结直肠癌组织和细胞中人整合素α6的表达及作用分析_邢艳丽.pdf

文章编号：（）结直肠癌组织和细胞中人整合素 的表达及作用分析邢艳丽，尹星，付民，周阳，常欢（新乡医学院附属南阳市第二人民医院 肿瘤科，河南 南阳 ）摘要：目的探讨结直肠癌组织和细胞中人整合素 的表达特点及作用。方法以人结直肠癌细胞株 、，人永生化结肠上皮细胞系 ，以及结直肠癌组织和癌旁正常组织为研究对象。检测整合素 在结直肠癌组织和癌细胞中的表达特点；使用整合素 慢病毒过表达载体转染结直肠癌细胞，进行 细胞迁移和侵袭实验；同时检测整合素 过表达对结直肠癌细胞钙黏蛋白、钙黏蛋白、波形蛋白、及 蛋白表达水平。结果结直肠癌 细胞、细胞中整合素 表达水平明显高于人永生化结肠上皮 细胞，差异有统计学意义（）；结直肠癌组织中整合素 蛋白水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（）。结直肠癌细胞、中整合素 过表达组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）。结直肠癌细胞、中整合素 过表达组钙黏蛋白表达水平明显低于空白对照组，钙黏蛋白、波形蛋白表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）。结直肠癌细胞、中整合素 过表达组 水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）。结论整合素 在结直肠癌中高表达，可通过激活 信号通路促进肿瘤细胞的上皮细胞间充质转化和转移。关键词：结直肠癌；整合素；上皮间质转化；通路中图分类号：文献标识码：，.（，）：，；，（）；（），（），（）（）：；（，：）结直肠癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率仅次于肺癌、胃癌位居第位，死亡率位居第位。肿瘤细胞转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。相关研究显示，上皮细胞间充质转化导致肿瘤细胞极性丧失，逐渐向间质形态转变，明显提升肿瘤细胞的迁移、侵袭和抵抗治疗的能力，促进 ，肿瘤转移。上皮细胞间充质转化的发生是一个复杂级联过程，多种信号通路参与其中，通路是最主要的通路之一。整合素是一类位于细胞表面的黏附分子，通过与肿瘤微环境和胞外基质的相互作用，激活细胞内信号的双向传导，调控细胞骨架构成，促进肿瘤转移。整合素 是整合素家族的重要成员，在食管癌、乳腺癌、头颈癌等多种恶性肿瘤中均存在高表达，且参与调控肿瘤迁移、侵袭等多种生物学行为。本研究检测了结直肠癌组织和细胞水平整合素 的表达情况，并探讨其对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及分子机制。材料与方法 材料与主要试剂人结直肠癌细胞株 、及人永生化结肠上皮细胞系 均购于上海慧颖生物科技有限公司，使用含 胎牛血清的 培养基，放入 培养箱中常规培养。组织标本来源于本院收治的经病理检查确诊为结直肠癌患者，术前均无放化疗、免疫疗法等抗肿瘤治疗史，术中分别取无坏死肿瘤组织和癌旁 正常组织标本，磷酸缓冲液洗涤后放于液氮中保存。主要试剂：胎牛血清、培养基购于深圳市百恩维生物科技有限公司；鼠抗人整合素 单克隆抗体，鼠抗人 单克隆抗体购于旭华（上海）生物研发中心有限公司；兔抗人 钙黏附蛋白、钙黏蛋白单克隆抗体，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体购于上海奇康生物科技有限公司；整合素 慢病毒过表达载体购于上海联迈生物工程有限公司。方法 检测 提取各细胞株以及结直肠癌组织、癌旁组织的总蛋白，法蛋白定量。蛋白样品行 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至 ，脱脂奶粉室温下封闭，滴加鼠抗人整合素 单克隆抗体（）、兔抗人 钙黏蛋白单克隆抗体（）、兔抗人钙黏蛋白单克隆抗 体（）、鼠 抗 人 波 形 蛋 白 单 克 隆 抗 体（）、鼠抗人 单克隆抗体（），过 夜，滴 加 标 记 的 羊 抗 鼠 、羊 抗 兔 ，均为 稀释，室温反应，显色，避光显影，以 为内参对照计算各条带灰度值。细胞迁移和侵袭实验将饥饿处理后的结直肠癌细胞消化、重悬计数后，向上室加入 无胎牛血清的 培养基，调整细胞浓度为 个 ，下室中加入 含 胎牛血清的 培养基，放入 的细胞培养箱中常规培养，取出后使用 多聚甲醛固定 ，结晶紫染色，倒置显微镜下观察并采集图像，随机选取个视野计数迁移细胞。向 上室加入基底胶（稀释）每孔，放入 的细胞培养箱中常规培养，消化计数细胞，与不含胎牛血清的 培养基混合，调整细胞浓度为 个 ，向下室加入含 胎牛血清的 培养基，继续培养，取出后固定、染色，将上室基底胶刮除，观察计数侵袭细胞数。结直肠癌细胞中 、蛋白表达水平检测将整合素 慢病毒过表达载体转入人结直肠癌细胞株、设为整合素 过表达组，常规培养 后用于实验；同时将正常培养的人结直肠癌细胞株 、设为对照组。提取细胞总蛋白，法蛋白定量，电泳后转膜至 ，脱脂奶粉室温下封闭，滴加鼠抗人 、单克隆抗体（）、鼠抗人 单克隆抗体（），过夜，滴加 标记的羊抗鼠 （），室温反应，显色，避光显影，以 为内参对照计算各条带灰度值。统计学分析采用 统计学软件进行数据处理，计量资料以表示，均符合正态性分布，多组间比较进行方差分析，组间两两比较进行检验，为差异有统计学意义。结果 整合素 在结直肠癌中的表达整合素 蛋白表达水平在不同类型细胞之间比较差异有统计学意义（），其中人结直肠癌 细胞、细胞的整合素 蛋白表达水平明显高于人永生化结肠上皮细胞株 ，差异有统计学意义（、，均 ）；见图，表。结直肠癌组织中整合素 蛋白相对表达量明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（）；见图，表。整合素 过表达对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响结直肠癌细胞 中整合素 过表达组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）；结直肠癌细胞 中整合素 过表达组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）；见图，表。中国实验诊断学 年月第 卷第期表各组细胞中整合素 蛋白的相对表达量比较（）细胞类型整合素 蛋白 值.值 注：与 细胞比较，；与 细胞比较，图整合素 在各细胞中表达的 电泳图表不同组织中整合素 蛋白的相对表达量比较（）组织类型整合素 蛋白癌旁正常组织 结直肠癌组织 值.值 图整合素 在结直肠癌组织与癌旁正常组织中表达的 电泳图注：、为癌旁正常组织，、为结直肠癌组织图 细胞迁移实验（）注：为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞；为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞图 细胞侵袭实验（）注：为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞；为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞表整合素 过表达对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响（个，）结直肠癌细胞株组别迁移细胞数侵袭细胞数 空白对照组 整合素 过表达组 值.值 空白对照组 整合素 过表达组 值.值 整合素 过表达对结直肠癌细胞上皮细胞间充质转化的影响结直肠癌细胞 中整合素 过表达组钙黏蛋白表达水平明显低于空白对照组，钙黏蛋白、波形蛋白表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）；结直肠癌细胞 中整合素 过表达组钙黏蛋白表达水平明显低于空白对照组，钙黏蛋白、波形蛋白表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）。见图，表。，图整合素 过表达对结直肠癌细胞上皮细胞间充质转化特异性蛋白表达影响的 电泳图注：为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞；为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞表整合素 过表达对结直肠癌细胞上皮细胞间充质转化特异性蛋白表达的影响（）结直肠癌细胞株组别钙黏蛋白钙黏蛋白波形蛋白 空白对照组 整合素 过表达组 值.值 空白对照组 整合素 过表达组 值.值 整合素 过表达对 信号通路的影响通 过 基 因 集 合 富 集 分 析 数 据 库 ，在个基因集中均发现整合素 表达与 通路呈正相关。结直肠癌细胞 中整合素 过表达组 水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）；结直肠癌细胞 中整合素 过表达组 表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（）。见图，表。图整合素 过表达对 、蛋白表达影响的 电泳图注：为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞；为 空白对照细胞；为 整合素 过表达细胞表整合素 过表达对 、蛋白表达的影响（）结直肠癌细胞株组别 空白对照组 整合素 过表达组 值.值 空白对照组 整合素 过表达组 值.值 讨论结直肠癌在我国呈高发病率和死亡率的特征，可能与近年来居民生活水平提升，食肉量增加有关，肿瘤细 胞迁 移 和 侵 袭 是患者高 死 亡 率 的 主 要 原因。探究结直肠癌迁移和侵袭的分子机制，对改善患者预后具有重要意义。上皮细胞间充质转化是正常生理状态下发育的重要过程，但在肿瘤发生时，上皮细胞间充质转化能够使肿瘤细胞获得更强的迁移和侵袭能力。上皮细胞间充质转化的中国实验诊断学 年月第 卷第期发生受肿瘤微环境、细胞外基质等多因素影响，而整合素是胞外基质与肿瘤细胞联系的重要桥梁，在上皮细胞间充质转化中发挥重要作用。研究者发现，整合素能够通过 信号通路促进上皮细胞间充质转化，促进胃癌细胞的转移；靶向沉默三阴性乳腺癌患者体内整合素 表达能够抑制 诱 导 的 上 皮 细 胞间 充 质 转 化 和 肿 瘤 转移；整合素 能够通过调控 信号通路促进胶质瘤转移和治疗抵抗。本研究前期工作中通过 数据库分析发现整合素 在结直肠癌中高表达。相关研究显示，整合素 在食管癌、乳腺癌、头颈部鳞癌等多种恶性肿瘤中均存在高表达。本研究选择微卫星稳定结直肠癌细胞株 、微卫星不稳定结直肠癌细胞株 ，结果显示，整合素 在结直肠癌细胞株 、中表达水平均明显高于人永生化结肠上皮细胞系 ；整合素 在结直肠癌病灶组织中表达水平明显高于癌旁正常组织；提示整合素 是结直肠癌潜在的促癌基因。本研究通过体外细胞学实验显示，整合素 过表达能够明显增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，且明显下调细胞中钙黏蛋白表达水平，上调钙黏蛋白、波形蛋白表达水平；提示整合素 在结直肠癌中高表达，并调控肿瘤细胞上皮细胞间充质转化，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。上皮细胞间充质转化的发生与细胞中信号传递密切相关，其中整合素是信号传导的主要调控分子。本研究首先通过基因集合富集分析 数据库 ，发现整合素 与 通路明显相关。通路是上皮细胞间充质转化的主要信号传导途径之一，通过磷酸化 ，与 形成复合体，介导上皮细胞间充质转化的发生与发展；同 时 还 可 通 过 非 依 赖 性 途 径，调 控 、等信号传导通路，介导肿瘤细胞上皮细胞间充质转化的发生与发展 。本研究显示，整 合素 过 表 达后能够明显 提升磷 酸 化 水平，激活 通路，促进结直肠癌细胞上皮细胞间充质转化，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。本研究结论可为靶向干预上皮细胞间充质转化来治疗结直肠癌提供一些基础研究依据。参考文献：季新荣，陈小建，单海峰腹腔镜结直肠癌根治术对结直肠癌患者尿动力学指标及性功能的影响海南医学，（）：吴文生腔镜结直肠癌根治术对结直肠癌患者临床疗效及胃肠功能的影响检验医学与临床，（）：，（），（）：，（）：戴闯 高龄结直肠癌外科治疗的探讨 中国急救医学，（）：娄乔，钟远 结直肠癌患者肠道菌群结构变化的分析 国际检验医学杂志，（）：，（），（）：，（）：赵玉洁，潘志忠 广州社区结直肠癌筛查现状 中华胃肠外科杂志，（）：朱德祥，许剑民 年中国临床肿瘤学会年会结直肠癌研究进展解析 中华消化外科杂志，（）：，（）：，（）：陈泽洋，汪欣，吴涛，等结直肠癌分子分型研究进展中华肿瘤杂志，（）：常芳，许喜喜，潘建芬 结直肠癌患者 分期的影响因素分析中国药物与临床，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：），