壳聚糖修饰载鲎血蛋白-白蛋白微球的制备及其活性研究_曾紫怡.pdf

技术与信息62|2023年05月发器、紫外可见分光光度计、扫描电镜、纳米粒度及ZETA 电位分析仪、傅里叶变换红外光谱仪科技有限公司、超凡型小容量恒温培养仪、数显恒流泵、pH 计、超声波清洗机、恒温加热磁力搅拌器。1.2 药品牛血清白蛋白；鲎血浆粗粉、壳聚糖(甲壳胺)；考马斯亮蓝 G250；胰蛋白酶(牛胰)、胃蛋白酶；25%戊二醛溶液、三聚磷酸钠、其他试剂为分析纯。2 方法与结果2.1 鲎血脱铜蛋白的制备取一定量鲎血粉末，于 NaCl 溶液、磷酸缓冲液和适量纯化水中充分溶解，后放入 65 水浴锅中水浴搅拌 25 min，取出放入冰水中冷却至 10，随后将溶液置于离心机中离心(3 500 r/min，30 min，4)。将离心后的上清液倒入干净的烧杯中，向上清液中加入 25.0 mL 一定浓度的乙二胺四乙酸二钠水溶液，再放入 35 水浴锅中水浴搅拌 25 min，后加入 25.0 mL 的丙酮溶0 引言鲎血液是鲎试剂中唯一的核心原料，在医疗研究和临床检验中有着无可替代的作用和重要性，它能准确和快速地检测出被细菌感染的人体组织，且常被用于研究对癌症的作用。壳聚糖具生物降解性、生物相容性、交联粘附性、抗菌、消炎、止血和生物活性等优势1，白蛋白可以靶向于肿瘤细胞，而微球粒径微小，能较容易地通过 EPR 效应富集于肿瘤部位，从而实现抗肿瘤药物的被动靶向治疗。通过制备壳聚糖修饰的载鲎血蛋白-白蛋白微球，对白蛋白活性氨基进行适当的修饰，将内源性白蛋白用于构建微球载药传递系统，提高鲎血蛋白药物的稳定性和靶向性，使其发挥缓释、控释作用，为探究其抗肿瘤活性和其他生物活性提供依据。1 仪器与药品1.1 仪器台式高速冷冻离心机、台式冷冻干燥机、旋转蒸壳聚糖修饰载鲎血蛋白-白蛋白微球的 制备及其活性研究曾紫怡，蔡鹰，刘佳华，廖思丽，张国光*(广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088)摘要：文章通过分析壳聚糖修饰的牛血清白蛋白为载体制备包载鲎血蛋白的微球，考察制备微球的最佳工艺和活性。载药微球粒径大小较为均一，粒径范围为(28554)nm。Zeta 电位值为(-42.693.69)mV，包封率为(83.0754.86)%，载药量为(34.252.41)%，在人工血液(pH=7.4)、肠液(pH=6.8)、胃液(pH=1.2)中 24 h 的累积释放量分别为 55.63%、55.25%、48.75%。载药微球生物相容性高，稳定性好，药物释放具有明显的缓释效果。关键词：壳聚糖；牛血清白蛋白；鲎血蛋白；微球中图分类号：Q5 文献标志码：A 文章编号：1008-4800(2023)14-0062-04DOI:10.19900/ki.ISSN1008-4800.2023.14.019Preparation and Activity of Chitosan-modified Limulus Lysate Protein-albumin MicrospheresZENG Zi-yi,CAI Ying,LIU Jia-hua,LIAO Si-li,ZHANG Guo-guang*(School of Chemistry and Environment,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)Abstract:Chitosan-modified bovine serum albumin(BSA)was used as the carrier to prepare the microspheres containing tachypleus amebocyte lysate(TAL)blood protein.The size of drug-loaded microspheres is relatively uniform,and the particle size range is(285 54)nm.Zeta potential value was(-42.69 3.69)mV,entrapment rate was(83.075 4.86)%,drug loading was(34.25 2.41)%,and cumulative release in artificial blood(pH=7.4),intestinal juice(pH=6.8),and gastric juice(pH=1.2)for 24 hours was 55.63%,55.25%,and 48.75%,respectively.The drug-loaded microspheres have high biocompatibility and good stability,and the drug release has obvious slow release effect.Keywords:chitosan;bovine serum albumin;limulus amebocyte lysate protein;microsphere2023年05月|6339.64%、23.69%。(2)磷酸盐缓冲液 pH。设计各组加入 4.0 mL 磷酸盐缓冲液的 pH 值分别为 6.0、7.0、8.0、9.0，搅拌转速为 1 200 r/min、搅拌时间为 12 h、50 mg 鲎血水解蛋白、100 mg 壳聚糖-牛血清白蛋白微球、无水乙醇用量为 24 mL、25%戊二醛用量为 35.0 L。结果各组的包封率为 68.89%、76.68%、84.49%、63.15%。(3)搅拌时间。设计各组搅拌时间分别为 8、10、12、14、16 h，4.0 mL 的磷酸盐缓冲液(pH=8.0)、搅拌转速为 1 200 r/min、100 mg 壳聚糖-牛血清白蛋白微球、30 mg 鲎血水解蛋白、无水乙醇用量为 24.0 mL、25%戊二醛用量为 35.0 L。结果各组的包封率分别为 66.12%、84.42%、87.82%、79.90%、53.20%。(4)交联剂浓度。设计各组加入戊二醛浓度分别为 10%、20%、30%、40%、50%，4.0mL 磷酸盐缓冲液(pH=8.0)、搅拌转速为 1 200 r/min、搅拌时间为 12 h、100 mg 壳聚糖-牛血清白蛋白微球、50 mg 鲎血水解蛋白、无水乙醇用量为24.0 mL。结果各组的包封率为39.76%、65.25%、75.37%、53.64%、40.62%、12.70%。2.6 正交实验设计由单因素设计结果，以载药微球的包封率为指标，通过探究鲎血水解蛋白用量(25 mg、30 mg、35 mg)、磷酸盐缓冲液 pH 值(pH=7.5、8.0、8.5)、搅拌时间(11 h、12 h、13 h)、戊二醛浓度(20%、25%、30%)确定最佳工艺条件。每个因素采用三个水平，按照 L9(34)正交设计进行试验。结果为 1(25 mg、pH=7.5、11 h、20%)包封率为 87.49%；2(25 mg、pH=8.0、13 h、25%)包封率为80.86%；3(25 mg、pH=8.5、12 h、30%)包封率为 87.36%；4(30 mg、pH=7.5、13 h、30%)包封率为67.08%；5(30 mg、pH=8.0、12 h、20%)包封率为 83.20%；6(30 mg、pH=8.5、11 h、25%)包封率为 85.59%；7(35 mg、pH=7.5、12 h、25%)包封率为 81.58%；8(35 mg、pH=8.0、11 h、30%)包封率为72.74%；9(35 mg、pH=8.5、13 h、20%)包封率为 85.78%可知，当鲎血水解蛋白用量为 25 mg、磷酸盐缓冲液 pH 值为 8.5、搅拌时间为 13 h 及戊二醛浓度为20%时为制备载药微球最佳条件。2.7 载药微球的表征2.7.1 粒径与表面形态将冷冻干燥所得鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球粉末置于烧杯中，超声 2 h 后冷冻干燥得样品粉末，经扫描电镜观察载药微球的粒径以及表面形貌，结果如图 1 所示。液，继续放入 35 水浴锅中水浴搅拌 20 min，后将溶液放入离心机离心得到沉淀(3 500 r/min，30 min，4)。将所得沉淀置于干净的烧杯中，加入 10 mL 的纯化水，再次加入 20.0 mL 的乙二胺四乙酸二钠溶液在30 的条件下水浴搅拌反应 20 min，后加入 20.0 mL 丙酮于烧杯中继续在 30 的条件下水浴搅拌 10 min，反应完成后溶液倒入离心管中离心(3 500 r/min，30 min，4)。得鲎血脱铜蛋白沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀三次后放入冷冻干燥机冷冻干燥得鲎血脱铜蛋白粉末。2.2 鲎血水解蛋白制备根据文献 2，取一定量鲎血脱铜蛋白粉末加入胰蛋白酶，调节其溶液的 pH 值使其为 8.00，50 的条件下恒温水浴搅拌水解3 h后得鲎血水解蛋白溶液。待其沉淀后取上清液，冷冻干燥后即得鲎血水解蛋白粉末。2.3 壳聚糖-白蛋白复合微球的制备分别配制 1.0 mg/mL 的壳聚糖和三聚磷酸钠溶液，用 NaOH 和盐酸调节二者 pH 使其=5.00。其次向40.0 mL 的壳聚糖溶液中缓慢的滴加将 10.0 mL 的三聚磷酸钠溶液，充分搅拌 1 h 后形成壳聚糖-三聚磷酸钠混悬液。随后混悬液中加入 200 mg 牛血清白蛋白，放入恒温水浴锅中在 90 条件下搅拌充分反应1 h，待溶液冷却后使用NaOH调节溶液的pH至5.95，再在常温下使用磁力搅拌 0.5 h，即得壳聚糖-白蛋白复合微球混悬液。最后将混悬液倒入离心管中放入离心机中离心(3 500 r/min，30 min，4)，经冷冻干燥24 h 后即得壳聚糖-白蛋白复合微球冻干粉。2.4 鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球的制备取一定量鲎血水解蛋白和 100 mg 壳聚糖-白蛋白微球，加入 4.0 mL 磷酸盐缓冲液并搅拌，随后缓慢滴加 24.0 mL 无水乙醇，在溶液变白时加入 35.0 L戊二醛，持续搅拌 13 h 后得到鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球混悬液。冷冻干燥后即得鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球冻干粉3。2.5 单因素设计(1)鲎血水解蛋白用量。设计各组加入鲎血水解蛋白用量分别为 30、40、50、60、70 mg，4.0 mL 的磷酸盐缓冲液(pH=8.0)、搅拌转速为 1 200 r/min、搅拌时间为 12 h、100 mg 壳聚糖-牛血清白蛋白微球、无水乙醇用量为 24.0 mL、25%戊二醛用量为 35L。结果各组的包封率分别为 86.39%、74.31%、48.21%、技术与信息64|2023年05月溶液中残留的乙醇，以 3 500 r/min 高速离心后取上清液，鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球固体保存。上清液定容于 25 mL 容量瓶，固体进行真空冷冻干燥。(2)制备标准曲线。取 50 mg 鲎血水解蛋白，置于25.0 mL 容量瓶用纯化水进行定容，配制成 2 mg/mL鲎血水解蛋白溶液。分别取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 水解蛋白溶液加纯化水定容到 1.0 mL，再向其加入 5 mL考马斯亮蓝溶液，置于紫外分光光度计中进行测量，调节波长为 595 nm。得鲎血水解蛋白溶液标准曲线：A=0.157 6 C+0.105，r=995 6(1)(3)测定包封率和载药量。取 1.0 mL 上清液加入于 5.0 mL 考马斯亮蓝溶液中，充分反应后置于紫外分光光度计中进行测量，调节波长为 595 nm 测得上清液中游离鲎血水解蛋白的重量。将鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球粉末置于电子分析天平称量，得载药微球的重量。计算公式：包封率=(W总-W游)/W总100%(2)载药量=(W总-W游)/W载药微球100%(3)式中：W总为鲎血水解蛋白总量；W游为上清液中游离的鲎血水解蛋白重量；W载药微球为鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球粉末总重量。结 果：包 封 率 为(83.0754.86)%，载 药 量 为(34.252.41)%。2.7.5 体外释放实验分别准确称取 60 mg 的载药微球和鲎血水解蛋白，置于含有3.0 mL的人工血液、肠液、胃液4(pH 7.4、图1 载药微球扫描电镜图由图 1 可知，鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球呈球形或类球形，粒径大小较为均一，粒径范围为(28554)nm。2.7.2 Zeta 电位的测定取鲎血水解蛋白-壳聚糖-牛血清白蛋白微球适量，按要求稀释后置于 Zeta 电位及粒度分析仪中测定。Zeta电位测定结果为(-42.693.69)mV，体系较为稳定。2.7.3 水合粒径的测定将样品分散均匀，略微浑浊但能透光为最佳，置于纳米粒度及ZETA电位分析仪中测试。如图2所示，测试结果为 664.7 nm，分布系数为 0.558 9。2.7.4 包封率和载药量的测定(1)样品预处理。将鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球混悬液置于旋转蒸发仪进行旋转蒸发，蒸出样品图2 水合粒径测试结果2023年05月|65累积释放量分别为 52.48%、53.68%、45.21%。24 h 时的各组鲎血水解蛋白的累积释放量均高于 86.00%，而载药微球的累积释放量分别为 55.63%、55.25%、48.75%，说明载药微球具有较好的缓释效果。3 结语本研究制备微球的最优处方为鲎血水解蛋白用量为25 mg、磷酸盐缓冲液 pH 值为 8.5、搅拌时间为 13 h 及戊二醛浓度为 20%、Zeta 电位值为(-42.693.69)mV、粒径为(28554)nm、包封率为(83.0754.86)%、载药量为(34.252.41)%。制得的鲎血水解蛋白-壳聚糖-白蛋白微球生物相容性高，有较好的稳定性，药物释放具有明显的缓释效果。参考文献：1 朱清浩，谈继淮，李丹丹，等.多功能壳聚糖基防油剂在防油纸中的研究进展J.精细化工，2021，38(12)：2404-2414.2 邓春梅，杜建喜，康信煌，等.一种鲎血浆蛋白的水解方法P.中国专利：201610651742.X,2016-08-11.3 张良珂，侯世祥，宋相容，等.一种白蛋白纳米粒的制备与评价J.中国药学杂志，2007(05)：365-367.4 国家药典委员会.国家药典M.北京：中国医药科技出版社，2005.作者简介：曾紫怡(2000-)，女，汉族，湖南永兴人，本科，研究方向：药物化学、药剂学。基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目“壳聚糖修饰载鲎血蛋白-白蛋白微球的制备及其活性探究”(202110566032)。pH=6.8、pH=1.2)透析袋内(截留量 70 kDa)，使透析袋内药物浓度达到 20 mg/mL。再将透析袋置于装有30.0 mL 磷酸盐缓冲液的培养皿中，使得透析袋全部浸入缓冲液中，放入恒温振荡仪中在 37、100 r/min下恒温振荡，分别在振荡 1、2、4、6、8、12、24 h 各取出培养皿中 1.0 mL 的磷酸盐缓冲液，同时加入等量介质。取出的 1.0 mL 的释放介质于 595 nm 波长处测定其吸光度。计算水解蛋白的累积释放率，得体外释放曲线。结果如图 3、图 4、图 5 所示。载药微球累积释放量/%鲎血水解蛋白累积释放量/%累积释放量/%时间/h载药微球累积释放量/%鲎血水解蛋白累积释放量/%图3 人工血液体外释放曲线累积释放量/%时间/h载药微球累积释放量/%鲎血水解蛋白累积释放量/%图4 人工肠液体外释放曲线计算公式：Q=CnV0+(C1+C2+C3+Cn-1)V/m (4)根据体外释放曲线得知，载药微球初始时有突释的现象出现，随后的释放量逐渐平缓，前 8 h 载药微球与鲎血水解蛋白的释放效率都较快，到 12 h 时释放基本完成，在人工血液、肠液、胃液中，载药微球的累积释放量/%时间/h载药微球累积释放量/%鲎血水解蛋白累积释放量/%图5 人工胃液体外释放曲线