精草铵膦绿色生物合成技术及应用前景_董怡.pdf

世 界 农 药Vol.45 No.4World PesticideApr.2023作者简介：董怡(1995)，女，浙江绍兴人，硕士，研究方向：农药研究。E-mail：。收稿日期：2023-04-07。32精草铵膦绿色生物合成技术及应用前景精草铵膦绿色生物合成技术及应用前景董 怡(永农生物科学有限公司，浙江 绍兴 312300)摘要：高效、低毒的灭生性除草剂草铵膦是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦具有 L-型和 D-型 2 种对映异构体，但只有 L-型具有除草活性。精草铵膦即 L-草铵膦，除草活性是 DL-草铵膦的 2 倍，其产业化合成工艺受到广泛关注。通过比较精草铵膦各合成技术的优缺点，生物合成工艺具有显著优势，同时介绍了精草铵膦近年市场概况并分析了其发展趋势。关键词：精草铵膦；L-草铵膦；生物合成；发展趋势中图分类号：TQ457文献标志码：A文章编号：1009-6485(2023)04-0032-05DOI：10.16201/10-1660/tq.2023.04.06Green biosynthesis technology and application prospect ofglufosinate-PDONG Yi(Yongnong Biological Science Co.,Ltd.,Shaoxing 312300,Zhejiang,China)Abstract:Glufosinate-P is a highly effective and low toxic biocidal herbicide,and also the second largest transgene cropresistant herbicide worldwide.Glufosinate-ammonium consists two enantiomers,L-type and D-type,but only L-type hasherbicidal activity.Glufosinate-P is L-glyphosate,which has twice the herbicidal activity as glyphosate,and its industrialsynthesis process has received widespread attention.This article compares the advantages and disadvantages of varioussynthesis technologies of glufosinate-P,revealing the superiority of biological synthesis processes,and introduces themarket situation and development trend of glufosinate-P in recent years.Keywords:glufosinate-P;L-glyphosate;biosynthesis;development trend精草铵膦又称 L-草铵膦，是拜耳从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离得到具有杀菌活性的三肽化合物双丙氨膦(bialaphos)，由2 分子 L-丙氨酸和一种当时未知的氨基酸构成1。精草铵膦(L-草铵膦)属于膦酸类除草剂，其作用机制和草铵膦相同。草铵膦是 D/L-草铵膦的外消旋物，仅 L-草铵膦具有除草活性2，通过作用于植物体谷氨酰胺合成酶，抑制 L-谷氨酰胺合成，导致细胞毒剂铵离子累积、铵代谢紊乱、氨基酸缺失、叶绿素解体、光合作用被抑制，最终将杂草彻底杀死3。技术创新第 4 期董怡：精草铵膦绿色生物合成技术及应用前景33除草剂销售榜首草甘膦4的长期广泛使用已导致牛筋草、小飞蓬、田旋花等杂草抗性的发生、发展。2015 年，草甘膦被国际癌症研究列为可能的人类致癌物，慢性动物饲养研究也发现可导致肝脏和肾脏肿瘤发病率增加5，种种致癌风波使法、德等国家禁用草甘膦。因此，草铵膦市场进一步增量，其销售额从 2012 年 4.5 亿美元增至 2020 年 10.50 亿美元，成为增长最快的非选择性除草剂。相较于传统草铵膦，精草铵膦活性是其 2 倍以上。永农生物科学有限公司 2018 年在国内登记了精草铵膦的原药和制剂，精草铵膦的推广能够降低50%施药量，即每使用 1 t 精草铵膦相当于直接向农田减排 1 t D-草铵膦无效体，有效减轻农田耕作对环境造成的负担6，符合国家农药减量增效政策。1 1 精草铵膦化学合成现状精草铵膦化学合成现状L-草铵膦制备方法主要有 3 种：不对称合成法7-9、外消旋体拆分法10-12和生物催化法。工业化大规模生产方法主要是不对称合成法和外消旋体拆分法13。不对称合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。2007 年，明治制果将-次膦酸酯基醛与伯胺反应生成亚胺类化合物，在 Jacobsen 催化下，用三甲基硅氰对亚胺进行不对称 Strecker 反应(图1)，再经水解转化得到精草铵膦，e.e.值最高达94%14。此工艺较复杂，需要使用昂贵的手性拆分试剂，理论收率仅 50%，单次拆分率低15。图 1不对称 Strecker 反应合成 L-草铵膦工艺路线外消旋体拆分法是通过对外消旋 DL-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现 D 型和 L 型异构体分离，从而得到光学纯 L-草铵膦。2018 年史泰龙等16报道了以 Pseudomonas sp.zjut126 为催化剂、N-癸酰草铵膦为拆分底物水解拆分制备 L-草铵膦的合成工艺路线。拆分过程中 N-癸酰草铵膦在Pseudomonas sp.zjut126 催化下，L-N-癸酰草铵膦水解生成 L-草铵膦(图 2)，而(D)-N-癸酰草铵膦不参与反应，处理后可得 e.e.值大于 95.2%的 L-草铵膦。此工艺步骤多、收率低、手性原料昂贵，不利于大规模制备。图 2用 Pseudomonas sp.zjut126 细胞拆分外消旋草铵膦制 L-草铵膦工艺流程2 2 精草铵膦生物合成精草铵膦生物合成生物催化具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，具有替代传统化学合成潜力。传统生物催化法主要包括：以 L-草铵膦衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，但前体昂贵且不易得；以外消旋草铵膦前体为底物，通过酶选择性拆分获得，理论收率仅 50%，造成原料浪费。此外，以DL-草铵膦为原料的去消旋合成法优势明显，由于当前市售的草铵膦主要为 DL-草铵膦，其工业化生产技术成熟，去消旋合成法以 DL-草铵膦为原料，世 界 农 药第 45 卷34原料易得，且成本较低，能够较好地对接现有草铵膦工业生产体系。2.12.1 草铵膦脱氢酶突变体去消旋合成草铵膦脱氢酶突变体去消旋合成 L-L-草铵膦草铵膦浙江工业大学薛亚平教授团队17发现了一种由野生菌 Thiopseudomonas denitrificans 中草铵膦脱氢酶 V377S 位点突变所得的突变体。以 DL-草铵膦为原料，D-草铵膦在 D-氨基酸氧化酶催化下形成 2-羰基-4-羟基(甲基)膦酰基丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；产物 2-羰基-4-羟基(甲基)膦酰基丁酸通过草铵膦脱氢酶突变体催化还原为L-草铵膦。该方法是对当前去消旋合成法的升级，草铵膦脱氢酶突变体具有更好催化效率，以外消旋DL-草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO 产率也大幅提升。2.22.2-转氨酶去消旋合成转氨酶去消旋合成 L-L-草铵膦草铵膦2021 年浙江大学杨立荣教授团队18公开了一种全新生物酶-转氨酶，来自芽孢杆菌(Bacillussp.)YM-01，用于去消旋化生产 L-草铵膦，能够避免有毒物质过氧化氢生成。以 DL-草铵膦为原料，通过 R-选择性的-转氨酶将 D-草铵膦转化为 2-羰基-4-羟基(甲基)膦酰基丁酸，L-型草铵膦由于不参与反应而得以保留；然后谷氨酸脱氢酶以 2-羰基-4-羟基(甲基)膦酰基丁酸为原料不对称合成 L-草铵膦，从而得到光学纯 L-型草铵膦(图 3)，并使用醇脱氢酶进行辅酶再生，同时生成丙酮作为第一步转氨酶的氨基受体，最大幅度提高了原料利用率。合成过程中所需辅原料异丙醇转化为副产物异丙胺，经过简单蒸馏回收为农药化工原料。图 3全新生物酶法去消旋化合成 L-草铵膦的工艺流程2.32.3 多酶级联生物催化生产多酶级联生物催化生产 L-L-草铵膦草铵膦上述 2 种去消旋合成法相对传统生物合成法均具有一定突破，但在大规模工业生产中仍具有其局限性。利用 D-氨基酸氧化酶将 D-草铵膦氧化为 2-羰基-4-羟基(甲基)膦酰基丁酸的过程中会产生过氧化氢，易导致酶蛋白失活，尽管理论上可以通过添加过氧化氢酶的方式将其去除，但在实际工业生产中并不能完全消除其不利影响，并且过氧化氢酶的使用会增加过程成本。-转氨酶去消旋合成 L-草铵膦的生物合成路线虽然能够避免催化过程中过氧化氢的产生，但其后续的生物不对称合成反应大多为可逆反应，因此存在酶利用效率低、L-草铵膦收率低等问题17-18。2022 年，中国石油和化学工业联合会组织专家召开了“手性纯草铵膦(精草铵膦)除草剂绿色生物制造技术与应用”科技成果鉴定会。该成果由永农生物联合华东理工大学生物催化与生物合成领域专家魏东芝教授团队共同开发，借助魏东芝教授团队20 多年在酶工程与生物催化方面的技术优势以及永农生物在草铵膦生产与应用方面的经验积累，开发了多酶级联生物催化生产 L-草铵膦新工艺，创新了高活性、高对映选择性酶定制技术和多酶自组装生第 4 期董怡：精草铵膦绿色生物合成技术及应用前景35物催化技术，创建了高底物浓度、纯水反应体系，通过生物催化技术，实现将 DL-草铵膦近 100%效率转化为 L-草铵膦，是生物制造生产农药品种的成功范例。该项目建成国际首条生物技术可实现年产5 000 t L-草铵膦生产线，在全球范围内首次实现L-草铵膦绿色生物制造工艺产业化。大规模生物法制造 L-草铵膦属国际首创，有力推动了产业升级，经济和社会效益显著19。3 3 展展望望1995 年，拜耳、先正达等巨头开始推广抗草铵膦以及多抗转基因作物20，1996 年转基因作物商业化种植，2018 年全球 26 个国家和地区种植了转基因作物，种植面积超 1.9 亿 hm2，其中大豆是最大抗除草剂转基因作物，玉米其次。2020 年草铵膦转基因作物需求为 1.2 万t，在草铵膦总需求中占比 26%。目前草铵膦已成为仅次于草甘膦的第二大转基因作物耐受除草剂，主要需求在单抗草铵膦种子(主要为巴斯夫的耐草铵膦油菜种子和耐草铵膦大豆种子)以及大豆、棉花、玉米的双抗/三抗种子。此外，全球草铵膦抗性基因已经导入水稻、小麦、甜菜、烟草、大豆、棉花、番茄、玉米、油菜、甘蔗等 20 多种作物中，商业化程度大幅提升。预计 2025 年，转基因作物需求将达 3.4 万 t，占比 36%，草铵膦全球需求量也将达 6.76 万 t21。当前抗草铵膦转基因作物商业化程度提升，草铵膦需求结构性改善。相较于传统草铵膦，精草铵膦活性倍增、用量减半，其可以代替传统灭生性除草剂草甘膦、百草枯，也同样适用于耐草铵膦转基因作物，精草铵膦正处于快速发展期，市场前景广阔。参考文献1KATO H,NAGAYAMA K.Isolation,structure and biological activityof trialaphosJ Agricultural and Biological Chemistry.1991,55(4):1133-1134.2周青燕,章程,柴如山.手性除草剂研究进展J.农药学学报,2010,12(2):109-118.3张宏军,刘学,张佳,等.草铵膦的作用机理及其应用J.农药科学与管理,2004,25(4):23-27.4杨益军.全球草铵膦市场现状及前景市场分析J.农药市场信息,2013,13(19):18-19.5杨明慧.草甘膦利弊分析J.农村经济与科技,2020(13):3.6楼亿圆,林志坚,郑仁朝,等.生物法合成L-草铵膦的研究进展J.现代农药,2009,8(3):1-4,10.7TSURUOKS T,SUZUKIA,TACHIBANAK,et al.Process for preparingD,L-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid:US14019879AP.1981-04-28.8ZEISS H J,MILDENBERGER H.Phosphorus-containing-aminonitrilesand a processfortheirpreparation:US4692541AP.1987-09-08.9WILLMAL.Method for producing glufosinates and intermediate productsfor the same:US6399162P.2002-03-19.10RAINER S,HARALD K.Process for the racemization of optically activeD-2-N-phenacetylamino-4-methyl phosphinobutyric acid:US4389488P.1983-06-21.11NATCHEV I A.Total synthesis and enzyme-substrate interaction ofD-,DL-and L-phosphinotrine,bialaphos(SF-1293)and its cyclicanaloguesJ.Journal of the Chemical Society,Perkin Transactions.1989,1:125-131.12KNORR H,SCHLEGEL G,STARK H.Processes for 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亿美元。1.1.市场增长的拉动因素市场增长的拉动因素由于激增的人口和对满足其需求的食品需求的增加，预计用于农业的草甘膦销售额将会增加。据世界银行估计，世界人口在 2021 年达到 78.4 亿人，到 2050 年将达到 100 亿人。2.2.草甘膦市场的挑战草甘膦市场的挑战与市场相关的挑战包括对环境的有害影响。草甘膦有助于杀灭杂草和其他物质，但在使用后会产生对环境和人类有害的毒性成分。预计这一趋势将在未来几年影响草甘膦的利用率。此外，还列举了缺乏监管标准、生产过程中产生的额外费用等。3.3.分类市场分类市场全球草甘膦市场按农业、家庭用和工业应用划分，分析需求和供应。其中，农业部门在食品和农产品的高需求和农业巨大就业份额的背景下，在 2035 年之前占据的市场份额最大。此外，草甘膦可在农业的所有阶段使用，从“种植前”到“种植后”。4.4.应用作物类型应用作物类型草甘膦应用作物类型分为转基因作物和传统作物，对 2 类作物的需求和供应也进行了分析。在这 2 类中，转基因作物被认为将在评估期结束之前保持最大份额。对草甘膦的需求随着转基因作物的种植受到关注而增加。5.5.预计未来增长的地区预计未来增长的地区据预测，到 2035 年底，亚太地区草甘膦市场在全球市场中将保持最大份额。其中，印度农业从业数量增加是草甘膦使用和市场增长的主要影响因素。就业率高意味着农业在该地区的优势，预计农业生产中的草甘膦使用率高。据报道，印度的总体农业岗位就业率从 2018-2019 年的 37%增加到 2019-2020 年的 38%。另一方面，北美市场预计也将在预测期间保持较大的市场份额。随着对转基因作物偏好的增加，现代农产品使用的增加似乎是未来几年市场扩张的主要因素。此外，快速增长的农业部门和土壤改良草甘膦的必要性预计也将对扩大市场作出积极贡献。草甘膦市场的主要参与企业包括先正达集团、拜耳、杜邦、陶氏化学、纽发姆、南通江山、安道麦、印度联合磷化、美国先锋公司、科迪华。