T∕CACM 1326.12-2019 白花树种子超低温保存技术规程.pdf

ICS 11.120.01 C 23 团体标准 T/CACM 1326.122019 白花树种子超低温保存技术规程 Technical code of practice for cryopreservation of Styrax tonkinensis(Pierre)Craib ex Hartw.seeds 2019-10-17 发布 2019-10-17 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布T/CACM 1326.122019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 种子采收及选择.2 4.1 种子采收.2 4.2 种子选择.2 5 种子前处理.2 5.1 活力.2 5.2 含水量范围.2 6 种子保存量.3 7 种子冷冻方式.3 8 恢复培养.3 8.1 种子解冻处理.3 8.2 冻后种子活力检测.3 8.3 萌芽成苗.3 附录 A（规范性附录）TTC/磷酸盐缓冲液的配制和保存方法.4 参考文献.5 T/CACM 1326.122019 II 前 言 本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：T/CACM 1326.1 药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；T/CACM 1326.2 白木香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.3 降香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.4 益智种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.5 高良姜种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.6 朱砂根种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.7 草豆蔻种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.8 化州柚种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.9 樟种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.10 两面针种子超低温保存技术规程；。本标准按照 GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所、中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺，顾雅坤，符丽。T/CACM 1326.122019 1 白花树种子超低温保存技术规程 1 范围 本标准规定了白花树 Styrax tonkinensis(Pierre)Craib ex Hartw.种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等内容。本标准适用于白花树种子的液氮超低温长期贮藏。2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定 GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 白花树 Styrax tonkinensis(Pierre)Craib ex Hartw.为安息香科（Styracaceae）安息香属（Styrax Linn.）落叶乔木，其药用部位为干燥树脂。种子油称“白花油”，可供药用，治疥疮；树脂称“安息香”，含有较多香脂酸，是医药上贵重药材，具有开窍醒神、行气活血、止痛的功效。收载于中华人民共和国药典（2015 版）。3.2 白花树果实 Styrax tonkinensis(Pierre)Craib ex Hartw.fruits 果实为蒴果，果实近球形，直径 10 mm12 mm，顶端急尖或钝，外面密被灰色星状绒毛。3.3 白花树种子 Styrax tonkinensis(Pierre)Craib ex Hartw.seeds 白花树的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子栗褐色，卵形，密被小瘤状突起和星状毛。3.4 种子超低温保存 seed of cryopreservation 将经过前处理的白花树种子置于液氮（-196）中保存。T/CACM 1326.122019 2 4 种子采收及选择 4.1 种子采收 8 月10 月，果实由灰绿色变为灰棕色，且种子呈褐色时，即可采收，去除果壳，取出种子。4.2 种子选择 挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于 10 冰箱中保存备用（存放时间不超过 2 个月）。5 种子前处理 5.1 活力 5.1.1 检测 白花树种子活力以种子生活力为判别标准。按照 GB/T 3543.7 中的 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法检测种子生活力。随机抽取 30 粒种子，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成 2 爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入 TTC 溶液浸没种子，室温（25)避光放置 4 h 后观察染色结果。TTC 溶液的配制和保存方法见附录 A。5.1.2 鉴定及要求 直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子，否则为无生活力的种子。待保存的白花树种子生活力应 80。5.1.3 计算 生活力按照公式（1）进行计算：式中：A生活力；y有活力的种子数；x总的种子数。5.2 含水量范围 用尼龙网袋包裹白花树种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为 60:1，室温条件下干燥处理 0 h13 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由 35%40%降至 24%35%。按照 GB/T 3543.6 中的高恒温烘干法（130 烘干 1 h）测定种子含水量（W0），并按照公式（2）进行计算：T/CACM 1326.122019 3 式中：W0含水量，用百分数表示（）；M1种子鲜重，单位为克（g）；M2种子烘后重量，单位为克（g）。6 种子保存量 白花树种子保存量不少于 600 粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式 白花树种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的白花树种子放入 15 mL 冻存管（每管 2830 粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养 8.1 种子解冻处理 液氮中至少冻存 24 h 后，取出 2 个冻存管，立即放入 40 水浴中快速解冻 5 min。8.2 冻后种子活力检测 取出 1 管解冻后的种子，按照 5.1 活力检测方法进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力 30 时视为保存成功。8.3 萌芽成苗 将剩下 1 管解冻后的白花树种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度 25 30，湿度 7085 条件下培养。白花树种子出芽周期大概 60 d。T/CACM 1326.122019 4 A A 附 录 A（规范性附录）TTC/磷酸盐缓冲液的配制和保存方法 A.1 三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液配置和保存方法 精密称取 TTC 1.00 g，溶于 100 mL 磷酸盐缓冲溶液中，制成浓度为 1%的 TTC 溶液，调 pH 至 6.57.5，放于棕色瓶内，置于 4 冰箱中备用。A.2 磷酸盐缓冲液配置方法 溶液 I：9.08 g 磷酸二氢钾溶于 1 L 无菌水中；溶液 II：35.81 g 磷酸二氢钠溶于 1 L 无菌水中；按 III=23 的比例混合制成磷酸盐缓冲溶液。T/CACM 1326.122019 5 参 考 文 献 1 中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第 60(2)卷M.科学出版社,2004(1987)：084 2 Hwang Shu-mei.James Grimes.Styracaceae M/Flora Of China Beijing:Science Press/St.Louis:Missouri Botanical Garden Press.1996.15:253-271.2 国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京，中国医药科技出版社，2015：148 3 傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学M.中国科学文化出版社，2004:1 4 Reed BM.Plant CryopreservationA Practical GuideM.Springer,2010:3 _