莱菔硫烷对RhoC敲低的口腔鳞癌细胞的调控作用_高峰.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.11口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，据国际癌症研究机构统计，口腔癌占全身恶性肿瘤的 2.1%1。了解 OSCC 进展的分子机制将有助于我们制定有效的治疗方案2。在课题组前期的研究中，我们发现 Rho 家族成员 RhoC 可以调控口腔鳞癌细胞的侵袭和迁移能力3，同时也发现敲低 RhoC 的表达后 Nrf2 的RNA 和蛋白表达水平也随之降低，提示 RhoC 可能通过调控 Nrf2 的表达来影响口腔鳞癌细胞的生物学功能。研究表明，Nrf2（NF-E2-related factor2）是细胞调节抗氧化应激反应的转录因子，在正常组织中低表达，但在许多癌症中呈现高表达，尤其在头颈部鳞状细胞癌中4。Nrf2 在肿瘤的发生和进展中可能具有双重作用，一方面，Nrf2 可以保护正常细胞不被转化为癌细胞。Nrf2-/-小鼠比野生型小鼠更容易被 4-nitroquinoline-1-oxide（4NQO）诱导发生舌癌5。另一方面，Nrf2 激活可促进癌细胞存活、抑制细胞凋亡并可增强癌细胞的化学耐药性和放射抗性6。研究发现，增强 Nrf2 的表达或其活性是一种传统且有效的预防氧化和炎症应激导致的慢性疾病和癌症的方法，但其激活又可能会促进癌细胞增殖并导致癌细胞对放化疗治疗的敏感性下降。因此，在 Nrf2 低表达的 RhoC/shRNA 口腔鳞癌细胞中激活Nrf2会对癌细胞产生如何影响值得我们进一步探讨。莱菔硫烷（Sulforaphane,SFN）是一种富含于莱菔硫烷对 RhoC 敲低的口腔鳞癌细胞的调控作用高峰 吴堰霖 宿颖 尹盼盼 文金林 张文斌 张辛燕【摘要】目的 观察莱菔硫烷（sulforaphane,SFN）对 RhoC 稳定敲低的口腔鳞癌细胞系 CAL27 RhoC/shRNA的影响。方法 选取口腔鳞癌细胞系 CAL27 RhoC/shRNA 进行培养，用不同浓度的 SFN 处理对数期 CAL27 RhoC/shRNA 细胞，通过 RT-PCR 和 western blot 检测 SFN 对细胞中 Nrf2 RNA 和蛋白水平的影响。分别通过 MTT实验、克隆形成实验和侵袭实验检测 SFN 对口腔鳞癌细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力的影响；PHOD染色检测 SFN 对口腔鳞癌细胞 F-actin 聚合能力的影响。结果 应用 SFN 能有效抑制口腔鳞癌细胞 CAL27 RhoC/shRNA 的增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力和 F-actin 蛋白聚合能力。结论 SFN 可减弱 RhoC 敲低的口腔鳞癌细胞的恶性能力。【关键词】莱菔硫烷;口腔鳞状细胞癌;抑制剂【中图号】R739.8【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.01.001Effect of sulforaphane on RhoC/shRNA knocking down oral squamous cell carcinoma cells GAO Feng,WU Yan-lin,SU Ying,YIN Pan-pan,WEN Jin-lin,ZHANG Wen-bin,ZHANG Xin-yan.Beijing Institute of Dental Research,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To investigate the effect of sulforaphane(SFN)on RhoC/shRNA knocking down oral squamous cell carcinoma(OSCC)cells.Methods OSCC cell line CAL27 RhoC/shRNA was cultured in DMEM high glucose medium with 10%FBS and the logarithmic phase CAL27 RhoC/shRNA cells were treated with different concentrations of SFN.The effect of SFN on Nrf2 gene in RNA and protein level was detected by RT-PCR and western blot assay,respectively.The effect of SFN on the proliferation,colony formation and invasion ability of OSCC was examined by MTT assay,colony formation experiment and transwell assay.The effect of SFN on the F-actin polymerization ability of OSCC was detected by PHOD staining assay.Results SFN could effectively inhibit the proliferation,colony formation,invasion and F-actin protein polymerization ability of OSCC cells CAL27 RhoC/shRNA.Conclusions SFN could attenuate the malignant ability of RhoC/shRNA knocking down oral squamous cell carcinoma cells.【Key words】SFN;Oral squamous cell carcinoma;Inhibitor 基金项目：北京市自然科学基金（7202057）；国家自然科学基金（81772868）作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所（高峰现在深圳大学医学部口腔医学院工作）通信作者：张辛燕，E-mail:，电话：[phone]基础研究北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.12十字花科植物内的天然异硫氰酸酯，在天然 NRF2激活剂中排名最高7。本研究探讨 Nrf2 表达水平的变化对口腔鳞癌细胞的作用及 SFN 对 RhoC 敲低的口腔鳞癌细胞的作用，旨在为口腔癌的化学预防和基因靶点治疗提供思路。材料和方法1.细胞株和细胞培养口腔鳞状细胞株 CAL27 RhoC/shRNA（北京口腔医院研究所提供，课题组前期构建8，培养于10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素、DMEM:高糖培养基，置于 37，5%CO2孵箱内培养。选取对数生长期细胞进行实验。2.主要试剂四 甲 基 偶 氮 唑 蓝（MTT）（Sigma，美 国）；DMEM:高糖培养基（Hyclone，美国）；PBS，胰酶，胎牛血清，双抗，0.25%胰酶（Gibco）；二甲基亚砜（DMSO），鬼笔环肽染液（PHOD）（Sigma，美国）；RNA 提取试剂：TRIzol（GeneCopoeia 公司）；cDNA 合成试剂盒，2xULtra SYBR Mixture（康为世纪)；引物（上海生工合成）；兔抗人 RhoC 多克隆抗体，兔抗人 Nrf2 多克隆抗体（Proteintech 公司）。3.实验方法实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerse chain reaction,RT-PCR）检测下游基因mRNA 表达：将对数期 CAL27 RhoC/shRNA 细胞接种于 60 mm 培养皿中，用 0，5 mol/L，10 mol/L 的SFN 处理细胞 48 h 后，加 TRIzol，按照 TRIzol 提总 RNA 的步骤提取总 RNA，RNase-Free Water 溶解总 RNA，紫外分光光度计测定其浓度和纯度。按照 cDNA 合成试剂盒逆转录 RNA 为 cDNA。采用 SYBR 荧光染料检测细胞中 RhoC、Nrf2 mRNA的表达。以 GAPDH 为内参，2-CT法计算 RhoC、Nrf2 的表达倍数。Western blot 检测下游蛋白的表达：将对数期CAL27 RhoC/shRNA 细胞接种 100 mm 培养皿中，用 0，5 mol/L，10 mol/L 的 SFN 处理细胞 48 h后，提取总蛋白进行 western blot 检测，SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、5%脱脂牛奶 TBST 溶液封闭 1 h后依次孵育一抗、二抗后显影。四甲基偶氮唑盐（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）检测细胞增殖能力：选取对数生长期的CAL27 RhoC/shRNA 细胞，消化，离心，重悬，调整浓度至 3104/ml，接种到 96 孔培养板，每孔加入 200 l 细胞悬液，待细胞贴壁后，分别加入不同终浓度的 SFN（0，5 mol/L，10 mol/L，20 mol/L，40 mol/L，80 mol/L）。每个浓度设置 6 个复孔，同时设置只加培养基的调零孔，边缘孔用 200 l无菌 PBS 填充。置于 37，5%CO2的孵箱中分别孵育 24 h、48 h、72 h，每孔加入 20 mol MTT 溶液（5 mg/ml），继续孵育 4 h 后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入 200 l 二甲基亚砜，置摇床上避光低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长 490 nm 处测量各孔的吸光度值。克隆形成实验：不同浓度的 SFN（0，5 mol/L，10 mol/L）处理 CAL27 RhoC/shRNA 细胞 24 h 后，接种到 6 孔板中，每孔 2000 个细胞，观察 14 天后终止培养，4%甲醛溶液固定细胞，结晶紫溶液染色，干燥，拍照片，计数细胞克隆形成集落数，计算克隆形成率。Transwell 实验：取对数生长期 CAL27 RhoC/shRNA 细胞接种于 60 mm 细胞培养皿中，37，5%CO2培养箱中孵育 6 h，加入不同终浓度（0，5 mol/L，10 mol/L）的 SFN，继续孵育 48 h。胰酶消化细胞，离心，用含 2%BSA 的无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为 1106个/ml。将Transwell 小室放入 24 孔板中（Transwell 侵袭实验提前将 Matrigel 胶与培养基按 1:5 的浓度提前铺至 Transwell 小室底部，4 h 凝固后备用），下室加入 900 l 含 10%FBS 的 DMEM 培养基，取细胞悬液 300 l 加入 Transwell 上室中，每组设置 3 个复孔。37，5%CO2培养箱中培养 72 h；终止培养，弃培养基，甲醇固定 10 min，棉签擦去上室内的细胞及Matrigel 胶，吉姆萨染色 20 min，轻轻用清水冲洗浸泡数次。每孔选 5 个不同的区域，在 40 倍显微镜下拍照并计数穿过的细胞数。鬼笔环肽染色（Phalloidin Staining，PHOD）：不同终浓度（0，5 mol/L，10 mol/L）的 SFN 处理 CAL27 RhoC/shRNA 细胞后接种到放置了细胞爬片的 24 孔板中继续培养 24 h 后，4%甲醛固定10 min，0.1 Triton X-100 透化 10 min，1 BSA中封闭 30 min 后，加入 5 g/ml PHOD（避光）孵育 1 h。DAPI 复染细胞核。荧光显微镜（Olympus IX71，日本）下拍摄图片。Image-pro plus 6.0 软件北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.13计算 F-actin 的平均光密度值（MOD）。4.统计学分析应用 SPSS20.0 统计软件进行统计分析。采用ANOVA 检验，LSD 两两比较，以=0.05 作为检验水准。结 果1.不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞Nrf2 的激活效果RT-PCR 结果显示，与空白浓度（对照组）相比，5 mol/L 和 10 mol/L 的 SFN 处理后均可以增加细胞中 Nrf2 基因的 RNA 水平（P 0.05）（图 1）。但 Nrf2 的 RNA 水平在两种浓度间无统计学差异。Western blot 结果显示，与 RNA 结果的趋势一致，与空白浓度（对照组）相比，SFN 可以增加细胞中 Nrf2 的蛋白表达水平，但 Nrf2 的蛋白水平在两种浓度间无统计学差异（图 2）。2.不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞增殖能力的影响MTT 结果显示：与空白浓度（对照组）相比，SFN 可以抑制细胞的增殖（P0.05）（图 3）。并且随着处理时间的延长，对细胞的抑制作用逐渐增强，呈一定时间依赖关系。此外，由 MTT 实验结果可以看出 5 mol/L 和 10 mol/L 的 SFN 对细胞的增殖的抑制作用差异不明显。3.不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞克隆形成能力的影响克隆形成实验结果显示，与空白浓度（对照组）相比，不同浓度的 SFN 可抑制细胞的克隆形成能力（图 4），差异具有统计学意义（P0.05）。10 mol/L的 SFN 处理组细胞的克隆形成集落最少，差异有统计学意义（P0.05）。4.不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞侵袭能力的影响Transwell 实验结果显示，与空白浓度（对照组）相比，不同浓度的 SFN 可抑制细胞的侵袭能力（图5），差异具有统计学意义（P0.05），10 mol/L 的SFN 处理组穿过的细胞数最少，差异有统计学意义（图 6）。实验结果表明，SFN 处理后，细胞的体外侵袭能力明显降低。5.不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞F-actin 蛋白聚合的影响PHOD 实验结果显示，随着 SFN 浓度的增加，CAL27 RhoC/shRNA 细胞的 F-actin 蛋白的 MOD 值降低明显，与空白浓度（对照组）相比，差异具有注：*：与空白浓度（对照组）相比，P0.05图 1 不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞中 Nrf2 基因的 RNA 水平的影响注：*：与空白浓度（对照组）相比，P 0.05图 2 不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞中 Nrf2 基因的蛋白水平的影响注：*：与空白浓度（对照组）相比，P 0.05图 3 不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞增殖能力的抑制情况北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.14统计学意义（P0.05）（图 7，8），表明 SFN 处理细胞可减弱细胞中 F-actin 蛋白的聚合能力。讨 论本研究发现，在 RhoC 敲低的细胞中应用 SFN后，细胞的增殖、克隆形成、侵袭能力及 F-actin的聚合能力会进一步减弱。研究表明，在体外用 SFN 处理人结肠癌细胞系、前列腺癌细胞系、乳腺癌细胞系、胰腺癌细胞系，会使细胞分裂周期阻滞于 G2/M 期或 G1 期，从而抑制细胞的增殖。本实验中，在使用不同浓度的 SFN 作用于课题组前期构建的 RhoC 敲低的口腔鳞状细胞癌细胞系 CAL27 RhoC/shRNA 后，细胞的生长受到一定程度地抑制，且随着药物浓度的增高及处理时间的延长，细胞受到的抑制作用逐渐增强，呈一定浓度和时间依赖关系，与其他肿瘤细胞系的结果一致，表明了 SFN 对肿瘤细胞的生长抑制作用。本研究使用鬼笔环肽检测了细胞中肌动蛋白图 5 不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞体外侵袭能力的影响注：*：与空白浓度（对照组）相比，P 0.05；#：与5 mol/L 组相比，P 0.05图 6 不同浓度的 SFN 对细胞侵袭能力的影响图 7 各实验组 CAL27 RhoC/shRNA 细胞 F-actin 蛋白聚合情况注：*：与空白浓度（对照组）相比，P 0.05；#：与 5 mol/L组相比，P 0.05图 4 不同浓度 SFN 对 CAL27 RhoC/shRNA 细胞克隆形成能力的抑制情况注：*：与空白浓度（对照组）相比，P0.05；#：与 5 mol/L组相比，P 0.05图 8 各实验组 CAL27 RhoC/shRNA 细胞 F-actin 蛋白聚合情况北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.15（F-actin)的表达，鬼笔环肽是一种环状七肽毒素，能与纤维状的肌动蛋白（F-actin）结合，并保持微管的稳定性，是研究细胞内肌动蛋白微丝的有力工具。微管是球状肌球蛋白的多聚体，由 和 两个亚基组成，在有丝分裂、细胞运动和运输中起重要作用，而破坏肌球蛋白的聚合会干扰有丝分裂，阻滞细胞周期。Jackson 等9报道，低浓度的 SFN会导致小鼠乳腺癌细胞有丝分裂中的纺锤体轻微解聚，而高浓度的 SFN 则会抑制微管的聚合。在本实验中，我们发现 SFN 能够抑制 RhoC 敲低细胞的F-actin 蛋白聚合能力，且浓度较高时抑制作用更显著，我们推测 SFN 对细胞的抑制作用可能通过抑制微管的聚合和阻滞细胞周期实现的。近年来，有多项研究描述了 Nrf2 的激活和升高在癌症化学预防中的积极作用，包括SFN的应用。因此我们预测 SFN 在口腔癌中的化学预防作用在一定程度上与 Nrf2 信号通路相关。Nrf2 是抗氧化应激反应中的关键转录因子，通常也被认为是肿瘤抑制因子。例如，随着 ROS 水平的增加，Nrf2缺陷小鼠对致癌物的易感性及肺转移明显增加10。在 Nrf2 基因敲除小鼠中，结直肠肿瘤的发生率明显升高11。但也有研究发现，Nrf2 的过度表达有助于肿瘤生长和对化疗的抗性，且与癌症患者的不良预后有关12。因此，Nrf2 在癌症发展和治疗中可能具有双重作用。一方面，激活 Nrf2 可保护细胞免于氧化应激损伤，进而预防氧化和炎症应激导致的慢性疾病和癌症，另一方面，Nrf2 的过度激活或表达也可以促进肿瘤细胞的存活和进展。本研究结果显示，SFN 能进一步减弱 RhoC 敲减的口腔鳞癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力以及 F-actin 蛋白聚合能力。参 考 文 献 1 Wu C,Li M,Meng H,et 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