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动物细胞工程上课ppt第三节第三节 动物细胞工程及应用动物细胞工程及应用动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备细胞核移植细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程的动物细胞工程的基础基础1、概念、概念 是指从动物机体内取出是指从动物机体内取出相关相关的组织，的组织，将它分散成将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在，然后放在适宜的适宜的培养基中，让这些细胞培养基中，让这些细胞生长生长和和增殖增殖。2、原理、原理细胞增殖细胞增殖一、动物细胞培养一、动物细胞培养幼龄动物幼龄动物取动物器官取动物器官和组织和组织剪碎组织剪碎组织细胞培养细胞培养胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已已改变改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。细胞贴壁生长细胞贴壁生长 培养贴附性细胞时培养贴附性细胞时,细胞要能贴细胞要能贴 附于底物上才能生长繁殖附于底物上才能生长繁殖.细胞接触抑制细胞接触抑制 细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。增加。有关概念有关概念原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般培养的第原代细胞。一般培养的第1 1代细胞与传代细胞与传1010代以代以内的细胞称为原代细胞培养。内的细胞称为原代细胞培养。传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。培养瓶中继续培养，称为传代培养。1 1、动物细胞培养液的主要成分是什么？、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？较植物组培培养基有何独特之处？2 2、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终 培养成新个体？培养成新个体？主要成分主要成分 ：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素 和动物血清等和动物血清等独特之处有：独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体不能发育成新的动物个体思考题：思考题：3 3、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织 做动物细胞培养材料？做动物细胞培养材料？4 4、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，分散做成细胞悬浮液有利于培养。殖，分散做成细胞悬浮液有利于培养。5 5、培养瓶中的细胞会充满整个培养瓶吗？、培养瓶中的细胞会充满整个培养瓶吗？不会，细胞会贴壁分裂生长到表面相互接触时，细不会，细胞会贴壁分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。7 7、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞 间的物质是什么成份？间的物质是什么成份？催化蛋白质水解。催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质细胞间的物质主要是蛋白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)8 8、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂6 6、把细胞继续转移到其他培养瓶继续培养，、把细胞继续转移到其他培养瓶继续培养，怎样操作？怎样操作？将贴满细胞壁的细胞用将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶胰蛋白酶处理，然后处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。分瓶继续培养，让细胞继续增殖。1010、既然、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物 组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？1111、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制注意时间的控制不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PHPH不同，而正常组织细胞不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适的生存环境与胰蛋白酶的最适PHPH较接近较接近9 9、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能1 1）无菌、无毒的环境）无菌、无毒的环境 保证细胞保证细胞顺利的生顺利的生长增殖长增殖 添加一定量的抗生素，定期更换培养液添加一定量的抗生素，定期更换培养液添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清等。无机盐、微量元素、动物血清等。4、动物细胞培养的条件、动物细胞培养的条件2 2）营养）营养3 3）适宜的温度和）适宜的温度和PHPH 培养室中控制培养室中控制,使之达到使之达到 36.5 7.27.436.5 7.27.4O O2 2（95%95%空气）维持细胞的有氧呼吸空气）维持细胞的有氧呼吸 5%CO 5%CO2 2 维持培养液的维持培养液的PHPH4 4）气体环境）气体环境植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较全能性全能性增殖增殖蔗糖蔗糖动物血清动物血清细胞株、细胞系细胞株、细胞系细胞细胞,某些蛋白质某些蛋白质5 5、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用（1）培养健康皮肤细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康皮肤细胞用于烧伤病人皮肤移植（2）基因工程的受体细胞，）基因工程的受体细胞，生产蛋白生物制品：生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体等。扰素、单克隆抗体等。（4）用于检测有毒物质用于检测有毒物质（3）细胞的生理、药理、病理研究）细胞的生理、药理、病理研究 资料一：资料一：培养的动物细胞可以用于培养的动物细胞可以用于检测有毒物质检测有毒物质。许。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。而灵敏的有效手段。资料二：资料二：人工关节人工关节软骨再生软骨再生1.1.第一次手第一次手术术:从从病人病人关节软骨关节软骨中未中未 受力的部分，取出一片受力的部分，取出一片约为约为葡萄葡萄干干大大小的健康小的健康软软骨骨组织组织。2.2.分分离软离软骨骨细胞并经细胞并经三星期的三星期的体体外外 培培养养，使，使细胞数细胞数增加增加约约10102020倍。倍。3.3.第二次手第二次手术术:清理清理软软骨受骨受损损的部分，的部分，从从下方骨下方骨头头部位取出一片部位取出一片约与伤约与伤口口大大小相同的骨膜，小相同的骨膜，缝缝在在伤伤口上方，再口上方，再将将软软骨骨细胞细胞注射到骨膜下方。注射到骨膜下方。资料三：资料三：结果结果:经过复健经过复健一年一年后后即可即可恢复恢复正常的生活。正常的生活。二、动物细胞核移植二、动物细胞核移植 动物核移植是将动物的一个细胞的动物核移植是将动物的一个细胞的细胞细胞核核,移入一个已经去移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞掉细胞核的卵母细胞中中.使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的这个新的胚胎最终发育为动物个体胚胎最终发育为动物个体.克隆动物：用核移植的方法得到的动物。克隆动物：用核移植的方法得到的动物。1、概念：、概念：克隆羊培育过程克隆羊培育过程黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利无性生殖无性生殖2、体细胞核移植技术的应用前景、体细胞核移植技术的应用前景 1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种、保护濒危物种3、生产医用蛋白质及组、生产医用蛋白质及组织器官的移植的供体织器官的移植的供体3 3、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题 1、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。2、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出易出 现早衰等问题。现早衰等问题。3、生产克隆动物费用昂贵。、生产克隆动物费用昂贵。细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用三、动物细胞融合三、动物细胞融合细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法三、动物细胞融合三、动物细胞融合仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核四、单克隆抗体四、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。效应效应B B细胞产生抗体细胞产生抗体B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。单克隆抗体单克隆抗体由单个由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高特点：特异性强、灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞细胞 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有物质，不仅具有B细胞细胞分泌抗体分泌抗体的能力，而且还有的能力，而且还有无限增殖无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体的本领，因而可以获得大量单克隆抗体3、与常规抗体相比，单克隆抗体有什么优点？、与常规抗体相比，单克隆抗体有什么优点？产量高，特异性强，灵敏度高产量高，特异性强，灵敏度高4 4、整个制备过程为何要经过两次筛选、整个制备过程为何要经过两次筛选第一次筛选得到第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），杂交瘤细胞（多种），第二次需先在多孔培养板上，在每孔第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个只有一个 杂杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是由于该细胞群是单个杂交瘤细胞单个杂交瘤细胞克隆得来的，所克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。的单克隆抗体。这里的这里的单克隆单克隆的确有的确有单个细胞单个细胞克隆的含义，只不克隆的含义，只不过克隆的不是过克隆的不是B B淋巴细胞，而是淋巴细胞，而是杂交瘤细胞杂交瘤细胞。B BB B瘤瘤 瘤瘤瘤瘤 瘤瘤5、细胞融合后培养液中有几种细胞？、细胞融合后培养液中有几种细胞？6 6、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞BB淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A A B B C C D D C单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用1、临床诊断、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿瘤治疗肿瘤资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内断，借以鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人们的注意，也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4 4、图中、图中为为 过程，常用过程，常用 _作为诱导剂，该细胞继承作为诱导剂，该细胞继承 _的遗传特性，既能的遗传特性，既能 _,_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得 ,该细胞能够产生该细胞能够产生_效应效应B B细胞细胞抗体抗体细胞融合和筛选细胞融合和筛选灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖制备单克隆抗体制备单克隆抗体不能，小鼠未免疫无法获得产生不能，小鼠未免疫无法获得产生单一抗体的效应单一抗体的效应B细胞细胞6、过程指细胞培养，目的是过程指细胞培养，目的是_ _，该过程包括该过程包括 _培养和培养和_培养两个阶段。培养两个阶段。原代原代传代传代5 5、此方案经过、此方案经过2 2次筛选，其目的不同，次筛选，其目的不同，是通过筛选获得是通过筛选获得_是通过筛选获得是通过筛选获得_7 7、图中、图中的培养能获得的培养能获得_ 细胞，便于大规模培养，抗体最终可细胞，便于大规模培养，抗体最终可 以从以从_和和_中获得。中获得。杂交瘤细胞杂交瘤细胞产生特定抗体的产生特定抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞在体外在体外条件下大量增殖条件下大量增殖足够量的杂交瘤足够量的杂交瘤细胞培养液细胞培养液小鼠腹水小鼠腹水资料整理仅供参考,用药方面谨遵医嘱