结核分枝杆菌PPE59蛋白...表达、纯化和生物信息学分析_王楚彤.pdf

第 卷 第 期 年 月长治医学院学报 基础研究 基金项目：安徽省自然科学基金项目（，）；蚌埠医学院研究生科研创新计划项目（，）作者单位：蚌埠医学院检验医学院检验医学实验中心（安徽 蚌埠）；蚌埠医学院检验医学院免疫学教研室；蚌埠医学院检验医学院临床检验诊断学教研室；蚌埠医学院慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室作者简介：王楚彤，女，硕士，研究方向：微生物与免疫学；通信作者：汪洪涛，男，博士，教授，研究方向：抗感染免疫，：；许涛，男，博士，讲师，研究方向：抗感染免疫，：。结核分枝杆菌 蛋白的表达、纯化和生物信息学分析王楚彤，袁美丽，魏 婧，李敏英，许 涛，汪洪涛，摘 要 目的：构建结核分枝杆菌 原核表达载体，异丙基 半乳糖苷（）诱导表达和纯化获得 蛋白；同时对 蛋白进行生物信息学分析，预测其可能结构和功能。方法：以 基因组为模板扩增获得 基因，利用同源重组将其克隆至原核表达载体，后转化至大肠杆菌表达菌株（）中，诱导表达，采用 亲和层析柱对 蛋白进行纯化，获得重组 蛋白并进行鉴定。使用、.、等软件对 蛋白的理化性质、磷酸化位点和、细胞表位等进行预测和分析。结果：成功构建 重组载体，经诱导表达和纯化，成功获得 蛋白；生物信息学预测发现，有 个开放阅读框，个磷酸化位点，并含有多个 细胞和 细胞抗原表位。结论：成功构建 表达载体，获得高纯度 蛋白，且被抗 小鼠单抗特异性识别；具有大量的磷酸化位点及丰富的、细胞表位，可作为结核病疫苗的重要候选蛋白之一。关键词 结核分枝杆菌；蛋白；原核表达；生物信息学中图分类号 文献标识码 文章编号（），：，：，（），：，：，；结核病（，）是由结核分枝杆菌（，）感染引起的人畜共患慢性传染性疾病。世界卫生组织 年全球结核病报告中显示，全球新发结核长治医学院学报 年第 卷病患者 万，新增死亡病例 万。更严重的是，对一线、二线的治疗药物产生了严重耐药性，以及艾滋病和结核病合并发生。因此，迫切需要确定关键靶点和开发潜在的治疗方法，以及研发新型结核病疫苗。全基因组测序发现基因组上存在一组富含脯氨酸谷氨酸（，）和脯氨酸脯氨酸 谷氨酸（，）蛋白家族，约占基因组编码区的，共编码 个蛋白。家族蛋白主要通过调节免疫反应来增强的毒力，从而影响免疫介导的病原体清除，通过介导结核分支杆菌外膜的营养物质转运调控细胞凋亡并调节细胞因子的分泌，在结核菌发病机制和免疫逃逸中也发挥关键作用。此外，蛋白还可作为潜在的特异性诊断试剂和抗结核疫苗的成分。随着比较基因组学技术的发展，通过全基因组比对研究发现，在结核分枝杆菌复合群中不同种细菌（如、牛分枝杆菌或）的基因组中存在一些缺失片段，这些缺失片段被称为差异区域（，），也称为 区。其 中，区 全 长.，包 括 共 个蛋白，区基因在大多数牛分枝杆菌和 中缺失。研究发现 能够增加 细胞免疫应答，用于血清学诊断时可以区分接种过疫苗的对照和结核患者，具有作为结核诊断抗原的潜力。和 可能作为转座酶发挥相应的功能。和 具有高度同源性，蛋白由 基因编 码，作 为 区 的 毒 力 蛋 白，在与宿主细胞的相互作用中发挥怎样的功能，目前未见详细报道。本研究通过体外表达和纯化获得 蛋白，同时应用生物信息学技术对 蛋白进行结构和功能等 相 关 信 息 预 测，为 进 一 步 研 究 蛋白生物学功能和致病机制，以及为后续结核病的诊断、治疗和疫苗研发奠定基础。材料与方法.材料.主要菌株和载体来源 质粒为蚌埠医学院慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室保存；标准株 基因组购自上海晶诺生物科技有限公司；大肠埃希菌克隆菌株 和表达菌株（）感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司。.主要试剂限制性核酸内切酶 和 购自宝日医生物技术（北京）有限公司；琼脂糖凝胶 回收试剂盒和快速质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；同源重组试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；卡那霉素购自上海碧云天生物技术有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物均购自英国 公司；其它试剂均为国产分析纯；引物由派森诺生物科技有限公司合成。.方法.目的基因 的扩增从（：）获 取 标准株 基因序列，根据同源重组克隆技术设计引物，上游引物：（下划线为 ），下游引物：（下划线为 ）。以 基因组为模板进行 扩增。扩增体系：，.，基 因 组，.，.，.，.。扩增反应条件：预变性 ，变性 ，退火，延伸 ，共 个循环，终延伸。取 扩增产物加入.琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并对目的基因回收纯化。.重组质粒 的构建及鉴定利用限制性内切酶 和 对 质粒进行双酶切，使其线性化。利用同源重组克隆技术，将纯化的 产物克隆至线性化的载体 上，重组克隆反应体系如下：双酶切产物.，.，.。，水浴 完成重组反应。取 重组产物转化入大肠埃希菌克隆 感受态细胞中，挑选阳性菌落用 引物进行菌落 鉴定。将 鉴定阳性的菌落扩大培养后进行测序鉴定。.蛋白的诱导表达将测序鉴定正确的重组 质粒转化至大肠埃希菌表达菌株（）感受态细胞中，挑取阳性菌落进行菌落 鉴定；将鉴定阳性的菌液接种于第 期王楚彤 等 结核分枝杆菌 蛋白的表达、纯化和生物信息学分析 液体培养基（含卡那霉素 ）中，震荡过夜培养；后将培养好的菌液按 比例接种到 液体培养基中（含卡那霉素 ），摇床培养至 值达.时，取 菌液作为诱导前菌液，剩余培养液加入终浓度 诱导表达，取 作为诱导后菌液；剩余菌液进行超声破碎，超声破碎后细菌裂解后的全蛋白 离心，分别取超声破碎后上清和沉淀，进行 电泳鉴定。.蛋白的纯化将超声破碎后细菌裂解后的全蛋白，离心 ，离心后沉淀用新鲜配制的包涵体洗涤液（尿素，.）洗涤 次；然后包涵体溶解液（尿素，.）溶解包涵体，离心；将包涵体缓慢滴加至稀释复性缓冲液中，进行梯度稀释复性；将上述复性后的 蛋白加载到预平衡的含有 亲和层析柱，收集流穿液，然后用含 咪唑洗脱液进行洗脱，考马斯亮蓝染色分析蛋白质纯度。.蛋白 鉴定 取纯化后 蛋白进行 电泳，浓缩胶以 电压电泳 ，分离胶以 电压电泳。恒压电转 ，将 蛋白转移至硝酸纤维素膜（），以 脱脂牛奶室温封闭 ；洗涤 次，加入小鼠来源的 单克隆抗体，水平摇床，过夜孵育；洗涤 次，加入 山羊抗小鼠 抗体，室温孵育；洗涤 次，化学发光试剂盒显影。.蛋白的生物信息学分析通过 的 工具分析 基因的开放阅读框架；采用 软件分析 蛋白的理化性质和亲水性；.和 软件预测磷酸化位点和跨膜区；利用 和 软件预测可能的 细胞与 细胞抗原表位。结果.重组载体的构建及鉴定 以 标准株 基因组为模板进行 扩增，扩增出目的基因，见图 所示，扩增产物大小约为 ，与预期大小一致。以转化后阳性菌落为模板，用 引物对其进行菌落 鉴定，其菌落 产物大小约为（见图）。测序结果显示（见图），插入 基因序列 一致。上述结果证实成功构建重组 质粒。：的 扩增产物（：；：阴性对照；：基因扩增）；：菌落 鉴定（：；：阴性对照；：菌液）；：测序鉴定图 的 扩增产物及重组 载体的构建与鉴定 .蛋白的表达鉴定 电泳鉴定结果显示，诱导后在约 处均有明显蛋白条带（图 泳道），与预期大小一致，超声破碎后上清和沉淀结果表明，蛋白主要以不可溶的包涵体形式表达（图 泳道）。.蛋白的纯化及鉴定 利用 亲和层析柱法对 蛋白进行纯化，分别收集流穿液和洗脱液进行 电泳检测，结果显示在约 处有明显单一条带（图 泳道 和），满足后续实验要求。取稀释复性纯化后 蛋白进行 电泳。显影结果显示，在约 处有明显特异性条带（图 泳道），表明 蛋白能被 单克隆抗体特异性识别。长治医学院学报 年第 卷：蛋白质分子质量标准；：诱导（空载体）；：未诱导；：诱导后；：诱导超声破碎后上清；：诱导超声破碎后沉淀。图 蛋白表达分析 ：蛋白质分子质量标准；：破碎后处理样品；：流穿液；：咪唑洗脱液图 蛋白纯化 ：蛋白质分子质量标准；：蛋白图 蛋白 鉴定 .基因和编码蛋白的基本信息及开放阅读框架 数据显示，基因（：）蛋白 编号为 .所在的基因组 登录号为 .。该基因全长为，位于基因组的 位置。基因共 个开放阅读框架，见图。图 基因开放阅读框架 .蛋白的理化性质及亲水性 采用 软件预测 蛋白理化性质及亲水性，结果显示 蛋白含有 个氨基酸，其中丙氨酸（）占.，亮氨酸（）占.，丝氨酸（）占.，蛋白相对分子质量为.。理论 值为.，正电荷残基数为，不稳定系数为.，为不稳定蛋白。蛋白的脂肪系数为.，总亲水性平均系数（）为.，可能为亲水性蛋白。分析 蛋白可能为亲水性蛋白（见图），其中第 位氨基酸亲水性系数最高，为.；第 位氨基酸亲水性系数最低，为.。图 蛋白的亲疏水性分析 .蛋白磷酸化位点及跨膜区 利用 .软件预测 蛋白有 个磷酸化位点，其中有 个磷酸化丝氨酸位点，个磷酸化苏氨酸位点，个磷酸化酪氨酸位点（见图）。采用 软件预测 蛋白跨膜螺旋数为（见图），跨膜氨基酸数为.，可能在细胞质内的概率为.，表明 蛋白可能为非跨膜区蛋白。图 蛋白磷酸化位点预测 第 期王楚彤 等 结核分枝杆菌 蛋白的表达、纯化和生物信息学分析图 蛋白的跨膜区分析 .蛋白抗原表位 利用 软件预测得到 蛋白多个可能 细胞抗原表位，其中得分大于.的可能 细胞抗原表位有 个，得分大于.的有 个（见表）。利用 软件预测得到多个可能 细胞抗原表位，类型为 ，其中大于 分以上的有 个（见表）。表 蛋白 细胞表位预测 等级序列开始氨基酸位置得分.表 蛋白 细胞抗原表位预测 等级序列开始氨基酸位置得分续表等级序列开始氨基酸位置得分 讨论结核病（）是由机会性病原体引起的一种致命性疾病，是全球主要死亡原因之一。目前持续的 大流行给 的防治工作带来了额外的挑战。而毒品的出现阻碍了根除 的步伐。进入人体后，巨噬细胞是主要效应细胞，而可通过多种机制逃逸其杀菌作用，只有 的人最终发展成。了解与宿主细胞之间的相互作用关系，有利于研发新型疫苗和抗结核药物。蛋白具有的独特序列、结构和表达特性已被发现影响巨噬细胞信号转导，可予以考虑用于新的药物靶向或免疫调节策略。与卡介苗差异区域（区）抗原是筛选特异性抗原应用于结核免疫诊断和疫苗研制的热点区域。有研究证明，、重组抗原、能够同时被 病人和（）的 特异的识别。除了 其他抗原在这两类人群中的细胞免疫应答没有显著性差异，提示这些抗原可能在感染宿主时表达，而无论最终是活动性结核还是潜伏感染，它们可能均被呈递并被免疫系统识别，此研究表明 蛋白参与结核杆菌与宿主之间的免疫应答机制。而在与宿主细胞之间具体发挥怎样的作用尚未见报道。通过对 蛋白的功能进行分析，将有助于我们更好的了解结核分枝杆菌的毒性和致病机制。本研究通过对 蛋白的理化性质分析得出其含有 个氨基酸，脂肪系数为.，是一种不稳定蛋白，并且含有 个磷酸化位点及多个 细胞抗原表位和 细胞抗原表位。而 胞应答是适应性免疫系统的重要组成部分，对预防结核分枝杆菌具有重要作用。细胞已经被证明可以通过塑造 细胞介导的免疫来调节对结核分枝杆菌的免疫应答。在长治医学院学报 年第 卷 蛋白抗原表位中发现的多个 细胞和 细胞抗原表位的存在表明其可能在调节适应性免疫反应中发挥作用。为了适应人类宿主并逃避免疫杀伤，的五个分泌系统，主要通过复杂的细胞壁直接输出许多毒力促进蛋白效应器和宿主病原体相互作用。而通过对 蛋白的理化性质分析预测其可能在细胞质内的概率为.，表明 蛋白可能为非跨膜区蛋白，蛋白可能在细胞壁表达，推测 蛋白可能通过在细胞壁上的表达建立与宿主细胞之间的免疫应答机制。有研究报道，一些重组蛋白可用于菌阴性肺结核的辅助诊断，其特异度与灵敏度较高，具有一定的临床应用价值。除此之外，一些血清蛋白 抗体指标联合检测可用于鉴别活动性结核病与健康人群，可用于活动性结核病的辅助诊断。本研究通过将目的基因 与原核表达载体 的连接转化进而得到重组菌，对重组菌扩大培养后进行诱导表达，结果显示其在空载菌中不表达，而未诱导的重组菌蛋白表达量明显低于诱导后的蛋白表达量。随后对诱导后的重组菌进行超声破碎，结果显示其在超声破碎后沉淀中的表达量明显高于超声破碎后上清中的蛋白表达量，表明 蛋白主要以包涵体形式存在。推测 蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。尽管 蛋白家族大多数成员的生物学功能尚未明确，但是国内外很多学者已经通过克隆、表达和纯化获得了很多单一的 蛋白家族成员抗原。该家族中的成员、和 等是研究较多的抗原，在血清学诊断和细胞免疫学诊断方面展现出较好的前景。很多学者已经对 家族部分蛋白成员的结构特点、细胞定位、相关功能以及临床血清学方面进行了一系列研究。由于 蛋白主要以包涵体形式存在，故利用 亲和层析柱法对目的蛋白进行纯化，结果显示洗脱液中的蛋白含量明显高于流出液中的蛋白含量。由于 蛋白的基因编码中含有，故利用小鼠 单克隆抗体对纯化的目的蛋白进行鉴定。结果显示在蛋白分子质量单位约 处有一条蛋白带，表明表达产物能被小鼠 单克隆抗体识别。而在巨噬细胞中复制并建立感染时，其中依赖于多种分枝杆菌脂类和蛋白质。蛋白作为 蛋白家族中的一员，其脂肪系数为.，推测 蛋白很有可能通过与宿主细胞的相互作用从而引发宿主细胞的免疫应答防御机制。另外，蛋白作为一种重组蛋白，具有一定的免疫原性并含有多个抗原表位，为后续对结核病血清学诊断提供一条新思路。参考文献 ，：，（）：卢春容，房宏霞，陆普选，等 年全球结核病报告：全球与中国关键数据分析新发传染病电子杂志，（）：，（）：，：，（），（）：，（），：，（）：，：，：，（），（）：，（）第 期王楚彤 等 结核分枝杆菌 蛋白的表达、纯化和生物信息学分析，（）：，（）：，（）：，（）：许涛，李敏英，王楚彤，等结核分枝杆菌 蛋白的原核表达、鉴定及其兔多克隆抗体的制备细胞与分子免疫学杂志，（）：，：，（）：高静韬，刘宇红 年世界卫生组织全球结核病报告要点解读国际呼吸杂志，（）：，：，（）：，：，（）：陈嘉臻结核分枝杆菌特异的 蛋白应用于结核免疫诊断的研究 上海：复旦大学，张苗苗 结核分枝杆菌特异的 区编码蛋白应用于结核血清免疫诊断的初步研究新乡：新乡医学院，（）：胡建平，韩俊垒，边红芝结核分枝杆菌、重组蛋白对菌阴肺结核的辅助诊断价值精准医学杂志，（）：李琳雪 结核分枝杆菌、及 蛋白在活动性结核病诊断中的临床应用研究遵义：遵义医科大学，：王璞，蔡玉荣，张刚，等结核分枝杆菌 蛋白家族生物学研究进展中国人兽共患病学报，（）：王晴岚结核分枝杆菌耐药机制研究进展和 蛋白在介导细菌耐药中的作用中国临床药理学与治疗学，（）：，：，（）：，：（收稿日期：；修回日期：）本刊有关书写单位、数字、统计学符号须知 计量单位：实行中华人民共和国法定计量单位，请参照法定计量单位在医学上的应用第 版。单位名称与单位符号不可混合使用，如 天应写为 ；组合单位符号中表示相除关系的斜线，应采用负数幂的形式表示，如 应改为 。数字：执行国家标准 关于出版物上数字用法的规定。公元历年、年代、年、月、日、时刻和计数、计量均用阿拉伯数字。小数点前后如超过 位数字时，每 位数字为一节，如 。但序数词和年份、页数、部队番号、仪表型号、标准号不分节。百分数的范围和偏差，前 个数字的百分符号不能省略，如：不要写为；（）不要写为 。附有长度单位的数值相乘时，按下列方式书写为：，不要写为 。统计学符号：按国家标准 统计学名词及符号的有关规定书写，常用如下：（）样本的算数平均数用英文小写（中位数仍用）；（）标准差用英文小写；（）标准误用英文小写，；（）检验英文小写；（）检验用英文大写；（）卡方检验用希文小写；（）相关系数用英文小写；（）自由度用希文小写；（）概率用英文大写 值前应给出具体检验值，如：值、值、值等）。以上符号均为斜体。（编辑部）