保健食品中非法添加物二氢吡...的肝细胞毒性与作用机制研究_肖雪蔓.pdf

第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFC1601702)、广东省食品质量安全重点实验室项目(2020B1212060059)Fund:Supported by the National Key Research and Development Program of China(2017YFC1601702),and the Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety(2020B1212060059)*通信作者:柳春红,博士,教授,主要研究方向为营养与食品安全。E-mail:*Corresponding author:LIU Chun-Hong,Ph.D,Professor,College of Food Sciences,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China.E-mail: 保健食品中非法添加物二氢吡啶类化合物诱导的肝细胞毒性与作用机制研究 肖雪蔓1,2,朱思俞1,2,刘 焕1,2,让一峰1,2,黄卉颖1,2,陈聪颖1,2,柳春红1,2*(1.华南农业大学食品学院,广州 510642;2.广东省食品质量安全重点实验室,广州 510642)摘摘 要要:目的目的 探究尼莫地平所致肝细胞毒性及分子机制并研究保健食品中非法添加物二氢吡啶类化合物对自噬通路的影响。方法方法 以不同浓度(0、3、10、30、100 mol/L)的尼莫地平作用于人肝癌细胞 HepG2 24 h,测定肝损伤指标谷丙转氨酶(alanine amino transferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate amino transferase,AST)活力,并利用 Western blot 检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、氧化应激通路、凋亡蛋白、自噬相关通路蛋白的表达;以不同浓度(0、3、10、30、100 mol/L)的氯维地平、硝苯地平、尼群地平、西尼地平、阿雷地平及马尼地平作用 HepG2 细胞 24 h,利用 Western blot 检测细胞中自噬相关通路蛋白的表达。结果结果 100 mol/L 的尼莫地平可上调 ALT 和 AST 活力、激活 MAPK 通路蛋白的表达、抑制核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)及下游解毒蛋白血红素加氧酶 1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达、增加微管相关蛋白 1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)/LC3、降低选择性自噬接头蛋白(sequestosome 1,SQSTM1)表达;氯维地平在 3 mol/L时引起细胞自噬,其他 6 种二氢吡啶类化合物均在 100 mol/L 时使细胞发生自噬。结论结论 尼莫地平所致的肝细胞毒性机制中自噬的发生可能是由 MAPK 通路介导的,其中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路促进 HepG2 细胞自噬的作用相对最强。此外,其他 6 种二氢吡啶类化合物氯维地平、硝苯地平、尼群地平、西尼地平、阿雷地平及马尼地平均可引起自噬。关键词关键词:二氢吡啶类化合物;尼莫地平;丝裂原活化蛋白激酶;自噬 Hepatocyte toxicity and mechanisms induced by illegal dihydropyridine additives in health foods XIAO Xue-Man1,2,ZHU Si-Yu1,2,LIU Huan1,2,RANG Yi-Feng1,2,HUANG Hui-Ying1,2,CHEN Cong-Ying1,2,LIU Chun-Hong1,2*(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety,Guangzhou 510642,China)ABSTRACT:Objective To explore the hepatotoxicity and molecular mechanism caused by nimodipine,and study the effect of illegal dihydropyridine additives in health foods on the autophagic pathway.Methods Nimodipine was DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.051第 11 期 肖雪蔓,等:保健食品中非法添加物二氢吡啶类化合物诱导的肝细胞毒性与作用机制研究 223 treated with different concentrations(0,3,10,30 and 100 mol/L)on human hepatoma cells HepG2 for 24 h.The liver injury indexes alanine amino transferase(ALT)and aspartate amino transferase(AST)viability were measured,and the expressions of proteins related with mitogen-activated protein kinase(MAPK),oxidative stress pathway,apoptosis protein and autophagy-related pathway were analyzed by Western blot.Clevidipine,nifedipine,nifedipine,cilnidipine,aranidipine and manidipine at different concentrations(0,3,10,30 and 100 mol/L)were used to treat HepG2 for 24 h.The expressions of autophagy-related pathway proteins were analyzed by Western blot.Results Nimodipine at 100 mol/L up-regulated ALT and AST activity,activated the expressions of MAPK pathway protein,inhibited the expressions of nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)and downstream detoxification protein heme oxygenase 1(HO-1),increased microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)II/LC3,and decreased the expressions of sequestosome 1(SQSTM1);clevidipine caused autophagy at 3 mol/L,and the other 6 kinds of dihydropyridines caused autophagy at 100 mol/L.Conclusion The onset of autophagy in the mechanism of nimodipine-induced hepatocytotoxicity might be mediated by the MAPK pathway,with the extracellular signal-regulated kinase(ERK)pathway promoting autophagy in HepG2 cells relatively most strongly.In addition,other 6 kinds of dihydropyridines,clevidipine,nifedipine,nifedipine,cilnidipine,aranidipine and manidipine,can cause autophagy.KEY WORDS:dihydropyridines;nimodipine;mitogen-activated protein kinase;autophagy 0 引 言 食品安全是指食品需保证无毒性、无危害,且满足一定营养物质要求,对人类的身体健康不构成任何慢性或急性危害。当前我国存在的食品安全问题主要出现在加工、运输、存放和销售等环节,其中加工环节存在的保健品非法添加问题更是引起了政府部门的高度重视1。2019 年14 月期间,国家市场监管总局联合公安部等 13 个部门部署“百日行动”,对保健食品一系列突出问题进行了集中整顿;2020 年 4 月,市场监管总局等 7 个部门联合印发保健食品行业专项清理整治行动方案(20202021 年)2。经打击整治,保健食品安全市场形势走好,但非法添加行为依然存在。微量添加、跨适应症添加、新型添加等时有出现,更有甚者为逃避监管,将非法添加的对象转向普通食品基质3。二氢吡啶类化合物是一类钙通道阻滞剂,用于治疗高血压、心力衰竭、心律失常等心血管疾病4,包括尼莫地平、硝苯地平、氨氯地平、拉西地平等。2019 年,国务院食品安全办、公安部、市场监管总局联合公布 3 起食品保健食品西药非法添加案例,包括将氨氯地平等西药成份的粉末组织灌装成胶囊并压片、包装,生产多个品种的降压类食品。制售含有非法添加药物的保健品违反中华人民共和国食品安全法,同时消费者在不知情的情况下容易过量服用药物,造成肾脏损伤甚至危及生命5。食品安全性毒理学评价应用毒理学的方法和技术,对食品中已存在或加工过程中混入有毒、有害物质进行研究,并探究其对人体健康的潜在危害和作用机制6。肝脏是机体代谢二氢吡啶类化合物的主要器官,在外源性化合物与内源性物质的生物转化中起着十分重要的作用,与人体健康息息相关。深入探讨二氢吡啶可能带来的肝脏毒性以及该毒性作用的分子机制十分必要。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一类细胞内蛋白激酶家族,它可在生长因子、炎性细胞因子或物理应激的刺激下被激活7,在真核细胞中,MAPK 可将细胞外刺激转化为细胞内信号,起到信号转导的作用,从而控制和调节许多重要的生理活动,如细胞增殖、细胞分化和细胞自噬和凋亡等8。本研究拟以 HepG2 细胞构建体外肝损伤模型,基于 MAPK信号通路介导的自噬探讨尼莫地平所致肝细胞毒性,并探究其余 6 种二氢吡啶类化合物是否引起自噬,丰富二氢吡啶类化合物的肝脏毒性资料,以期为进一步评估二氢吡啶类化合物的食品安全风险提供依据。1 材料与方法 1.1 材料与仪器 尼莫地平(纯度98%)、硝苯地平(纯度98%)、尼群地平(纯度95%)、氯维地平(纯度99%)、西尼地平(纯度98%)(上海阿拉丁试剂有限公司);阿雷地平(纯度 99.9%,北京中科质检标准品);马尼地平(纯度98%,上海麦克林生化科技有限公司);谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase/aspartate amino transferase,GOT/AST)测 试 盒、谷 丙 转 氨 酶(glutamic pyruvic transaminase/alanine amino transferase,GPT/ALT)测试盒(南京建 成生物工程 研究所);微 管相关蛋白 1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)抗体(武224 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 汉 三 鹰 生 物 技 术 有 限 公 司);甘 油 醛-3-磷酸 脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体、微管蛋白(tubulin)抗体(美国 Affinity 公司);其余抗体均购自美国 CST 公司。Multixkan Mk3 多功能酶标(美国Thermo Fisher Scientific公司);Mini-PROTEAN Tetra 蛋白垂直电泳装置(美国BIO-RAD 公司);DYCZ-40B 蛋白转膜装置(北京六一生物科技有限公司);AI600 凝胶成像仪(英国GE Healthcare 公司)。1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞HepG2从Procell(中国武汉Procell生命科技有限公司)获得,细胞培养液为含 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin,10000 U/mL)和 1%L-谷氨酰胺的最小必需培养基完全培养液。细胞培养环境为37和 5%CO2,正常情况下每隔 12 d 更换一次培养液。根据实验设计,取对数期细胞,铺板贴壁 24 h 后,分别用不同浓度(0、3、10、30、100 mol/L)的尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、西尼地平、氯维地平、阿雷地平及马尼地平处理细胞 24 h,随后对细胞样本进行相关的分析。1.2.2 肝细胞损伤水平 ALT、AST 活力测定 取对数期细胞,调整细胞浓度为 2105个/mL,每孔 1 mL 接种于 24 孔板中,每组设立 4 个平行孔。待细胞 24 h贴壁后,尼莫地平处理 24 h。弃去培养板中的上清,每孔加入 100 L 裂解液裂解细胞 30 min。再离心(4,12000 r/min,5 min),取上清液待用。按照试剂盒说明书步骤进行检测操作,在波长 510 nm 处测定各孔的 OD 值。1.2.3 Western blot 分析 取对数期细胞,调整细胞浓度为 3105个/mL,每孔1 mL 将细胞接种于 6 孔板中,贴壁 24 h 后,分别用不同浓度(0、3、10、30、100 mol/L)的尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、西尼地平、氯维地平、阿雷地平及马尼地平处理细胞 24 h。每孔加入 200 L 放射免疫沉淀法裂解缓冲液裂解细胞 30 min,取离心后的上清液测定其蛋白质浓度。蛋白质样品在沸水浴中煮沸,并在80环境下等分储存。将新鲜蛋白样品在 10%SDS-PAGE 中进行蛋白质电泳,然后转印在聚偏二氟乙烯膜上,用 5%脱脂奶粉中封闭2 h,随 后 用 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化 c-Jun氨基末端激酶(phospho-c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、P38(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)、磷酸化P38(phospho-P38 mitogen-activated protein kinase,p-P38MAPK)、核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶 1(heme oxygenase-1,HO-1)、细胞色素 c 氧化酶(cytochrome c oxidase,cytochrome C)、半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease protein,caspase)3、选择性自噬接头蛋白(sequestosome 1,SQSTM1)、LC3 一抗在 4过夜孵育。按 1:6000 的比例在室温孵育二抗 1 h。用 Image J 分析样品的光密度值,结果用目标蛋白的光密度值除以内参蛋白的光密度值来表示。每个样品做 3 个平行。1.3 数据分析 所有原始数据在 Microsoft Excel 2019 数据库中进行整理,同时使用 SPSS 18.0 进行统计分析。数据结果以平均值标准偏差表示。组间差异分析采用单因素方差分析,显著性水平 取 0.05。2 结果与分析 2.1 尼莫地平对细胞 ALT、AST 含量的影响 ALT、AST 活性的改变被认为是肝损伤的征兆9,以不同浓度的尼莫地平作用 HepG2 细胞 24 h 后,检测细胞的损伤情况。如图 1a 所示,HepG2 细胞 ALT 活性呈先下降后上升的趋势,在尼莫地平浓度为 3 mol/L 时,细胞 ALT活力被抑制,其下降具有统计学意义(P0.01);随后 ALT活力升高,且在浓度为 30、100 mol/L 时,该上升具有统计学意义(P0.01);在图 1b 中,细胞 AST 活力在作用浓度为 100 mol/L 出现上升(P0.01)。以上结果表明,尼莫地平在作用浓度 100 mol/L 时,可对 HepG2 细胞产生明显损伤。LALA 等10发现 2 名高血压患者服用尼莫地平后出现ALT、AST 等肝功能指标异常,停用尼莫地平进行保肝治疗后肝功能恢复,与本研究结果一致。2013 年加拿大一项人群回顾性队列研究表明,氨氯地平、非洛地平和硝苯地平与克拉霉素可能发生药物相互作用,这一相互作用可引起急性肾损伤,与 CYP3A4 代谢有关11;此外,日本报告了患者在服用氨氯地平后出现 2 例爆发性肝炎、1 例粒细胞缺乏症和3 例横纹肌溶解症,在联合使用氨氯地平和阿托伐他汀的患者中报告了 6 例横纹肌溶解症12,都与本研究结果对应。2.2 尼莫地平对 MAPK 通路蛋白的影响 MAPK 是一个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的总称,可在生长因子、炎性细胞因子或物理应激的刺激下被激活,作为三级激酶级联将细胞外刺激转化为细胞内信号,起到信号转导的作用,从而控制和调节细胞许多重要的生理过程,如细胞增殖、细胞分化、炎症反应和细胞凋亡等1314。MAPK 家族成员 ERK、JNK 和 P38 是一系列重要信号转导通路的关键组成部分。为进一步探讨尼莫地平所致肝细胞毒性的分子机制,检测了 MAPK 相关通路蛋白含量变化。如图 2 所示,以不同浓度的尼莫地平作用于细胞时,细胞内p-ERK/ERK 比值在 100 mol/L 时上调,该上调具有统计学意义(P0.01)。p-P38 含量则呈先上升后下降趋势,而 第 11 期 肖雪蔓,等:保健食品中非法添加物二氢吡啶类化合物诱导的肝细胞毒性与作用机制研究 225 注:a 表示尼莫地平作用 HepG2 24 h 对细胞 ALT 活力的影响;b 表示尼莫地平作用 HepG2 24 h 对细胞 AST 活力的影响。*:与对照组相比,P0.01,下同。图 1 尼莫地平对 HepG2 细胞肝损伤指标的影响(n=3)Fig.1 Influences of nimodipine on the hepatocellular injury indexes(n=3)注:a 表示对 p-ERK 蛋白含量的影响;b 表示对 ERK 蛋白含量的影响;c 表示对 p-ERK/ERK 蛋白含量的影响;d 表示对 p-P38 蛋白含量的影响;e 表示对 P38 蛋白含量的影响;f 表示对 p-P38/P38 蛋白含量的影响;g 表示对 p-JNK 蛋白含量的影响;h 表示对 JNK 蛋白含量的影响;i 表示对 p-ERK/ERK 蛋白含量的影响。*:与对照组相比,P0.05),在中低浓度和中高浓度 (10 mol/L和 30 mol/L)时通过上调p-P38的表达量从而上调 p-P38/P38 比值,该上调具有统计学意义(P0.01);在高浓度(100 mol/L)时通过下调 P38 的表达量从而上调p-P38/P38,该上调具有统计学意义(P0.01)。进一步分析p-JNK/JNK 的表达量,发现 10、30 和 100 mol/L 的尼莫地平不同程度地激活了 p-JNK/JNK(P0.05 或 P0.01)。总的来说,在最高浓度 100 mol/L 时,与对照组相比,p-ERK/ERK、p-P38/P38、p-JNK/JNK 蛋白的表达水平分别增加了 145.9%、105.2%、135.1%,提示高剂量的尼莫地平对 MAPK 通路蛋白的激活效果明显,且其中对 ERK 蛋白的激活效果最明显。KUSAKABE 等15用不同浓度的尼莫地平处理 PC12 细胞后,发现 20 mol/L 浓度下的尼莫地平可激活 p-ERK/ERK;高继英等16的研究结果表明尼莫地平能够影响颅脑损伤模型大鼠早期血管生成,其作用机制可能与ERK通路有关;WANG等17的研究发现尼莫地平影响大脑中动脉闭塞再灌注小鼠 NLRP3 炎症小体水平,该影响可能与 JNK/P38 MAPK 通路有关。这些研究结果都与本研究结果类似,中低和中高浓度作用下,细胞可能激活p-P38 及 p-JNK 的表达,高浓度下 MAPK 3 个家族成员均被激活,即尼莫地平在一定作用剂量下可激活 MAPK 通路。2.3 尼莫地平对氧化应激通路蛋白的影响 作为细胞外信号的传递者,MAPK 可被氧化应激及多种促炎因子激活,对经典的氧化应激通路 Nrf2 通路具有调节的作用18。Nrf2 调节多种抗炎和抗氧化基因的表达,如 HO-1,是在机体损伤应答反应中居核心地位的重要转录调节因子。为进一步探究尼莫地平是否影响氧化应激通路,本研究检测了相关通路蛋白。如图 3 所示,随着尼莫地平浓度的增加,Nrf2和HO-1的蛋白表达量出现了剂量依赖式下降,除了30 mol/L的HO-1的蛋白表达量,在30 mol/L 和 100 mol/L 时该下降具有统计学意义(P0.05或 P0.01),说明尼莫地平在高浓度时会显著影响氧化应激相关通路蛋白 Nrf2 及下游解毒蛋白 HO-1 的表达。2.4 尼莫地平对凋亡蛋白的影响 氧化应激常伴随着细胞凋亡的发生,凋亡又被称为 I型程序性细胞死亡,作为维持组织中细胞群体的一种稳态机制,其通常发生在发育和衰老过程中;此外,当细胞被疾病或有害物质侵害时,凋亡也作为一种防御机制被启动。当促凋亡蛋白被激活时,线粒体外膜的通透性改变,线粒体膜间 cytochrome C 释放到细胞质中,从而激活caspase 9,caspase 9 裂解并激活了 caspase 3 和 caspase 7,最终导致细胞凋亡19。为探究尼莫地平是否致细胞凋亡,本研究检测了相关凋亡蛋白的表达。如图 4 所示,尼莫地平在高浓度(100 mol/L)时使 cytochrome C 表达下调(P0.05),而对 caspase 3 无明显影响。表明 HepG2 细胞cytochrome C 未释放,未启动 caspase 3 级联反应。注:a 表示对 Nrf2 蛋白含量的影响;b 表示对 HO-1 蛋白含量的影响。图 3 尼莫地平对 HepG2 细胞 Nrf2 通路相关蛋白的影响(n=3)Fig.3 Influences of nimodipine on oxidative stress pathway proteins(n=3)注:a 表示对 Cytochrome C 蛋白含量的影响;b 表示对 Capase3 蛋白含量的影响。图 4 尼莫地平对 HepG2 细胞凋亡相关蛋白的影响(n=3)Fig.4 Influences of nimodipine on apoptosis-related pathway proteins(n=3)第 11 期 肖雪蔓,等:保健食品中非法添加物二氢吡啶类化合物诱导的肝细胞毒性与作用机制研究 227 2.5 尼莫地平对自噬相关通路蛋白的影响 凋亡和自噬是细胞死亡的主要形式,为进一步探究尼莫地平是否影响细胞自噬,本研究测定了自噬相关通路蛋白。如图 5a 所示,不同浓度的尼莫地平作用后,SQSTM1呈先下降再上升而后再下降的趋势,即在低浓度(3 mol/L)时下调 SQSTM1 的表达,在 10 mol/L 和 30 mol/L 时又逐渐上调,最后在高浓度(100 mol/L)时又下调其表达。LC3是另一自噬标志物,当自噬形成,LC3会转化成 LC320,因此LC3/LC3可用于判断细胞自噬水平。如图5b所示,与对照组相比,30 mol/L 和 100 mol/L 的尼莫地平可剂量依赖式上调 LC3/LC3,说明尼莫地平影响细胞自噬。自噬是细胞的另一常见的死亡形式,其又被称为型程序性细胞死亡。自噬通过细胞质细胞器、蛋白质和大分子的降解以及分解产物的循环利用,在细胞的生存和维持中发挥着重要的作用21。自噬由吞噬泡的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、自噬溶酶体的降解这 4 个步骤组成的,自噬流则是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程19。自噬形成时,胞浆型 LC3I 会酶解掉一小段多肽,随后转变为膜型的 LC3II。因此 LC3II/LC3比值的大小可用于评价自噬水平。此外,自噬底物 SQSTM1表达量也可用于检测自噬发生22。SQSTM1 是一种应激诱导蛋白,在自噬体形成过程中,SQSTM1 作为链接 LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁,被选择性地包裹进自噬体,之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解23,因此当LC3/LC3比值增加,同时 SQSTM1 减少时,自噬流畅通;当 LC3/LC3比值增加,同时 SQSTM1 升高时,自噬流抑制24。在本研究中,100 mol/L 的尼莫地平可上调LC3/LC3比值,同时下调 SQSTM1 的表达,提示尼莫地平所致的肝细胞毒性可能与自噬发生相关;而 30 mol/L的尼莫地平作用下,LC3/LC3比值和 SQSTM1 同时上升,提示此时 LC3II 增加不是自噬活化后自噬体增多而成,而可能是自噬溶酶体清除失败所致19,25。在多种动物和细胞研究发现 MAPK 通路介导了自噬发生2628。MAPK 在自噬中的作用因情况而异,P38 被报道与自噬有协同作用,而在某些条件下 MAPK 会减弱自噬。MAPK 对二氢吡啶类化合物肝毒性机制中自噬的影响尚不清楚28。在本研究中,100 mol/L 的尼莫地平可致体外肝损伤,分析其分子机制发现 MAPK通路蛋白被显著激活,其中 ERK 的激活最为明显,在此浓度下,Nrf2 通路蛋白被抑制,进一步的检测发现 LC3/LC3比值上升,SQSTM1 下降,即自噬发生。提示尼莫地平所致肝细胞毒性机制中的自噬可能是由于 MAPK 通路的激活,特别是 ERK的激活。相关研究明确将 ERK 激活与自噬程序性细胞死亡而不是细胞凋亡相关联29,例如 BARTHOLOMEUSZ 等30的研究证明 PEA-15 的抗肿瘤活性部分是通过诱导涉及ERK 途径激活的自噬介导的;CORCELLE 等31证明 ERK途径的持续激活足以使细胞进入自噬空泡;研究发现冬凌草素诱导的自噬过程受到 P38 和 JNK MAPK 的正向调节32;SUN 等33的研究表明神经酰胺处理的细胞表现出自噬和JNK通路活化的特征,此外抑制JNK通路可以阻断神经酰胺诱导的自噬和 LC3 表达的上调。2.6 7 种二氢吡啶类化合物对自噬相关通路蛋白的影响 为探讨除了尼莫地平外,其余 6 种常用的二氢吡啶类化合物是否也会引起细胞自噬,本研究进行了相关蛋白检测。如图 6 所示,在高浓度(100 mol/L)时,除了氯维地平外,其余 6 种二氢吡啶类化合物均上调了 LC3/LC3,该上调具有统计学意义(P0.01 或 P0.05),氯维地平在低浓度(3 mol/L)时上调 LC3/LC3。以上结果表明,这 7 种二氢吡啶类化合物均可引起 HepG2 细胞自噬发生。自噬分为巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬,其中巨自噬被认为是主要的自噬类型34。研究报道,硝苯地平触发巨自噬的激活,如LC3脂化增加、多泛素结合蛋白p62/SQSTM1和泛素化蛋白聚集体水平降低35;此外,以硝苯地平作用子宫内膜癌细胞 Hec-1A,发现其可以使自噬液泡增加、点状GFP-LC3 结构在细胞质中积累、细胞 LC3 量上调36。注:a 表示对 SQSTM1 蛋白含量的影响;b 表示对 LC3 蛋白含量的影响。图 5 尼莫地平对 HepG2 细胞自噬相关蛋白的影响(n=3)Fig.5 Influences of nimodipine on autophagy-related pathway proteins(n=3)228 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 图 6 二氢吡啶类化合物处理 HepG2 细胞 24 h 对自噬蛋白 LC3 的影响(n=3)Fig.6 Influences of dihydropyridines on HepG2 LC3 content(n=3)前述尼莫地平所致肝细胞毒性机制中的自噬可能是由于 MAPK 通路激活所致。由于硝苯地平、尼群地平等与尼莫地平均为二氢吡啶类化合物,根据结构效应关系,推测上述6种常用二氢吡啶类化合物引起HepG2细胞自噬可能也与 MAPK 通路激活,有待后续进一步验证。3 结 论 随着社会生产生活节奏的加快,我国居民的膳食结构和生活方式也随之产生巨大的变化。营养过剩、缺乏运动、精神压力大等因素使得罹患慢性病的人群随之增加。其中,高血压已然成为最常见的人类健康杀手。相当一部分人有长期服用降压药的需求,降压类保健食品随之出现。然而不法商家为达立竿见影的效果,在此类保健食品中非法添加降压类药物,其中不乏二氢吡啶类化合物。为监测二氢吡啶类化合物在保健食品安全领域的风险,本研究应用食品毒理学的方法和技术对其进行研究,探究其对人体肝脏健康的潜在危害和作用机制。本研究发现,尼莫地平所致的肝细胞毒性机制中自噬的发生可能是由 MAPK 通路介导的,其中 ERK 通路促进 HepG2 细胞自噬的作用相对最强。此外,初步发现其他6 种二氢吡啶类化合物氯维地平、硝苯地平、尼群地平、西尼地平、阿雷地平及马尼地平均可引起自噬。本研究丰富了二氢吡啶类化合物的肝脏毒性资料,为进一步评估二氢吡啶类化合物的保健食品安全风险提供依据。其余 6 种二氢吡啶类化合物自噬发生是否基于 MAPK通路,且各化合物自噬发生浓度的差异是否与化合物结构相关,在未来的研究中可作进一步的探讨。参考文献 1 任仕锦.我国食品安全的问题与对策J.中国食品工业,2023,(3):6971.RENG SJ.Problems and countermeasures of food safety in China J.Chin Food Ind,2023,(3):6971.2 李文华.我国保健食品安全协同治理法律问题探析J.食品科学,2021,42(13):360369.LI WH.Analysis of legal issues on collaborative management of health food safety in China J.Food Sci,2021,42(13):360369.3 宁霄,金绍明,董喆,等.UPLC-MS/MS 法检测食品及保健食品中非法添加硝苯地平的研究J.药物分析杂志,2022,42(5):821830.NING X,JIN SM,DONG Z,et al.Determination of nifedipine illegally adulterated in food and health foods by UPLC-MS/MS J.Chin J Pharm 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