酱香型大曲中产4-乙基愈创...杆菌的筛选、鉴定及特性研究_王成俊.pdf

DOI：10.13746/j.njkj.2022171基金项目：五粮液集团公司产学研合作项目（CXY2020ZR002）；四川省科技厅重点研发项目（No.2021YFS0341）；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目（NJ2017-01）；四川理工学院人才引进项目（2017RCL25）。作者简介：王成俊（1992-），男，硕士研究生，助理工程师，主要从事食品分析检测及白酒安全风险防控。通讯作者：袁思棋（1984-），男，讲师，博士（后），主要从事酿造微生物资源利用与开发，E-mail：；刘君，教授，博士（后），主要从事白酒风味物质与微生物代谢途径研究，E-mail：。酱香型大曲中产4-乙基愈创木酚芽孢杆菌的筛选、鉴定及特性研究王成俊1，2，李玲珊1，3，范梅1，3，刘君1，2，3*，袁思棋1，3*（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.四川宜宾五粮液股份有限公司，四川 宜宾 644000；3.酿酒生物技术与应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000）摘要：从酱香型大曲中筛选得到4株产4-乙基愈创木酚（4-EG）的菌株。通过形态学观察、生理生化试验和分子鉴定种属确定产4-EG量较高的一株菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus wsp-2-2，产4-EG量达到245.3 g/L。通过耐受性实验研究，结果表明所确定菌株wsp-2-2能够耐受4%vol酒精度、15%的糖度和pH5.5的酸碱度，为后续研究蜡样芽孢杆菌的4-EG生物合成及应用提供了理论基础。关键词：4-乙基愈创木酚（4-EG）；酱香白酒大曲；蜡样芽孢杆菌；菌株鉴定；耐受性分析中图分类号：TS262.3；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）04-0045-08Screening,Identification and Characterization of 4-EthylguaiacolProducing Bacillus Strains from Jiangxiang DaquWANG Chengjun1,2,LI Lingshan1,3,FAN Mei1,3,LIU Jun1,2,3*and YUAN Siqi1,3*(1.School of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Yibin,Sichuan 644000;2.Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000;3.Sichuan Provincial Key Laboratory ofLiquor-making Biotechnology and Application,Yibin,Sichuan 644000,China)Abstract:Four strains that produce 4-ethylguaiacol(4-EG)were screened out from Jiangxiang Daqu.Morphological observation,physiological biochemical tests and molecular identification were used to identify the strains.The strain with high yield of 4-EG wasidentified as Bacillus cereus,and its yield of 4-EG reached 245.3 g/L.Tolerance experiments showed that the strain was resistant to4%vol alcohol,15%sugar and pH 5.5.This study has provided a theoretical basis for subsequent research on the biosynthesis andapplication of 4-EG in Bacillus cereus.Key words:4-ethylguaiacol(4-EG);Jiangxiang Daqu;Bacillus cereus;strain identification;tolerance analysis4-乙基愈创木酚(4-Ethylguaiacol，简称 4-EG；CAS No.2785-89-9)，化学名为 4-乙基-2-甲氧基苯酚，呈木香、烟味、香辛料和甜香兰素风味，具有缓和咸味等作用1。4-EG是酱香型白酒重要的微量香气成分，茅台酒中含 0.025 mg/L 的 4-EG 时，赋予茅台悠香醇厚风味，凸显其酱香风味2。此物质因具有酱香特征成为酱油的重要香气物质，酱油中蛋氨酰与4-EG的含量分别为3.99 mg/L与0.3 mg/L时，能让酱油呈现最佳风味3，在一定程度上减轻酱油的咸味，使味道呈现圆滑的效果4，还具有增香、防腐、杀菌等作用1，5。4-EG具有良好的活性氧消除功能，在抗氧化和预防心血管等多种疾病方面有一定作用6-8，是白酒中重要的风味物质和健康因子之一9-10，被广泛应用于酒类、酱油、饮料、食酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)4545酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)品、烟草等行业1，3-5，11。目前，生产4-EG的方法有直接提取法12、人工合成法13-14、生物转化法15-16。生物转化法生产4-EG是目前应用较为广泛的方法，具有反应条件温和，生产周期短，价格低廉，环境友好和生产成本低等优点15-17，已引起各国研究者的高度关注。本研究拟从酱香型大曲中分离具有产4-EG能力的芽孢杆菌类微生物作为目的菌株并探索其耐受条件，旨在为后续研究 4-EG 的生物合成及应用提供理论基础。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器1.1.1样品酱香型大曲：来自于某酒业有限公司制曲车间。1.1.2试剂4-乙 基 愈 创 木 酚（C9H12O2，色 谱 级，CASNo.2785-89-9）标准品，购于上海源叶科技生物有限公司。其他试剂和药品均购于国内相关公司。1.1.3仪器设备气相色谱-质谱联用仪：TSQ8000（安捷伦公司，美国）；PCR 仪：5020（Thermo Fisher 公司，美国）；可见光分光光度计：UV-1800型（翱艺仪器上海有限公司）等。1.1.4培养基富集培养基、分离培养基、发酵培养基、葡萄糖试验培基、蔗糖试验培养基、乳糖试验培养基、淀粉试验培养基、VP试验培养基等培养基（表1）。富集培养基用于目的菌株的分离培养，发酵培养基只添加麸皮作为发酵前体物质进行目的菌株的复筛，葡萄糖培养基用于生理生化试验，淀粉培养基用于检验菌株是否能分解淀粉，VP培养基用于生理生化鉴定。1.2试验方法1.2.1菌种分离及筛选1.2.1.1富集培养称取10 g大曲，粉碎后加入到50 mL富集培养基中，185 r/min 振荡培养 4 h，取 10 mL 于 80 水浴锅中处理30 min，静置，取1 mL上清液加入到装有 50 mL 的富集培养基中，37、180 r/min 培养过夜。1.2.1.2初筛过夜培养的菌悬液按10倍梯度稀释到10-7，分别取10-5、10-6、10-7的稀释液0.1 mL涂布于分离培养基，37 培养24 h，根据菌落形态大小、颜色等挑取菌落划线分离纯化，将纯化后的纯菌落接种到斜面培养基上，37 培养24 h。过滤发酵液，通过GC-MS检测4-EG相对含量，选择出产4-EG较高的菌株进行后续复筛。1.2.1.3复筛初筛分离得到的菌株经活化后，培养成种子菌悬液，按5%的接种量接入复筛培养基，于37、表1培养基培养基富集培养基分离培养基发酵培养基葡萄糖试验培养基蔗糖试验培养基乳糖试验培养基淀粉试验培养基VP试验培养基明胶试验培养基成分蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，水1000 mL，pH7.27.4，121 灭菌20 min蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，水1000 mL，琼脂1520 g，pH7.27.4，121 灭菌20 min麸皮5 g，水100 mL，121 灭菌20 min磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉0.2 g，葡萄糖10.0 g，水1000 mL，溴甲酚紫水溶液15 mL，pH7.0，121 灭菌20 min磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉0.2 g，蔗糖10.0 g，水1000 mL，溴甲酚紫水溶液15 mL，pH7.0，121 灭菌20 min磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，酵母粉0.2 g，乳糖10.0g，水1000 mL，溴甲酚紫水溶液15 mL，pH7.0，121 灭菌20 min蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，酵母浸粉5.0 g，可溶性淀粉2.0 g（0.2%的可溶性淀粉），水1000 mL，pH7.27.4,121 灭菌20 min葡萄糖5.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，pH7.0，121 灭菌20 min蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，酵母浸粉5.0 g，明胶1015 g，pH7.0，121 灭菌20 min4646180 r/min培养6 d，同时设置空白组。过滤发酵液，通过GC-MS检测4-EG相对含量。1.2.2菌种鉴定1.2.2.1菌种的形态学鉴定复筛得到的目的菌株，将其菌悬液梯度稀释后，涂布于平板上，37 培养32 h，观察菌落形态，挑单个菌落进行革兰氏染色和芽孢染色，用光学显微镜观察个体形态。1.2.2.2分子系统学鉴定分子系统学鉴定：离心收集对数期的培养菌液，采用Bacterial DNA Kit 试剂盒提取总DNA，提取得到的总 DNA 采用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。以目标菌株的总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），进行PCR扩增。扩增后产物送至上海生物生工公司进行测序。测序获得的数据进行人工比对和校正，在NCBI数据库中BLAST进行比对和数据相似性分析，借助MEGA7.0软件18，将目的基因序列与相关序列用Clustal W算法进行序列比对，利用p-dis-tance计算19并构建N-J法系统发育树20。1.2.3菌株的生理生化实验菌株生理生化鉴定包括接触酶试验、厌氧生长试验（浇筑法）、柠檬酸盐试验、糖发酵试验、淀粉水解试验、V-P试验、明胶试验。以上实验的操作流程按照实验流程进行。1.2.4菌种耐受性分析1.2.4.1耐酒精能力测定分别制备初始酒精度为 0、4%vol、8%vol、10%vol和12%vol的LB液体培养基，将培养好的目的菌株按2%的接种量分别接到各培养基中，于37、185 r/min培养24 h，600 nm测其吸光度，每个样品平行测3次取其平均值。1.2.4.2耐酸性能力测定分别制备初始pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的LB液体培养基，将培养好的目的菌株按2%的接种量分别接到各培养基中，于37、185 r/min培养24 h，600 nm测其吸光度，每个样品平行测3次取其平均值。1.2.4.3耐糖性能力测定分别制备初始葡萄糖质量分数为 0%、5%、10%、15%、20%、25%的LB液体培养基，将培养好的目的菌株按2%的接种量分别接到各培养基中，于37、185 r/min培养24 h，600 nm测其吸光度，每个样品平行测3次取其平均值。1.2.54-EG的GC-MS分析初筛发酵液前处理方式：各发酵液在8000 r/min下离心5 min，离心2次，得到的上清液用0.22 m过滤器过滤，将滤液和95%乙醇1 1均匀混合。通过GC-MS进行检测，采用外标法进行定量分析。复发酵实验发酵液前处理方式：将发酵液8000 r/min 离心 5 min，离心 2 次，取离心后的发酵液5 mL，加氯化钠（约1.4 g）至饱和，振荡摇匀，加入 2 mL 二氯甲烷，振荡摇匀后充分萃取 1 min，8000 r/min离心5 min，取下层清液，进行定量测定20。色谱条件：进样口温度 250，初始温度250；分流模式；初始柱温 50，保持 1 min，以30/min的速度升温至280，保持2 min，分析时间10 min。质谱条件：全扫描模式；离子源温度280；扫描范围40500 amu。2结果与分析2.1菌落及形态学观察酱香型大曲样品经过多次稀释和划线分离，根据平板上菌落的形态、颜色、菌落边缘隆起情况、菌落的透明度等菌落特征（表2），并闻香初步识别筛选分离获得10株目的菌株。从形态上判断10株菌株均为细菌，分别对这些菌株进行产4-EG试验。以上10株筛选获得的菌株，观察菌落形态（表2），结果表明所有菌株的形态学结果显示在培养基上生长时一部分菌株菌落颜色为奶白色，另一部分为半透明，菌落扁平，除菌株wsp-3-3边缘不规则外，其余菌株的边缘均表现出规则状态，仅有菌株wsp-1-3菌落较小，其余菌落均较大。对所有筛选的目的菌株进行3次革兰氏染色实验（表3），结果显示，除wsp-2-2和wsp-4-1外，其余均为革兰氏阳性菌（图1、图2）。菌株wsp-2-2王成俊，李玲珊，范梅，刘君，袁思棋 酱香型大曲中产4-乙基愈创木酚芽孢杆菌的筛选、鉴定及特性研究4747酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)菌株的 3 次染色实验在显微镜下观察为红紫色，少量芽孢未染色成功，呈现蓝色（图2），判断为革兰氏阴性菌，同样，菌株wsp-4-1为革兰氏阴性菌（图2）。2.2菌株产4-EG能力测定产 4-EG 试验发酵产物经过前处理后利用GC-MS 检测发酵产物中挥发性组分，以挥发性组分中的 4-EG 含量为基准，筛选获得4-EG产量较高的菌株（图3）。外标法确定4-EG的线性方程为y=2076576454.970 x-135388350.970（R2=0.99270.99），可计算出各单菌落发酵液中 4-EG 的含量（图3）。根据测定的实验数据（图3），除空白组外，其余菌株全部检测出4-EG，wsp-3-1发酵液中4-EG含量最高为 149.53 g/L，菌株 wsp-2-2 的发酵液中 4-EG 含量为 141.30 g/L，其余菌株相对较低（130 g/L左右）。将以上产量较高的菌株 wsp-2-1、wsp-2-2、wsp-3-1和wsp-4-1进行复发酵实验。发酵液经过改良的前处理后进行GC-MS检测，复发酵后菌株 wsp-2-2 中 4-EG 产量为 245.3 g/L，明显高于菌株wsp-3-1中4-EG含量（121.3 g/L），其余菌株产量均低于120 g/L。2.3部分生理生化实验鉴定挑选产4-EG较多的菌株wsp-2-1、wsp-2-2、表2菌落形态菌株wsp-1-1wsp-1-2wsp-1-3wsp-2-1wsp-2-2wsp-3-1wsp-3-2wsp-3-3wsp-4-1wsp-4-2菌落形态奶白色，菌落表面湿润，边缘整齐规则，扁平奶白色，菌落表面干燥，边缘整齐规则，扁平半透明，菌落较小，菌落表面光滑湿润，边缘整齐规则，扁平奶白色，菌落表面干燥，边缘整齐规则，扁平奶白色，菌落较大，菌落表面粗糙，边缘整齐规则，扁平半透明，菌落表面湿润，椭圆，边缘整齐规则，扁平半透明，菌落表面干燥，椭圆，边缘整齐规则，扁平半透明，菌落表面干燥，边缘不规则，扁平半透明，菌落较大，菌落表面湿润，边缘规则，扁平奶白色，菌落表面干燥，边缘规则，圆形，扁平表3菌株革兰氏染色结果菌株wsp-1-1wsp-1-2wsp-1-3wsp-2-1wsp-2-2革兰氏染色+-菌株wsp-3-1wsp-3-2wsp-3-3wsp-4-1wsp-4-2革兰氏染色+-+注：“+”革兰染色结果为阳性，“-”革兰染色结果为阴性。图1菌株wsp-3-1革兰氏染色和芽孢染色图2菌株wsp-2-2和wsp-4-1革兰氏染色和芽孢染色图3菌株发酵液中4-乙基愈创木酚含量4848wsp-3-1和wsp-4-1进行生理生化实验，结果如表4所示。4株目的菌株革兰氏染色、芽孢染色、接触酶试验、运动性试验、葡萄糖产酸试验、淀粉分解试验、VP 试验、明胶分解试验均为阳性，葡萄糖产气试验、乳糖分解试验为阴性。厌氧生长实验菌株wsp-3-1 为阳性，蔗糖分解试验菌株 wsp-4-1 为阴性。查阅 伯杰氏细菌鉴定手册 和 常见细菌鉴定手册 中芽孢杆菌属的描述，发现以上4株菌株有芽孢杆菌属或类似芽孢杆菌属微生物的特征，需要进一步的分子生物学鉴定。2.4菌株分子生物学鉴定提取菌株 wsp-2-1、wsp-2-2、wsp-3-1、wsp-4-1的基因组DNA，以总DNA为模板，经过PCR扩增获得16S rDNA序列，扩增后的目标片段约1500bp（图4）。根据扩增片段测序结果，菌株wsp-2-1、wsp-3-1、wsp-4-1经过多次DNA扩增，测序结果均为双峰，以上3菌株暂时未进行分子生物学鉴定。采用 NCBI 提供的 BLAST 程序将菌株 wsp-2-2 的PCR 测序结果与 GenBank 中已注册的 16S rRNA基因序列进行同源性比对，结果显示，该菌株与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的几个种之间同源性均达到98%以上。因此，初步判断菌株wsp-2-2属于芽孢杆菌属Bacillus物种。下载同源性已知序列和本实验中的序列进行MEGA7.0 比对和人工校正，采用基于 p 距离（p-distance）的邻近法分别构建系统发育树（图 5）。除 Bacillusmesophilus ACCC03113（序 列 号MK881071.1）序列长度为956 bp外，其余菌株的序列长度在1415 bp左右；碱基T、C、A、G平均比例分别为20.8、23.0、25.6、30.7，菌株wsp-2-2与上述平均比例基本一致（表5）。根据序列的所有信息，选用p距离（p-distance）和替换模型为转换和颠换（substitutions to included:Transitions+Transversions）进行序列间遗传距离计算，所有序列的遗传距离为 0.0000.073 之间，平均遗传距离为0.029。菌株wsp-2-2遗传距离与Bacillus circulans ATCC4513（0.06）、Bacillus olero-nius ATCC700005（0.072）和 Bacillus mesophilusACCC03113（0.066）均大于平均遗传距离，推测菌株wsp-2-2直接的系统发育关系较远，与其余的物种距离较近（0.029）。基于以上序列信息，采用p距离（p-distance）和替换模型为转换和颠换（substitutions to include d:Transitions+Transversions）构建 N-J 系统发育树（图5），可以看出：（1）Bacillus circulans ATCC4513、Bacillus oleronius ATCC700005 和 Bacillus mesophi-lus ACCC03113聚为一个单系，其余物种全部聚为一个单系；（2）菌株wsp-2-2的序列与蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus ATCC14579 聚为一支（自展值为85），表现出很近的亲缘关系。上述结果与遗传距离的结果基本一致。表4生理生化结果试验项目革兰氏染色芽孢染色接触酶试验运动性试验厌氧生长试验葡萄糖产酸试验葡萄糖产气试验乳糖分解试验蔗糖分解试验淀粉分解试验VP试验明胶分解试验wsp-2-1+-+-+wsp-2-2-+-+-+wsp-3-1+-+wsp-4-1-+-+-+注：“+”为阳性，“-”为阴性。图4菌株DNA PCR产物电泳图王成俊，李玲珊，范梅，刘君，袁思棋 酱香型大曲中产4-乙基愈创木酚芽孢杆菌的筛选、鉴定及特性研究4949酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)因此，结合形态学、生理生化实验和系统发育树结果，菌株wsp-2-2确认为蜡样芽孢杆菌Bacil-lus cereus，命名为Bacillus cereus wsp-2-2。2.5耐受性分析根据单菌株发酵实验产4-EG的能力，选取菌株wsp-2-2进行耐受性分析。2.5.1耐酒精能力的测定对筛选得到的蜡样芽孢杆菌wsp-2-2进行耐酒精能力的测定，从图6可以看出，随着培养基中酒精浓度增加，在吸光度为600 nm时的OD值呈现出不断下降的趋势，当酒精浓度达到8%vol时，菌株wsp-2-2表现出基本上不生长，OD值接近0，即在酒精浓度超过 8%vol 时菌株的生长受到明显抑制。2.5.2耐糖能力的测定对筛选得到的菌株wsp-2-2进行耐糖能力的测定（图7），结果显示，随着培养基中糖度增加，在吸光度为600 nm时的OD值呈现出先上升后下降的趋势。可能是随着糖度的不断增加，当糖度为10%时，菌株能够充分利用糖进行生长，提供生长充足的碳源和良好的生长环境；当糖度小于10%时，提供的碳源相对不足，造成生长速度相对缓慢；当糖度大于10%时（特别是超过15%时），糖度较高形成了高渗透压的环境，生长曲线急剧下降，使表5序列简介组成情况序列号MF102134.1NR 074540.1AY724690.1KC172044.1MG548582.1AY988598.1NR 157728.1NR157733.1NR114581.1NR157731.1NR115993.1MK881071.1Avg.菌株wsp-2-2 sequeceBacillus cereusST2Bacillus cereusATCC14579Bacillus circulansATCC4513Bacillus anthracisSH123Bacillus anthracisBA1Bacillus oleroniusATCC700005Bacillus paranthracisMCCC1A00395Bacillus pacificusMCCC1A06182Bacillus thuringiensisATCC10792Bacillus mobilisMCCC1A05942Bacillus mycoidesATCC6462Bacillus mesophilusACCC03113T20.921.020.920.521.021.020.820.720.720.820.821.019.820.8C22.923.022.923.523.023.023.622.922.922.922.822.722.523.0A25.625.425.725.525.525.424.925.725.825.725.825.925.425.6G30.630.630.630.530.630.630.730.630.630.630.630.432.330.7序列长1416141514171411141614151416141714171417141714179561381表6基于p距离的序列间遗传距离(替换模型为转换和颠换)序号12345678910111213菌种源wsp_2-2_sequeceMF102134.1Bacillus cereusST2NR_074540.1Bacillus cereusATCC14579AY724690.1Bacillus circulansATCC4513KC172044.1Bacillus anthracisSH123MG548582.1Bacillus anthracisBA1AY988598.1Bacillus oleroniusATCC700005NR_157728.1Bacillus paranthracisMCCC1A00395NR_157733.1Bacillus pacificusMCCC1A06182NR_114581.1Bacillus thuringiensisATCC10792NR_157731.1Bacillus mobilisMCCC1A05942NR_115993.1Bacillus mycoidesATCC6462MK881071.1Bacillus mesophilusACCC0311310.0010.0000.0600.0010.0010.0720.0020.0030.0030.0040.0060.06620.0010.0600.0000.0000.0730.0040.0040.0040.0060.0070.06630.0600.0010.0010.0720.0020.0030.0030.0040.0060.06640.0600.0600.0630.0610.0620.0620.0620.0630.03750.0000.0730.0040.0040.0040.0060.0070.06660.0730.0040.0040.0040.0060.0070.06670.0710.0710.0710.0730.0760.04380.0010.0010.0020.0080.06590.0010.0010.0070.065100.0010.0070.066110.0060.065120.0675050菌的生长受到了显著的限制。2.5.3耐酸能力的测定对筛选得到的菌株wsp-2-2进行耐酸能力的测定（图8），结果显示，随着培养基中pH值不断上升，OD600 nm呈现不断增加的趋势，当 pH 值小于 5时，OD600 nm基本接近0，菌株的生长明显受到抑制，当pH值为5.5时，菌株基本上可以正常生长，说明该菌株在偏酸性的培养基或者培养环境中生长。3结论本实验以酱香型大曲为原料，进行80 高温处理，经过富集、初筛和复筛，以及发酵实验，获得4-EG 含量最高的菌株为 wsp-2-2（245.3 g/L）。生理生化试验显示，菌株wsp-2-2革兰氏染色镜检阴性，葡萄糖试验产酸不产气，能分解蔗糖和淀粉，不能分解乳糖，接触酶试验呈阳性，明胶分解试验呈阳性，运动性试验呈阳性，VP试验呈阳性，都符合芽孢杆菌属的描述，初步判定为芽孢杆菌属物种。通过16S rDNA测序，在NCBI上Blast比对后图5基于p距离的菌株wsp-2-2构建N-J系统进化树图6菌株wsp-2-2耐酒精能力图7菌株wsp-2-2耐糖能力图8菌株wsp-2-2耐酸能力王成俊，李玲珊，范梅，刘君，袁思棋 酱香型大曲中产4-乙基愈创木酚芽孢杆菌的筛选、鉴定及特性研究5151酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)可以确定其种属，菌株的系统进化树结果显示菌株wsp-2-2 为蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus。菌株wsp-2-2 耐受性试验结果表明菌株 wsp-2-2 耐4%vol酒精度、15%的糖度和pH5.5的酸碱度，为白酒生产中控制4-EG的含量提供了一定的参考，也为生产健康保健功效的酱香型白酒打下了基础。参考文献：1朱瑞鸿,薛群成,李忠臣,等.合成食用香料手册M.北京：中国轻工业出版社,1986：122-123.2崔云前,曹小红,王春玲,等.发酵行业4-乙烯基愈创木酚和4-乙基愈创木酚研究进展J.中国酿造,2009(4)：1-4.3周恒刚.4-乙基愈创木酚J.酿酒,1989(6)：7-9.4包启安.酱油科学与酿造技术M.北京：中国轻工业出版社,2011.5龚含情,陈建波.利用光谱法和分子对接技术研究4-乙基-2-甲氧基苯酚与人血清白蛋白之间的相互作用J.光谱学与光谱分析,2018,38(6)：1869-1873.6张金修,李静,郭芳文.白酒中微量成分对人体的作用J.酿酒科技,2014(10)：143.7周金虎,管健,魏浩林,等.白酒中健康因子的研究进展J.酿酒科技,2017(7)：90-94.8陈双,陈华蓉,吴群,等.应用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱技术解析酿造用高粱蒸煮挥发性香气成分J.食品与发酵工业,2017,43(4)：201-2079王少磊,曹荣升,沈芳,等.浓香型大曲中4-乙基愈创木酚产生菌的筛选及其鉴定J.酿酒科技,2018(5)：48-52.10刘婧玮,蒋英丽,沈毅,等.酱香型白酒中风味物质的成因研究现状J.酿酒科技,2013(5)：85-89.11李雪梅,徐若飞,杨黎华,等.利用香荚兰内生菌制备天然香料及其在卷烟中的应用J.烟草科技,2008(3)：31-34.12林炯明,陈建军.从稻草生物油中提取4-乙基愈创木酚的方法：CN102659534AP.2012-09-12.13罗勇,吕待清,贾晓蕾,昌得冠.4-乙基愈创木酚的合成方法：CN1631862P.2005-06-29.14陈恩治,金涛.4-乙基愈创木酚的合成J.香料香精化妆品,2010(3)：30-32.15EDLIN DA,NARBADA,DICKINSON J R,et al.Thebiotransformation of simple phenolic compounds byBrettanomyces anomalusJ.FEMS microbiology letters,1995,125(2/3)：311-315.16LI X,YANG 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