黄花蒿对粘虫的杀虫活性研究_李春燕.pdf

黄花蒿对粘虫的杀虫活性研究李春燕，高成香，梁倩*（西南林业大学林学院，云南昆明650224）摘要：为了明确黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的作用方式。采用浸虫法、浸叶法和小叶碟法分别测定了黄花蒿石油醚萃取物对 3 龄幼虫的触杀、胃毒和拒食活性。结果表明：处理 1、3、5、7d 时触杀活性 LC50分别为 5.42mg/mL、5.17mg/mL、4.84mg/mL和 4.84mg/mL；处理 1、3、5、7d 时胃毒活性的 LC50分别为 12.42mg/mL、10.39mg/mL、9.10mg/mL和 8.81mg/mL；处理 24h 和 48h 时的 AFC50分别为 7.28mg/mL和 6.60mg/mL。黄花蒿石油醚萃取物对 3 龄粘虫表现出较强的触杀活性。研究结果为黄花蒿植物资源的开发利用及粘虫的生物防治提供参考依据。关键词：黄花蒿；粘虫；触杀活性；胃毒活性；拒食活性提取物对致倦库蚊和三带喙库蚊有较好的毒杀活性。以上研究结果表明黄花蒿具有杀虫活性，但黄花蒿提取物对粘虫的杀虫活性研究目前未见报道。本试验基于前期测定了黄花蒿、滇南艾、沙蒿、白莲蒿、牛尾蒿、臭蒿、五月艾和狭裂白蒿 8 种蒿属植物粗提物对粘虫的杀虫活性，发现黄花蒿粗提物的杀虫活性最好，处理7d 时的 LC50为 5.11mg/mL。又对黄花蒿石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水和正丁醇 5 种不同溶剂萃取物进行了杀虫活性筛选，发现黄花蒿石油醚部分的杀虫活性较强，处理 1d、3d、5d、7d 时的 LC50分别为 3.43mg/mL、2.90mg/mL、2.90mg/mL和 2.75 mg/mL。为了进一步明确其作用方式，以黄花蒿为材料，研究了黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的触杀、胃毒和拒食活性，为黄花蒿植物资源的开发与利用提供参考依据。1材料与方法1.1供试材料1.1.1 供试植物样品。黄花蒿全株于 2020 年 8 月采自西藏拉萨市城关区，经西南林业大学林学院植物学教研室杜凡教授鉴定为黄花蒿（Artemisia annua L.）。1.1.2 供试粘虫。虫卵由河南省济源白云实业有限公司提供，在温度（271），相对湿度（755）%，光照周期 LD=16h8h 的恒温培养箱中培养，待卵粒孵化后用新鲜玉米叶饲养至 3 龄。1.1.3 植物提取物的制备。将黄花蒿植物样品阴干、粉碎，用 95%乙醇溶液浸泡，超声 30min，重复提取 3 次，用旋转蒸发仪回收溶剂，减压浓缩得到黄花蒿粗提物。将粗取物加水悬浮，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取 3 次，旋转蒸发仪减压浓缩得到不同溶剂萃取物。1.2试验方法1.2.1 触杀活性测定。采用浸虫法测定黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的触杀活性18。根据预试验确定浓度范围，将萃取物样品用 0.5%吐温 80 水溶液稀释配制成不同浓度梯度，选取虫态一致的 3 龄粘虫放入不同浓度的溶液中浸泡 5s 后吸取多余药液，用毛笔粘虫（Mythimna separata）又名剃枝虫，属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）昆虫，是一种多食性农业迁徙害虫。主要为害玉米、小麦和水稻等1。通过取食植物叶片，造成粮食作物幼嫩叶片严重缺失和虫粪污染，产量下降。粘虫的暴发严重危害我国粮食作物安全2。目前主要使用氯虫腈、有机磷类、酰胺类及苏云金芽孢杆菌（Bt）对粘虫进行防治，但随着 Bt 作物的大面积种植和化学农药的使用，导致粘虫产生不同程度的抗药性。因此，在防治过程中应交替使用不同类型的生物杀虫剂进行综合防治，以延缓抗性产生。植物中的次生代谢物质是与昆虫协同进化过程中产生的具有结构新颖、活性多样以及机理独特的化合物3，对害虫不易产生抗药性、对人畜及非靶标生物安全、选择性高等优点4-6。因此，从植物中寻找具有生物活性的植物资源，已成为开发新型杀虫剂和先导化合物的一种有效途径。黄花蒿（Artemisia annua）俗称青蒿，其植株晒干后是具有挥发性气味的传统中药材之一7。在欧洲和美洲野生生长，在中国、土耳其、越南、阿富汗和澳大利亚等地区广泛种植，生境适应性极强，容易栽培。在亚洲国家被广泛用作治疗疟疾等疾病8，也具有抑菌9-10、抗氧化11、细胞毒性和抗肿瘤活性12。黄花蒿提取物也具有杀虫活性，例如张永强等13研究发现，黄花蒿丙酮提取物对柑橘全爪螨的杀螨活性较好。司爱富14研究比较了黄花蒿、藜、狗尾草、酢浆草、荇菜 5 种植物乙醇提取物的杀蚜活性，发现黄花蒿和藜乙醇提取物对萝卜蚜表现出较好的杀虫活性。王振吉等15研究发现，黄花蒿丙酮、乙醇及水提取物对菜蚜均具有较强的毒杀活性，并且随着浓度升高杀虫活性增强。Shekari 等16研究发现，黄花蒿甲醇提取物对榆树甲 3 龄幼虫的杀虫效果是成虫的 2.4 倍。Sharma 等17研究发现，黄花蒿叶氯仿基金项目：国家自然科学基金项目（31201572）；西南林业大学人才引进项目（111307）。第一作者：李春燕（1996-），女，云南红河人，在读硕士，研究方向：生物多样性保护与利用。通信作者：梁倩，女，研究方向：生物多样性保护与利用。试验研究现代园艺2023 年第 13 期DOI:10.14051/ki.xdyy.2023.13.063石油醚247.285.0513.130.860.143.570.31486.604.6711.300.880.141.140.77印楝素240.0010.0010.0021.450.160.540.91480.0010.0000.0031.320.250.081.00表 3黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 24 h 和 48 h 时的拒食活性名称处理时间（h）AFC50（mg/mL）95%置信区间斜率标准误差卡方/2P 值112.42（6.7424.63）31.64（18.01226.59）24.680.000310.39（4.5825.99）29.65（15.19680.00）31.370.00059.10（3.8022.59）26.24（13.42674.11）31.790.00078.81（3.8121.20）24.56（12.82537.81）31.140.00014.9710-3（4.235.82）12.4510-3（10.1216.44）0.230.97331.5410-3（0.368.74）6.1310-3（2.275056.62）25.880.00051.0810-3（0.105.66）5.7510-3（1.9257463.03）25.330.00070.9610-3（0.0010.52）5.9810-3（1.712.72E+18）30.880.000石油醚除虫菊酯表 2黄花蒿石油醚萃取物及除虫菊酯对粘虫 3 龄幼虫的胃毒活性萃取物处理时间（d）LC50（mg/mL）LC90（mg/mL）卡方/2P 值石油醚15.42（3.838.15）10.65（7.3431.19）13.190.00435.17（2.8711.85）10.65（6.44169.26）25.600.00054.84（2.0829.40）11.89（5.9912625.18）36.270.00074.84（2.0829.40）11.89（5.9912625.18）36.270.000除虫菊酯110.6610-3（0.92280.88）58.4510-3（14.6987328570.19）43.050.00039.3010-3（1.5186.55）63.1810-3（16.01121207.39）34.970.00058.5310-3（2.1340.99）57.8410-3（17.105395.92）26.010.00078.5310-3（2.1340.99）57.8410-3（17.105395.92）26.010.000表 1黄花石油醚萃取物及除虫菊酯对粘虫 3 龄幼虫的触杀活性萃取物处理时间（d）LC50（mg/mL）LC90（mg/mL）卡方/2P 值挑入放有新鲜玉米叶片的带盖塑料盒中饲养。每盒 1 只，每组 10 只，重复 5次。0.5%吐温 80 水溶液作阴性对照，除虫菊酯作阳性对照。在 1d、3d、5d、7d 时观察粘虫的存活情况并记录，毛笔轻触幼虫体表，若虫体僵直无反应，则判定为死亡。用公式（1）和（2）计算死亡率及校正死亡率。1.2.2 胃毒活性测定。采用浸叶法19测定黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的胃毒活性。采集新鲜玉米叶片，用剪刀剪成大小合适的叶段，在不同浓度的测试溶液中浸渍 5 s 后取出自然晾干，放入圆形带盖塑料盒中，每盒 2 片，将饥饿 4h 的粘虫 3 龄幼虫转移到塑料盒中。每个浓度处理 10 只，重复 5 次。0.5%吐温 80 水溶液作阴性对照，除虫菊酯作阳性对照。分别于处理后 1d、3d、5d 和 7d 时检查粘虫的死亡情况，用公式（1）和（2）计算死亡率及校正死亡率。1.2.3 拒食活性测定。采用小叶碟添加法20测定黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的拒食活性，将新鲜玉米叶用圆形打孔器打成直径 2.0cm 的圆形小叶碟，将小叶碟在供试溶液中浸渍 5s，取出自然晾干后放入圆形带盖塑料盒中，每盒 2片，接入 1 只饥饿 4 h 的试虫。每个浓度处理 10 只，重复 5 次。0.5%吐温 80 水溶液作为阴性对照，印楝素作为阳性对照。处理 24h 和 48h 时用坐标纸测定取食面积，用公式（3）计算拒食率。1.3数据处理以死亡率、拒食率作为毒力指标，采用 SPSS 23.0 软件进行回归-概率检验分析，计算半数致死浓度 LC50、拒食中浓度 AFC50、95%置信区间。校正死亡率及拒食率计算公式如下：死亡率（%）=死亡虫数/处理总虫数100（1）校正死亡率（%）=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）100（2）拒食率（%）=（对照组叶片消耗量-处理组叶片消耗量）/对照组叶片消耗量100（3）2结果与分析2.1黄花石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的触杀活性由表 1 可知，黄花蒿石油醚萃取物对粘虫具有较强的触杀活性。处理 5d 时触杀作用最强，LC50为4.84mg/mL。双因素方差分析表明，萃取物浓度显著影响粘虫 3 龄幼虫的校正死亡率（F 值为 511.46，df值为4，P0.01），且随萃取物浓度升高触杀作用增强。处理时间对粘虫校正死亡率影响不显著（F 值为 0.008，df值为 3，P0.05），处理第 5d 和第 7d 时，LC50未发生变化。F 值统计比较表明，萃取物浓度比处理时间对杀虫效果的影响更显著。2.2黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的胃毒活性由表 2 可知，黄花蒿石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫有一定的胃毒作用，处理 7d 时胃毒效果最好，LC50和 LC90分别为 8.81mg/mL和 24.56 mg/mL。根据双因素方差分析，萃取物浓度对试虫死亡率的影响较显著（F值为 590.03，df值为 4，P0.01）。处理时间对粘虫死亡率影响较小（F 值为 0.051，df值为 3，P0.05）。2.3黄花石油醚萃取物对粘虫 3 龄幼虫的拒食活性由表 3 可知，黄花蒿石油醚萃取物处理粘虫 3 龄幼虫 24h 和 48h 时表现出一定的拒食活性，处理 48h时拒食活性较强。根据双因素方差分析，萃取物浓度对试虫死亡率的影响较显著（F 值为 9.45，df 值为 4，P0.001）。处理时间对粘虫死亡率影响不显著（F 值为 0.01，df值为 1，P0.05）。2023 年第 13 期现代园艺试验研究3结论与讨论本试验采用浸虫法测定黄花蒿萃取物对粘虫 3 龄幼虫的触杀活性，处理 1d、3d、5d、7d 时的 LC50分别为5.42mg/mL、5.17mg/mL、4.84mg/mL和 4.84 mg/mL。张君霞等21研究发现，苍耳氯仿提取物对粘虫具有较强的触杀活性，LC50为 1307mg/mL。付艳红等22研究发现，灰绿黄堇氯仿萃取物对粘虫 3 龄幼虫具有较强的触杀活性，浓度为 22.08mg/mL，24h 时校正死亡率分别为87.5%，LC50为 13.07mg/mL。张新瑞等23报道了红蓼种子和茎秆乙酸乙酯萃取物对粘虫的触杀活性 LC50分别为 8.65mg/mL和 29.05mg/mL。黄花蒿石油醚萃取物的触杀活性明显优于苍耳、灰绿黄堇、红蓼种子和茎秆的触杀活性。浸叶法测定胃毒活性，黄花蒿石油醚萃取物处理粘 虫 3 龄 幼 虫 1d、3d、5d、7d 时 的 LC50分 别 为12.42mg/mL、10.39mg/mL、9.10mg/mL和 8.81mg/mL。李晶等24报道了藏橐吾、黄帚橐吾和箭叶橐吾提取物对粘虫的胃毒活性 LC50分别为 1.24mg/mL、2.32mg/mL和30.94 mg/mL；谢颖瑛25等研究发现，露蕊乌头甲醇提取物、马先蒿丙酮提取物和铁棒槌甲醇提取物对粘虫表现出较强胃毒活性，LC50分别为 2.13mg/mL、2.82mg/mL和 3.22mg/mL；苍 耳 丙 酮 提 取 物 的 LC50为852.1mg/mL21。黄花蒿石油醚萃取物对粘虫的胃毒活性的 LC50优于箭叶橐吾提取物和苍耳丙酮提取物，弱于藏橐吾提取物、黄帚橐吾提取物、马先蒿丙酮提取物、露蕊乌头和铁棒槌甲醇提取物。采用小叶碟添加法测定拒食活性，黄花蒿石油醚萃取物处理粘虫 3 龄幼虫 24h 和 48h 时 AFC50分别为7.28mg/mL 和 6.60mg/mL。于化龙26等研究发现，在供试剂量为 1g/mL时，木蝴蝶和铁皮石斛提取物对粘虫3 龄幼虫有较强的拒食活性，拒食率均为 90%，AFC50分别为 318.06mg/mL和 329.94mg/mL；刘翠茹等27研究发现，黑沙蒿乙酸乙酯提物对粘虫有较强的拒食活性，AFC50为 8.4 mg/mL；苍耳氯仿提取物对粘虫的 AFC50为 198.5 mg/mL21；五加皮丙酮提取物对粘虫 3 龄幼虫AFC50为 29.61 mg/mL28。黄花蒿石油醚萃取物对粘虫的 AFC50值均优于以上植物提取物。本研究发现黄花蒿石油醚萃取物对粘虫有一定的触杀、胃毒和拒食活性。分析触杀活性可能是石油醚萃取物中极性较小的油状亲脂性物质含量较高，处理后破坏粘虫的体壁构造，溶解角质层，增强了渗透和吸收能力，提高了杀虫效果29。在胃毒试验过程中观察到，粘虫虫体变黑，最后腐烂死亡，可能是石油醚萃取物破坏了中肠组织结构，或阻断神经传导而导致害虫麻痹、昏迷和死亡，也有可能影响昆虫体内消化酶的活性而损坏消化系统22。在拒食活性试验中发现，新鲜玉试验研究现代园艺2023 年第 13 期米叶片经黄花蒿石油醚萃取物处理后，粘虫表现出一定的拒食行为，其原因可能是取食含毒叶片引起幼虫的营养条件变化、体内代谢失调，食欲减退所致，可能是某种化合物抑制了消化酶活性，使试虫消化速度减缓30。通过气相色谱-质谱法检测发现黄花蒿石油醚萃取物中 4-喹啉甲醛含量较高，可能是 4-喹啉甲醛在发挥杀虫作用。下一步研究工作将明确黄花蒿石油醚萃取物中的杀虫活性成分及活性成分的杀虫机理，为黄花蒿作为新型植物源杀虫剂提供参考。（收稿：2022-09-15）参考文献：1Li H,Liu F F,Fu L Q,et al.Identification of 35 c-type lectins in theoriental armyworm,Mythimna separata(Walker)J.Insects,2021,12(6):559.2Quan Y,Yang J,Wang Y,et al.The rapid evolution of resistance tovip3Aa insecticidal protein in Mythimna separata(Walker)is not relatedto altered binding to midgut 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