度2.4 通过生物信息学分析乳腺癌患者免疫治疗响应性和生存分析 鉴于之前生信分析结果,本研究组认为细胞活化因子B c l-2和凋亡诱导因子HMG B 1在T N B C患者中有潜在的价值,因此,通过K a p l a n-M e i e rP l o t t e r数据库对T N B C患者进行了TMB免疫治疗响应和K-M生存分析。分析结果表明,在T N B C患者中HMG B 1高表达与免疫治疗正相关(见图4 A),B c l-2高表达与免疫治疗负相关(见图4 B),HMG B 1高表达患者较低表达组的生存期短(见图4 C),B c l-2高表达患者的生存期高于低表达组(见图4 D)。注:A为HMG B 1免疫治疗响应(TMB);B为B c l-2免疫治疗响应(TMB);C为HMG B 1表达相关生存曲线;D为B c l-2表达相关生存曲线。图4 生物信息学分析细胞活化因子B c l-2和凋亡诱导因子HMG B 1在T N B C患者的免疫治疗响应和生存分析962 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期2.5 去除HMG B 1或过表达B c l-2的MH S P 6 5-T C L抗T N B C作用的体外检测 为了检测T C L中一些免疫活化或抑制因子的改变是否影响MH S P 6 5-T C L抗T N B C效果,将HMG B 1抑制剂或B c l-2激动剂作用于B a s a l(MD A-MB-2 3 1),L A R(MD A-MB-4 5 3),M e s-e n c h y m a l-l i k e(C A L 1 2 0)3种病理类型的T N B C细胞,然后制备T C L,再使用处理后的T C L作用于人P B-MC,然后用激活的P BMC细胞针对这两种病理类型的T N B C细 胞 进 行 体 外 杀 伤 实 验。结 果 显 示:HMG B 1的去除能比B c l-2的过表达更为有效的激活P BMC,并引发更强抗肿瘤杀伤作用,对MD A-MB-2 3 1杀伤率达5 8.4 3%(见图5 A),对MD A-MB-4 5 3的杀伤率达6 8.4 6%(见图5 B),对C A L 1 2 0的杀伤率达4 0.1 2%(见图5 C)。去除HMG B 1或过表达B c l-2可以针 对MD A-MB-4 3 5产 生 更 好 的 杀 伤 效 果(P0.0 5)。注:用不同的刺激物处理P BMC4 8h,作为效应物。MD A-MB-2 3 1细胞(A)或MD A-MB-4 3 5细胞(B)、C A L 1 2 0细胞(C)作为目标。*P0.0 5,以3个实验中的一个作为数据展示。图5 乳腺癌细胞杀伤试验2.6 去除HMG B 1或过表达B c l-2的MH S P 6 5-T C L抗T N B C作用的体内检测 为了检测T C L中一些免疫活化或抑制因子的改变是否影响MH S P 6 5-T C L抗T N B C效果,将HMG B 1抑制剂或B c l-2激动剂作用于B a s a l(MD A-MB-2 3 1),L A R(MD A-MB-4 3 5),M e s-e n c h y m a l-l i k e(C A L 1 2 0)两 种病理类 型 的T N B C细胞,然后制备T C L,再使用处理后的T C L作用于人P BMC,然后构建不同病理类型的T N B C动物模型,用激活的P BMC细胞进行体内抗肿瘤实验。结果显示:HMG B 1的去除能比B c l-2的过表达更为有效地抑制肿瘤的生长,对MD A-MB-2 3 1抑瘤率达3 2.8 6%(见图6 A),对MD A-MB-4 5 3的抑瘤率达4 6.2 6%(见图6 B),对C A L 1 2 0的抑瘤率达3 6.5 3%(见图6 C)。去除HMG B 1或过表达B c l-2可以针对MD A-MB-4 3 5产生更好的抑瘤效果(P0.0 5)。裸鼠在第0天移植L e w i s肺癌细胞,用1P B S、MH S P 6 5-T C L、B c l-2+/MT或HMG B 1-/MT免疫,然后从第1天开始,间隔7d进行3次免疫。每2天测量1次肿瘤体积。注:A为MD A-MB-2 3 1移植组的肿瘤生长曲线;B为MD A-MB-4 3 5移植组的肿瘤生长曲线;C为C A L 1 2 0移植组的肿瘤生长曲线。*P0.0 5,B c l-2+/MT是MH S P 6 5-T C L过度表达B c l-2;HMG B 1-/MT是MH S P 6 5-T C L去除HMG B 1。图6 由HMG B 1去除或B c l-2过表达MH S P 6 5-T C L激活的P BMC诱导的抗乳腺癌疗效3 讨论目前,人们已经发现T N B C细胞分为如下亚型:基质样型(B a s a l-l i k e)包括B L A、B L B、I M3种类型;腺腔A型(L A R);腺腔B型(M e s e n c h y m a l-l i k e),T N B C细胞病理类型多样、生物学背景各不相同,对免疫治疗的反应性也会存在较大差异1 0-1 1。因此,根据乳腺癌具体病理类型的不同,有针对性地选择免疫治疗方法十分重要。072 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期T N B C病理类型多样,为了更好研究不同类型乳腺癌对肿瘤细胞裂解物疫苗反应性的差异。本研究首先采用了生物信息学分析的方法,分析T N B C组织中免疫细胞浸润、激活的情况。结果显示,各类T N B C中固有免疫细胞浸润程度较高,但T淋巴细胞、B淋巴细胞的浸润都相对较低,占总免疫细胞的比例在1 0%以下,抗肿瘤免疫的发生主要依赖淋巴细胞所引发的特异性免疫应答,因T N B C治疗过程中,需要利用免疫治疗的方法激活更多的淋巴细胞,引发更强地抗肿瘤免疫作用。不同病理类型的T N B C之所以免疫细胞浸润情况不同,这和肿瘤细胞产生的某些分子会引起免疫细胞的活化或凋亡有关。在本研究中主要关注细胞活化因子R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 11 2-1 3,凋亡诱导因子P D L 1、HMG B 1、F a s-L1 4-1 5。生物信息学分析表明,这些因子可以通过不同的通路引发肿瘤组织中细胞的凋亡。比如,HMG B 1通过激活N F-B通路,影响该通路中的c-R e l分子会诱导T r e g细胞的分化生成。结合肿瘤组织中细胞的成分很复杂,有肿瘤细胞的存在,也有浸润免疫细胞的存在。结合前面组织中免疫细胞浸润的分析,推测之所以肿瘤组织中淋巴细胞所占比例较低可能和肿瘤细胞产生的P D L 1、HMG B 1、F a s-L等因子诱导了免疫细胞的凋亡,或是R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1等因子不能很好地促进淋巴细胞活化有关。如果使用MH S P 6 5-T C L治疗T N B C,T C L中的这些成分也会作用于免疫细胞,从而对MH S P 6 5-T C L治疗效果产生影响。不同病理类型的T N B C,其产生细胞活化或抑制因子的能力各不相同,由此会导致肿瘤微环境中免疫细胞浸润的差异。为了评估不同类型T N B C中各种因子 表 达 的 能 力,分 析 了 不 同 类 型T N B C细 胞 中R A C K 1、B c l-2、C T NN B L 1、P D L 1、HMG B 1、F a s-L等因子的表达丰度情况。其中,HMG B 1在细胞系中的平均表达是最高的,尤其在MD A-MB-2 3 1、MD A-MB-4 3 5、C A L 1 2 0几种细胞中,该蛋白因子的表达丰度达到了9.0 7、1 0.6 6、8.1 8,MD A-MB-4 3 5细胞中该因子的表达最高。HMG B 1是凋亡诱导因子,有研究也认为该蛋白因子可以诱导T r e g细胞生成,因此在肿瘤细胞中抑制其表达,这种蛋白释放到肿瘤微环境中更少,将有利于免疫细胞的激活,同时,生物信息学结果表明HMG B 1高表达组的患者预后往往比较差,对免疫治疗的响应比较高。因此制备T C L时可以考虑将其去除。在促细胞活化因子中,B c l-2表达量相对较低,总体丰度平均值为1.4 3。在MD A-MB-2 3 1、MD A-MB-4 3 5、C A L 1 2 0几种细胞中,该蛋白因子的表达丰度达到了1.4 5、0.6 0 4、2.6 8,MD A-MB-4 3 5细胞中该因子的表达最低,另外,B c l-2低表达组的患者生存状态差,对免疫治疗的响应度更高。B c l-2促细胞活化作用是得到人们公认的,并且在T、B等淋巴细胞的表面也是存在B c l-2受体的,因此如果能增加该因子在肿瘤细胞中的表达,进而制备的T C L将可以更有效地诱导淋巴细胞的活化。基于上面的思路,本研究组用HMG B 1抑制剂或B c l-2激动剂作用于几种免疫浸润较差的T N B C细胞,然后制 备T C L并 同MH S P 6 5联 合 构 建MH S P 6 5-T C L疫苗。接下来用该疫苗激活P BMC细胞,进行体内外抗肿瘤实验。相较于未去除HMG B 1或未过表达B c l-2的MH S P 6 5-T C L,经过相应成分处理的MH-S P 6 5-T C L能更为有效的在体外杀伤肿瘤细胞,在实验动物体内也显示出了较好的抗肿瘤效果,尤其抑制MD A-MB-4 5 3细胞生长的能力最强。结合前面,T N-B C细胞系中蛋白表达丰度的检测,MD A-MB-4 5 3细胞中HMG B 1的表达量是所有细胞中最高的,但B c l-2表达最低,结 合 各 类 型T N B C淋 巴 浸 润,由 此 认 为L A R型细胞系MD A-MB-4 5 3主要依赖HMG B 1诱导T r e g抑制免疫细胞,因此从T C L中去除HMG B 1可以更为有效地提高MH S P 6 5-T C L的抗肿瘤效果,这也显示在对L A R这类病理类型的T N B C进行MH-S P 6 5-T C L治疗的时候,从其中去除HMG B 1及过表达B c l-2的必要性,这对MH S P 6 5-T C L治疗T N B C的临床应用有一定的指导意义。通过上述研究,本课题组建立起一种T N B C治疗的新方法,并比较出不同病理类型的T N B C对该免疫疗法反应性的差异及其可能机制,从而使MH S P 6 5-T C L疫苗对T N B C的治疗更有针对性,这对其今后的临床应用将产生重要的指导作用。参考文献:1 J I ANG YZ,L I U Y,X I AO Y,e ta l.M o l e