基于TLR4_NF-κB信...特对糖尿病大鼠肾功能的影响_张威存.pdf

基于 TL4/NFB 信号通路探讨西格列汀与格列齐特对糖尿病大鼠肾功能的影响张威存，潘弟仪，黄晓冰广州中医药大学第三附属医院(广东 广州 510000)摘要目的:基于 Toll 样受体 4(TL4)/核因子B(NFB)信号通路探讨西格列汀与格列齐特对糖尿病大鼠肾功能的影响。方法:随机将 40 只大鼠分为 5 组，8 只一组。A、B、C、D 组采用常规方法建立糖尿病模型，E 组作为空白对照组。造模成功后第二天，A 组予以西格列汀+格列齐特缓释片灌胃，B 组予以西格列汀灌胃，C 组格列齐特缓释片灌胃，D 组作为模型组，与 E 组均予以等剂量的生理盐水灌胃。末次给药后采集五组大鼠的尾静脉血并检测其血糖指标:空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)，肾功能指标:血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白(ALB);并采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测五组大鼠血清炎症因子:白介素1(IL1)、肿瘤坏死因子(TNF)水平;同时，采用 Western blot 法检测各组大鼠肾组织 TL4 和 NFBp65 蛋白表达情况。结果:与 E 组相比，A、B、C、D 组血糖和肾功能指标明显上升(P005)，与 D 组相比，A、B、C 组血糖和肾功能指标下降(P005)，且 A、B 组下降幅度高于 C 组(P005)，A 组下降幅度高于 B 组(P005)。与 E 组相比，A、B、C、D 组血清炎症因子水平和 TL4、NFB 蛋白表达量更高(P005)，与 D 组相比，A、B、C 组血清炎症因子水平和 TL4、NFB 蛋白表达量更低(P005)，且 A、B 组低于 C 组(P005)，A 组低于 B 组(P005)。结论:西格列汀和格列齐特均可以通过下调 TL4/NFB 信号通路的蛋白表达，抑制糖尿病大鼠的炎症反应，改善其肾功能，且两者联合治疗的效果更佳。关键词:TL4/NFB 信号通路;西格列汀;糖尿病;肾功能中图分类号:5871文献标识码:A文章编号:10062882(2023)0357405DOI:1014035/jcnkihljyy202303024Effect of Sitagliptin and Gliclaide on enal Function in Diabetic ats Basedon TL4/NFB Signaling PathwayZhang Weicun，et alThe Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine(Guangzhou Guangdong 510000)(内文见下页)7冯玥，胡仲琳，刘伟才三维虚拟牙科患者的建立对前牙美学修复效果的影响研究 J口腔医学，2022，42(10):905910 8欠洪波，高荣纳米复合树脂在前牙牙体缺损修复中的美学及牙周状况评价J 中国美容医学，2022，31(4):133136 9陈小贤，钟洁，闫文娟，等树脂冠修复乳前牙的临床效果评价J 北京大学学报(医学版)，2020，52(5):907912 10韩雨亭，吴燕茹应用龈壁提升术修复牙体缺损的研究进展J国际口腔医学杂志，2019，46(3):349355 11陈小贤，钟洁，闫文娟，等树脂冠修复乳前牙的临床效果评价J 北京大学学报(医学版)，2020，52(5):907912 12赵小玲透明预成冠加树脂在乳前牙美容修复中的疗效分析 J 中国美容医学，2017，26(5):5859，81 13梁扬师，宁海燕，梁斌纳米树脂联合玻璃离子夹层技术修复牙颈部楔状缺损的效果J 临床口腔医学杂志，2020，36(6):352356 14马雪婷，吕长海，刘波全麻下透明冠结合纤维桩修复儿童乳上前牙残冠临床分析J 中国美容医学，2022，31(9):126129收稿日期:20230301475黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 2023基金项目:广州中医药大学第三附属医院科研创新基金项目(项目编号:Sy2021003)Abstract Objective:To investigate the effects of sitagliptin and gliclaide on renal function in diabetic rats based on tolllike re-ceptor 4(TL4)/nuclear factorB(NFB)signaling pathway Methods:40 rats were randomly divided into 5 groups with 8 ratsin each group Group A，B，C and D adopted conventional methods to establish the diabetes model，group E as a blank control groupOn the second day after the success of the model，group A was given sitagliptin+Gliclazide sustainedrelease tablets intragastric ad-ministration，group B was given sitagliptin intragastric administration，group C was given Gliclazide sustained release tabletsintragastric administration，group D，as the model group，and group E were given equal doses of normal saline intragastric administra-tion After the last administration，tail venous blood of the five groups were collected and blood glucose indexes including fasting bloodglucose(FPG)and glycocated hemoglobin(HbA1c)were detected enal function indexes included serum creatinine(Scr)，urea ni-trogen(BUN)and urinary microalbumin(ALB)The levels of serum inflammatory factors including interleukin1(IL1)andtumor necrosis factor(TNF)were detected by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)Meanwhile，Western blot was usedto detect the expression of TL4 and NFBp65 protein in kidney tissue of each group esults:Compared with group E，blood glucoseand kidney function indexes of group A，B，C and D were significantly increased(P005)，and compared with group D，blood glucoseand kidney function indexes of groups A，B and C were decreased(P005)，and the decreasing range of groups A and B was higherthan that of group C(P005)，and the decreasing range of group A was higher than that of group B(P005)Compared with groupE，the serum inflammatory factor levels and TL4，NFB protein expression levels in group A，B，C and D were higher(P005)，theserum inflammatory factor levels and TL4，NFB protein expression levels in groups A，B and C were lower than those in group C(P005)，and the serum inflammatory factor levels in groups A and B were lower than those in group C(P005)Group A was low-er than group B(P005)Conclusions:Both sitagliptin and gliclazide can inhibit inflammatory response and improve renal functionin diabetic rats by downregulating the protein expression of TL4/NFB signaling pathway，and the combined treatment effect ofboth is betterKey words:TL4/NFB Signaling Pathway;Sitagliptin;Diabetes Mellitus;enal Function作为临床常见慢性疾病，糖尿病目前尚未有有效的治疗方法，一旦患病需终身用药进行控制，且易造成诸多并发症，既影响患者健康，又需要承担巨大的经济负担，其中以糖尿病肾病造成的经济负担尤为显著1。糖尿病肾病的发病机制复杂，但炎症反应在其中发挥了关键作用。研究2 显示，持续的高血糖可以刺激并激活多种免疫炎症信号通路，进而促使细胞分泌炎症因子，使机体出现免疫炎症反应，最终引发糖尿病肾病，而 Toll 样受体 4(TL4)/核因子B(NFB)信号通路就是其中介导免疫炎症反应的关键信号通路。因此，有学者认为可以通过调控 TL4/NFB 信号通路防治糖尿病肾病。已有研究3 发现抑制 TL4/NFB 信号通路激活可以减轻高糖诱导的肾组织氧化应激、炎症、细胞外基质积累和系膜细胞增殖，进而控制糖尿病肾病病情进展。西格列汀和格列齐特都是临床常用的降糖药物，两者不仅可以促进胰岛素分泌，还可以使肾获益。而且研究4 证实西格列汀可以抑制 NFB 相关信号通路的过度活化。但两者联用是否有助于提升长期控糖质量，减缓糖尿病肾病的发生和发展尚未有报道。为此本研究 TL4/NFB 信号通路探讨西格列汀与格列齐特联用对糖尿病大鼠肾功能的影响，现报道如下。1资料与方法11材料111动物材料SPF 级雄性 SpragueDawley(SD)大鼠 40只，78 周龄，体质量 180220g，购自解放军总医院实验动物中心，动物许可证号:SCXK(军)20110034;饲养于本院动物中心，动物房温度(24 50 2 00)，湿度(59 50 1000)%，12h/12h 明暗交替循环照明，摄食饮水自由，通风良好。高脂高糖饲料(由 55%基础饲料、33%猪油、10%绵白糖和 2%蛋黄粉组成)、普通饲料(购自上海代轩生物科技有限公司)。112药品磷酸西格列汀片:生产厂家:Organon Pharma(UK)Limited(杭州默沙东制药有限公司分装)，批准文号:国药准字 J20140095;格列齐特缓释片:生产厂家:施维雅(天津)制药有限公司，批准文号:国药准字 H20044694;链脲佐菌素(STZ):生产厂家:Sigma 公司，货号:S01305G。113试剂与仪器白介素1(IL1)、肿瘤坏死因子(TNF)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒:购自上海酶联生物科技有限公司;兔源 TL4 一抗、兔源 PCNA 一抗、兔源NFB p65 一抗、兔源 GAPDH 一抗、养抗兔二抗:购自杭州联科生物技术股份有限公司;台式高速低温离心机:购自盐城市安信实验仪器有限公司;Varioskan LUX 多功能酶标仪:购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;EKF Biosen C_line 血糖仪:购自上海迪奥生物科技有限公司;博科 BK200 全自动生化分析仪:购自山东干司科学仪器有限公司。575黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 202312方法121动物模型建立及分组给药40 只 SD 大鼠购入后，先适应性喂养 1 周，再随机分为空白对照组(E 组，n=8)和造模组(n=32)，造模组大鼠进行 8 周高脂高糖饲料喂养，一次性腹腔注射 30mg/kg STZ，空白对照组予以等量生理盐水注射。72h 后取大鼠尾静脉血并检测其血糖，空腹血糖(FPG)167mmol/L 连续出现 3 次，则可确定为糖尿病大鼠，32 只大鼠均造模成功。随机将 32 只大鼠分为模型组(D 组，n=8)和用药组(n=24)，用药组在造模成功后第二天分别予以80mg/kg/天格列齐特缓释片+100mg/kg/天生理盐水灌胃(C组，n=8)、100mg/kg/天西格列汀+80mg/kg/天生理盐水灌胃(B 组，n=8)，100mg/kg/天西格列汀+80mg/kg/天格列齐特缓释片灌胃(A 组，n=8)，D 组和 E 组均予以 180mg/kg/天生理盐水灌胃。连续灌胃用药 8 周。122标本收集末次给药后各组大鼠先禁食不禁水 12h，收集大鼠 24h 尿液;后麻醉大鼠用注射器抽取其 4mL 尾静脉血;然后开腹取出大鼠肾脏，取其 05g 肾组织，剪碎后匀浆，并按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书步骤提取胞浆蛋白和核内蛋白，存于80的冰箱中待测。123指标检测将收集的 24h 尿液用放免法测定其尿微量白蛋白;抽取的尾静脉血 1mL 用血糖仪测量其空腹血糖(FPG)水平，剩余血液在 4下，3000r/min 离心 15min 分离血清，并取其 500L 用全自动生化分析检测其血清肌酐(Scr)血尿素氮(BUN)水平，剩余血清用 ELISA 法测量其炎症因子:IL1、TNF 水平，ELISA 法检测步骤严格按照试剂盒说明书进行;蛋白样品液解冻后按试剂盒说明书，以BCA 法测定其蛋白总浓度后，100 煮沸 5min，待蛋白变性后，各组分别取含 20g 总蛋白的样品液加入 SDSPAGE 凝胶中，电泳后湿转，并将分离蛋白转移到硝酸纤维膜上，再以5%脱脂牛奶溶液室温封闭处理 2h，剪下目的蛋白分别用兔源 TL4、NFKB p65、GAPDH、PCNA 一抗溶液孵育，在 4下过夜后以 TBST 溶液漂洗，以羊抗兔二抗溶液室温孵育，2h 后以 TBST 溶液漂洗，滴加 ECL 显色液，使蛋白条带显影，之后用凝胶成像分析仪拍照并通过 ImageJ 软件分析条带灰度值，得出各组目的蛋白相对表达。13统计学处理使用 SPSS210 进行分析，计量资料以(xs)表示，采用 t检验;计数资料以 n(%)表示，采用 x2检验;P005 为差异具有统计学意义。2结果21一般情况观察随机分组后，进行造模前，五组大鼠的基数资料无明显差异(P005)，见表 1。造模成功后，除 E 组大鼠饮食正常、体重增加、尿量正常，精神状态良好，毛发光泽柔顺外，其余四组均有不同程度的精神倦怠，嗜卧少动，毛发干枯黯淡，逐渐出现多饮、多食、多尿症状。进行灌胃干预后，E 组大鼠情况一切正常，A、B、C 组大鼠情况有所改善，反应比造模后灵敏，毛发稍有光泽，进食量和饮水量低于 E 组，其中 A 组大鼠情况改善最为明显，D 组大鼠相较其他四组较为虚弱，精神萎靡，毛发枯燥。表 1分组时两组小鼠基数资料(xs)组别n体重(g)24h 进食量(g/天)24h 饮水量(mL/天)随机血糖(mmol/L)A 组82097669026730471787101627013B 组82103466626630501765092630010C 组82098868727030521743089628012D 组82096965426840481759100626014E 组82102767127050551754090625011F 值002106024020P 值100003910915093522五组血糖及肾功能指标与 E 组相比，A、B、C、D 组血糖和肾功能指标明显上升(P005)，与 D 组相比，A、B、C 组血糖和肾功能指标下降(P005)，且 A、B 组下降幅度高于 C 组(P005)，A 组下降幅度高于 B 组(P005)，见表 2。表 2五组血糖及肾功能指标比较(xs)组别n血糖指标肾功能指标FPG(mmol/L)HbA1c(%)Scr(mol/L)BUN(mmol/L)ALB(g/mL)A 组81208121abcd1209185abcd2393159abcd470040abcd2144161abcdB 组81465202abc1404190abc296638abc530043abc2512285abcC 组81758275ab1625170ab3409412ab618063ab2844326abD 组82345376a1867165a4437458a840082a3513369aE 组848106854907020271684040331144161F 值68347655611975068220P 值00010001000100010001注:与 E 组同期比较，aP005;与 D 组同期比较，bP005;与 C 组同期比较，cP005;与 B 组同期比较，dP00523五组血清炎症因子和 TL4/NFB 蛋白表达与 E 组相比，A、B、C、D 组血清炎症因子水平和 TL4、NFB 蛋白表达量更高(P005)，与 D 组相比，A、B、C 组血清炎症因子水平和 TL4、NFB 蛋白表达量更低(P675黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 2023005)，且 A、B 组低于 C 组(P005)，A 组低于 B 组(P005)。见表 3、图 1。表 3五组血清炎症因子和 TL4、NFB 蛋白表达比较(xs)组别n血清炎症因子TL4/NFB蛋白表达IL1(pg/mL)TNF(pg/mL)TL4NFBp65A 组8288007abcd3196105abcd029010abcd029008abcdB 组8299010abc3333087abc042012abc052010abcC 组8313013ab3442103ab061013ab070012abD 组8337009a3585102a095014a103022aE 组82710112927101015010013006F 值4829506754495997P 值0001000100010001注:与 E 组同期比较，aP005;与 D 组同期比较，bP005;与 C 组同期比较，cP005;与 B 组同期比较，dP005图 1五组大鼠肾组织 TL4/NFB 信号通路相关蛋白表达的 Western biot 检测结果注:1 为 E 组检测结果;2 为 D 组检测结果;3 为 C 组检测结果;4 为 B 组检测结果;5 为 A 组检测结果3讨论数据5 显示，2003 年北京市血透患者中糖尿病肾病患者占 102%，直至 2011 年已超过 351%。由此可见，糖尿病肾病给我国人民生命财产健康安全造成了巨大的危险。所以控制血糖水平，预防糖尿病并发症的发生非常重要。西格列汀是近年获得良好临床效果的降糖药物，属于二肽基肽酶抑制剂的一种，其不仅可以安全有效地降低血糖，还可以通过改善肾脏血管内皮细胞功能，抑制单核巨噬细胞激活等改善肾功能67。除西格列汀外，降糖药格列齐特也被证实可以给糖尿病肾病患者带来肾获益。因为其化学结构中独特的氮杂环结构能与活性自由基活性氧簇的电子结合引发构象变化，激发抗氧化应激功效，改善血管内皮功能，保护肾脏。而且格列齐特还可以同时抑制机体微炎症反应，降低微量白蛋白尿的风险，进而使肾获益8。但该药单药治疗容易产生耐药性，影响治疗效果，所以相关共识多推荐长期治疗需采用联合用药9。虽然西格列汀和格列齐特都具有降糖作用，又都可以带来肾获益，但目前尚未有两者联用是否能提升长期控糖质量，缓解糖尿病肾病的相关报道。为此本研究采用动物试验探究了西格列汀和格列齐特联用的降糖效果和对肾脏功能的影响，结果显示，与 E 组相比，A、B、C、D 组血糖和肾功能指标明显上升(P005)，与 D 组相比，A、B、C 组血糖和肾功能指标下降(P005)，且 A、B 组下降幅度高于 C 组(P005)，A 组下降幅度高于 B 组(P005)。而且观察五组大鼠的一般情况可以发现造模前无明显差异的大鼠(P005);造模成功后，除 E 组大鼠外，其余四组均有不同程度的精神倦怠，嗜卧少动，毛发干枯黯淡，逐渐出现多饮、多食、多尿症状。进行灌胃干预后，E 组大鼠情况一切正常，A、B、C 组大鼠情况有所改善，反应比造模后灵敏，毛发稍有光泽，进食量和饮水量低于 E 组，其中 A 组大鼠情况改善最为明显，D 组大鼠相较其他四组较为虚弱，精神萎靡，毛发枯燥。由此可以看出西格列汀和格列齐特均有降糖和改善肾功能的作用，且两者联合用药的效果明显优于单一用药。虽然糖尿病肾病的发生、发展的机制尚未明确，但研究显示炎症反应在发生、发展中发挥了重要作用10。其中TL4/NFKB 信号通路作为机体炎症细胞浸润、炎症介质释放等过程的重要调控通路，也在糖尿病肾病的发生和发展中起到了重要11。已有研究12 显示，西格列汀可以通过下调TL4/NFKB 通路的蛋白表达，减轻的非肥胖糖尿病小鼠的胰岛炎症细胞浸润程度，增加血清胰岛水平。为进一步探究西格列汀和格列齐特联用是否有助于防治糖尿病肾病，本研究通过动物试验比较了不同治疗方案下大鼠炎症因子及TL4/NFKB 信号相关蛋白表达，结果显示，与 E 组相比，A、B、C、D 组血清炎症因子水平和 TL4、NFB 蛋白表达量更高(P005)，与 D 组相比，A、B、C 组血清炎症因子水平和TL4、NFB 蛋白表达量更低(P005)，且 A、B 组低于 C组(P005)，A 组低于 B 组(P005)。由此看出西格列汀和格列齐特治疗可以降低糖尿病大鼠的炎症因子水平和TL4、NFB 蛋白表达，且联合用药效果高于单一用药，提示西格列汀和格列齐特可以通过下调糖尿病大鼠的 TL4/NFB 信号通路的蛋白表达，抑制其炎症反应，且联合应用效果更好。综上所述，西格列汀和格列齐特均可以通过下调 TL4/NFB 信号通路的蛋白表达，抑制糖尿病大鼠的炎症反应，改善其肾功能，且两者联合治疗的效果更佳。参考文献 1董文兰，娄青林，吴蕾，等社区 2 型糖尿病患者直接经济负担及其相关因素分析J中国公共卫生，2019，35(11):14571460775黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 2023SMI 评估颈动脉斑块新生血管及其与脑梗死之间的关系陈维林，陈思铭，欧思敏，梁文燕，娄勍，陈小宇肇庆市中医院 功能科(广东肇庆 526020)摘要目的:探讨超微血管成像技术(SMI)在颈动脉斑块新生血管评估中的应用效果及其与脑梗死之间的关系。方法:选取 2021 年 7 月2022 年 6 月本院收治的疑似脑梗死患者 100 例，根据患者入院临床表现及影像学检查结果分为脑梗死组(n=68)与非脑梗死组(n=32)。记录两组患者一般资料、颈动脉 SMI 及超声血管造影技术(CEUS)检查结果并进行统计分析。结果:100 例疑似脑梗死患者共 272 个颈动脉斑块，经 SMI 检查新生血管显示率 6103%(166/272)，CEUS 检查为6765%(184/272)，两者无统计学差异(x2=2596，P=0107)，且 SMI 与 CEUS 检查新生血管分级情况之间也无显著差异(x2=6766，P=0080)。经多因素 Logistic 回归分析表明年龄60 岁、吸烟史、合并高血压、合并糖尿病、合并高血脂、斑块内新生血管形成以及 SMI 血流评分2 分均为脑梗死发生的独立危险因素(P005)。结论:SMI 用于评估颈动脉斑块新生血管便捷、可靠，且年龄60 岁、吸烟史、合并高血压、合并糖尿病、合并高血脂、斑块内新生血管形成以及 SMI 血流评分2 分均为脑梗死发生的高危因素，应予以关注。关键词:SMI;颈动脉斑块;新生血管;脑梗死中图分类号:74333文献标识码:A文章编号:10062882(2023)0357804DOI:1014035/jcnkihljyy202303025Evaluation of Carotid Plaque Neovascularization by SMI and Its elationshipwith Cerebral InfarctionChen Weilin，et alFunctional Department of Zhaoqing Traditional Chinese Medicine Hospital(Zhaoqing Guangdong 526020)(内文见下页)2张文静，徐新禹基于 TL4/NFB 信号通路探讨绿原酸对糖尿病肾病大鼠肾组织炎症和凋亡的影响J现代中西医结合杂志，2022，31(19):26292635 3Wu L，Du L，Ju Q，et al Silencing TL4/MyD88/NF BSignaling Pathway Alleviated Inflammation of Corneal EpithelialCells Infected by ISE J Inflammation，2021，44(2):633644 4王征，伍成文，陈豪，等 二肽基肽酶抑制剂通过激活EK1/2 和 NFB 信号通路促进 2 型糖尿病小鼠主动脉血管钙化J转化医学杂志，2019，8(3):144148 5纪立农，陆菊明，郭立新，等格列齐特缓释片临床应用快速指导建议J中国糖尿病杂志，2018，26(12):969973 6伍逢颜二甲双胍与西格列汀在 2 型糖尿病治疗中的应用疗效及对血糖波动、心理状态的影响分析J齐齐哈尔医学院学报，2022，43(13):12161220 7曹参，李靖，成水芹，等磷酸西格列汀联合氯沙坦钾对糖尿病肾病患者炎症因子，纤维化指标及血管内皮因子的影响J中国现代医学杂志，2020，30(3):3237 8马博，王晶，任丽君格列齐特联合舒洛地特对糖尿病肾病患者血管内皮舒张功能的影响 J 医学临床研究，2018，35(4):778780 9中华医学会内分泌学分会中国成人 2 型糖尿病口服降糖药联合治疗专家共识J 中华内分泌代谢杂志，2019，35(3):190199 10Deshmukh H，Prabhakar S Experimental Diabetic Nephropathyis Associated with Increased Expression of Inflammatory Proteinsin the KidneyJ The FASEB Journal，2020，34(1):11 11Cai S，J C hen，Li Y Dioscin protects against diabetic nephropa-thy by inhibiting renal inflammation through TL4/NFB path-way in mice J Immunobiology，2020，225(3):151941151946 12谢云亮，李万根，赵云娟西格列汀对 NOD 小鼠胰岛炎及TL4/NFB 信号通路的影响J 实用医学杂志，2017，33(20):33793383收稿日期:20230424875黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 2023