基于网络药理学的雷公藤抗肾纤维化作用及实验验证_刘馨月.pdf

基金项目:山西省卫生健康委员会青年项目(2023121)作者简介:刘馨月，女，1998 03 生，在读硕士，E-mail:liuxyue1163 com收稿日期:2022 11 22基于网络药理学的雷公藤抗肾纤维化作用及实验验证刘馨月1，田杰2，李赟2，周雪娇2，李维鹏1，李贤霖1，郑晓俊2*(1山西医科大学药学院，太原030001;2山西医科大学第一医院药剂科;*通讯作者，E-mail:zhengxiaojun0525163 com)摘要:目的运用网络药理学探究雷公藤中药缓解肾纤维化(renal fibrosis，F)的核心成分及相关信号通路，并进一步针对肾纤维化关键信号通路之一 Wnt 信号通路进行细胞实验验证。方法运用网络药理学筛选雷公藤核心成分的潜在靶点，构建“雷公藤核心成分 潜在靶点”及蛋白质互作网络分析图，进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG)通路富集分析。将不同浓度的山柰酚(0，5，10，15，20 mol/L)、谷甾醇(0，5，10，15，20 mol/L)、雷公藤甲素(0，5，10，15，20 nmol/L)作用于人肾小管上皮细胞(human embryonic kidney epithelial cells，HKC)，通过 CCK-8 实验检测存活率，存活率最高的药物浓度作为后续实验的给药浓度。蛋白免疫印迹法及 q-PC 检测空白组、山柰酚组、谷甾醇组、雷公藤甲素组磷脂酶 D1(phospholipase D1，PLD-1)表达水平，筛选影响 Wnt 通路的核心成分。进一步将细胞分组:对照组、雷公藤甲素组、TGF-组、TGF-+雷公藤甲素组，观察各组细胞形态改变，蛋白免疫印迹法及 q-PC 法检测各组细胞 平滑肌肌动蛋白(-SMA)表达水平。结果网络药理学表明雷公藤通过 WNT/-catenin 信号通路发挥抗肾纤维化作用，主要核心成分为山柰酚、谷甾醇、雷公藤甲素。CCK-8 实验结果显示，与 0 mol/L 相比，山柰酚浓度15 mol/L 时，HKC 细胞存活率降低(P0 01);谷甾醇浓度15 mol/L 时，HKC 细胞存活率降低(P0 01);雷公藤甲素浓度10 nmol/L 时，HKC细胞存活率降低(P0 01)。故选择山柰酚 10 mol/L、谷甾醇 10 mol/L 和雷公藤甲素 5 nmol/进行后续实验研究。与空白组相比，雷公藤甲素组 PLD-1 蛋白及 mNA 表达量明显降低(P 0 01)，山柰酚组及 谷甾醇组 PLD-1 蛋白及 mNA表达量差异均无统计学意义(P0 05)。细胞形态学结果表明，与对照组相比，TGF-组梭形转化增多(P 0 01);与 TGF-组相比，TGF-+雷公藤甲素组梭形转化减少(P 0 01)。与对照组相比，TGF-组-SMA 蛋白及 mNA 表达升高(P 0 01);与 TGF-组相比，TGF-+雷公藤甲素组-SMA 蛋白及 mNA 表达明显降低(P0 01)。结论雷公藤中雷公藤甲素可以通过抑制 PLD-1 表达，调节 WNT/-catenin 信号通路发挥抗肾纤维化。关键词:雷公藤;肾纤维化;WNT/-catenin 信号通路;网络药理学;雷公藤甲素中图分类号:285文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0535 09DOI:1013753/j issn1007 6611202304018Mechanism of Tripterygium wilfordii in treatment of renal fibrosis based on network pharmacology and experimental verificationLIU Xinyue1，TIAN Jie2，LI Yun2，ZHOU Xuejiao2，LI Weipeng1，LI Xianlin1，ZHENG Xiaojun2*(1School of Pharmacy，ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China;2Department of Pharmacy，First Hospital of Shanxi Medical University;*Correspondingauthor，E-mail:zhengxiaojun0525163 com)Abstract:ObjectiveTo investigate the core components and related signalling pathways of Tripterygium wilfordii in improvement ofrenal fibrosis(F)using network pharmacology，and further validate the Wnt signalling pathway，one of the key signalling pathways inrenal fibrosis in cellular experimentsMethodsThe database was used to screen the potential targets of core components of Tripterygiumwilfordii“Core components of Tripterygium wilfordii-potential target”network analysis and PPI network were constructed Kyoto ency-clopedia of genes and genomes(KEGG)pathway was used to complete enrichment analysis Human embryonic kidney epithelial cells(HKC)were respectively treated with different concentrations of kaempferol(0，5，10，15，20 mol/L)，-sitosterol(0，5，10，15，20 mol/L)and triptolide(0，5，10，15，20 nmol/L)to screen the drug concentration with the highest survival rate for subsequentexperiments The expression levels of phospholipase D1(PLD-1)were detected in blank group，kaempferol group，-sitosterol geoupand triptolide group by Western blot test and q-PC to screen the core components affecting the Wnt pathway Cells were further dividedinto control group，triptolide group，TGF-group，and TGF-+triptolide group Morphological changes of cells in each group wereobserved The expression level of-smooth muscle actin(-SMA)was detected by Western blotting and q-PCesultsNetworkpharmacology showed that Tripterygium wilfordii exerted anti-renal fibrosis effect through Wnt/-catenin signaling pathway，and themain core components of Tripterygium wilfordi were kaempferol，-sitosterol and triptolide CCK-8 assay showed that compared with0 mol/L，HKC cell survival was reduced at kaempferol concentration 15 mol/L(P 0 01)，-sitosterol concentration 15 mol/L535山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期(P0 01)，and triptolide concentration 10 nmol/L(P0 01)Therefore，10 mol/L kaempferol，10 mol/L-sitosterol and 5nmol/L triptolide were selected for the subsequent experimental study Compared with blank group，PLD-1 protein and mNA expres-sion levels in triptolide group were significantly decreased(P0 01)Compared with blank group，PLD-1 protein and mNA expres-sion levels in kaempferol group and-sitosterol group showed no statistical difference(P0 05)Cytomorphological results showed anincrease in spindle cell transformation in TGF-group compared to control group(P0 01)and a decrease in spindle cell transforma-tion in TGF-+triptolide group compared to TGF-group(P0 01)The-SMA protein and mNA expression levels were higher inTGF-group than in control group(P0 01)，but lower in TGF-+triptolide group than in TGF-group(P0 01)ConclusionTriptolide in Tripterygium wilfordii can regulate the WNT/-catenin signaling pathway to play an anti-renal fibrosis role by inhibitingthe expression of PLD-1Key words:Tripterygium wilfordii;renal fibrosis;WNT signaling pathway;network pharmacology;Triptolide肾纤维化(renal fibrosis，F)是以大量成纤维细胞及肌成纤维细胞增生、细胞外基质堆积而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化为特征的病理过程。肾纤维化是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)进行性肾功能衰竭的原因1，CKD 已成为影响人类健康较为常见的一种危害。2019 年断面调查我国成年人 CKD 总体患病率达 16 4%2。近年治疗 CKD 主要通过肾脏移植及透析治疗等，这给患者及家庭带来较大的经济负担。中医药可通过多靶点调控来缓解 F，具有现代医学不可替代的优势3。Wnt/-catenin 信号通路是肾纤维化调控机制中主要通路之一，激活 Wnt 通路会使-catenin 降解减少，并大量积聚入核，激活纤维化相关基因，导致肾纤维化的形成和发展4。中医药认为，F 属本虚标实、气虚血瘀，治疗宜补气扶正、活血化瘀5。雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根，神农本草经 记载其“味辛、入肝、脾二经，通十二经络”，其具有祛风通络、舒筋活血等功效。现代研究表明，雷公藤具有抗炎、免疫调节和抗肿瘤6 等功效。雷公藤及其相关制剂对肾脏有保护作用，包括减少蛋白尿、抑制肾纤维化和改善肾功能等，临床用于治疗糖尿病肾病7，8、慢性肾炎9、肾病综合征10，11 等多种肾脏疾病。简言之，雷公藤具有对抗肾纤维化的作用，但其作用机制尚不明确。基于雷公藤多靶点、多通路协同发挥药效作用的特点，本研究拟采用网络药理学和体外实验方法，探寻雷公藤治疗 F 的作用靶点和相关通路，进而阐明雷公藤药效的物质基础，揭示其防治肾纤维化的机制，为雷公藤的临床应用与研发提供新思路。1材料与方法1 1材料1 1 1数据库与分析软件TCMSP 数据库(http:/tcmspw com/tcmspsearch php)，TCMIP 数据库(http:/wwwmegabionetorg/tcmid)，GeneCards 数据库(https:/www genecards org)，UniProt 数据库(https:/wwwuniprot or-g)，OMIM 数据库(http:/omim org)，Dis-GeNET 数据库(https:/www disgenet org)，STING数据库(http:/string-db org/cgi/input pl)，Metas-cape 平 台(http:/metascape org/gp/index html)，Bioinformatics 平台(http:/www bioinformatics comcn)，Jvenn 平台(http:/jvenn toulouse inra fr/app/example html)，Cytoscape 3 9 1 软件，ImageJ 软件，GraphPad Prism 9 0 软件。1 1 2细胞株和药物及试剂人肾小管上皮细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，山柰酚、谷甾醇(上海麦克林生化科技股份有限公司)，雷公藤甲素(美国 MedChemexpress 公司)，胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司)，DMEM/F-12 培养基、PierceTMBCA 蛋白定量试剂盒(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)，细胞增殖与活性检测试剂盒(山西启点生物科技有限公司)，总 NA提取试剂 Trizol、逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒(日本 Takara 公司)，PC 引物(上海生工生物公司)，平滑肌肌动蛋白(-SMA)抗体、磷酸酯酶 1(PLD-1)抗体及 GAPDH 抗体(美国 CST 公司)，辣根过氧化物酶(HP)山羊抗兔抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)。1 1 3仪器SpectraMax ID3 多功能酶标仪(美国Molecular Devices 公司)，细胞培养箱(美国 ThermoFisher Scientific 公司)，ABI Step One 荧光定量 PC仪(美国 Applied Biosystems 公司)，倒置荧光显微镜(日本 Nikon 公司)，凝胶成像分析系统(美国 Bio-ad Laboratories 公司)。1 2方法1 2 1网络药理学雷公藤的化学成分信息来源635J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4于 TCMSP 和 TCMID 数据库，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)30%;药物相似性(druglikeness，DL)0 18 为筛选条件12，剔除没有相关信息的化学成分，确定核心成分，利用 Uniprot 数据库得到靶标蛋白对应的基因名称。采用 Cytoscape软件构建“雷公藤核心成分 潜在靶点”关系图，分析雷公藤核心成分及靶点的网络拓扑参数，判断雷公藤核心靶点及发挥药效的核心成分。通过 Gene-Cards、OMIM 和 DisGeNET 数据库对 F 疾病靶点进行汇总、去重后得到 F 疾病最终靶点。通过 Jvenn平台绘制雷公藤靶点与 F 靶点之间的韦恩图，整理交集基因。将交集基因导入 STING 数据库，限定物种为人，获取蛋白相互作用(PPI)关系，导入Cytoscape 软件使其可读性增强，明确 PPI 网络中的关键蛋白。在 Metascape 平台导入整理后的核心靶点，选定 Homo sapiens，进行 KEGG 通路富集分析。应用 Bioinformatics 平台将分析结果进行可视化。1 2 2细胞培养使用 HKC 细胞株，加入含 10%胎牛血清 F12 培养基，置于 37、5%CO2的培养箱中培养，0 25%胰酶对细胞传代培养，至细胞融合度达 70%以上进行实验。1 2 3核心成分干预浓度的筛选将 HKC 细胞以2 105个/孔接种于 96 孔板中，培养 24 h 后，分别给予不同浓度的山柰酚(0，5，10，15，20 mol/L)、谷甾醇(0，5，10，15，20 mol/L)、雷公藤甲素(0，5，10，15，20 nmol/L)干预细胞，处理 24 h，加入100 l 10%CCK-8 溶液，在 450 nm 下测定吸光度A，并计算细胞存活率，细胞存活率=(A实验孔ACCK 8孔)/(A空白孔 ACCK-8孔)100%，CCK-8 孔为含10%CCK-8 溶液未种细胞的孔，实验重复 6 次。1 2 4蛋白质印迹法筛选影响 PLD-1 蛋白表达成分取对数生长期的 HKC 细胞，用含 10%胎牛血清 F12 制成单细胞悬液，按每孔 2 105个细胞量，均匀的接种于 6 孔板中，培养 24 h，将 HKC 细胞分为:空白组、山柰酚组、谷甾醇组、雷公藤甲素组。空白组采用未加药的 HKC 细胞作为对照;山柰酚组加入10 mol/L 山柰酚干预24 h;谷甾醇组加入10 mol/L 谷甾醇干预24 h;雷公藤甲素组加入 5 nmol/L 雷公藤甲素干预 24 h。收集各组HKC 细胞，利用 IPA 细胞裂解液裂解得到总蛋白。采用 BCA 法测定总蛋白浓度，进行定量。10%SDS-PAGE 电泳分离，电转至 PVDF 膜，用 5%脱脂奶粉封闭 2 h。膜置于 PLD-1 一抗稀释液中，4 孵育过夜。洗涤后加入二抗，室温孵育2 h。洗涤后加入 ECL 超敏发光液曝光，ImageJ 软件进行统计分析，实验重复 3 次。1 2 5real-time qPC 法检测 PLD-1 mNA 表达按照12 4 中分组处理细胞，收集细胞。采用 Trizol法提取 NA，逆转录为 cDNA，进行荧光定量 PC 反应，反应体系:95 预变性 30 s;95 变性 5 s，60 退火30 s，95 延伸 15 s，反应重复 40 个循环，检测PLD-1 和 GAPDH 的基因表达。引物序列见表 1。表 1引物序列Table 1Primer sequences for T-qPC引物序列(5 3)PLD-1上游:GCTCCGCTCTGCTGCTGATTG下游:GCCTGCTGTTCTCTATCACATGGAC-SMA上游:CTTCGTTACTACTGCTGAGCGTGAG下游:CCCATCAGGCAACTCGTAACTCTTCGAPDH上游:CAGGAGGCATTGCTGATGAT下游:GAAGGCTGGGGCTCATTT1 2 6细胞模型建立及分组为探究雷公藤甲素对体外肾纤维化模型的影响，将 HKC 分为 4 组:对照组，给予完全培养基培养 48 h;雷公藤甲素组，传代24 h 后给予5 nmol/L 雷公藤甲素培养24 h;TGF-组，传代24 h 后给予 10 ng/ml 的 TGF-13 培养24 h;TGF-+雷公藤甲素组，传代24 h 后给予终浓度为 10 ng/ml 的 TGF-联合 5 nmol/L 雷公藤甲素混匀后处理 24 h。观察细胞形态，采用蛋白质印迹法和 real-time qPC 法检测-SMA 蛋白和基因水平表达。1 2 7细胞形态学的观察根据 1 2 6 所述分组进行细胞处理，用倒置显微镜观察细胞形态变化，实验重复 6 次，并运用 ImageJ 软件进行计数分析。1 2 8蛋白质印迹法及 real-time qPC 法检测-SMA 蛋白和 mNA 表达将细胞接种于 6 孔板，根据 1 2 6 分组处理细胞，按照 1 2 4 所述方法检测-SMA 蛋白表达，运用 ImageJ 软件进行统计分析，实验重复 3 次。按照 1 2 5 所述方法检测-SMAmNA 表达，实验重复 3 次，以 GAPDH 为内参，采用 2 Ct法分析基因表达量。1 3统计学分析采用 GraphPad Prism9 0 软件对数据进行统计分析，先进行方差齐性检验、正态性检验，符合正态分布的资料多组均值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 法。检验水准取 =0 05。735山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期2结果2 1网络药理学分析表明雷公藤具抗肾纤维化的功能2 1 1药物核心成分 潜在靶点网络分析TCM-SP 和 TCMID 数据库筛选后得到雷公藤的核心化合物共 27 个，获得 133 个相关靶点，利用 Cytoscape 软件构建雷公藤核心成分 潜在靶点网络分析图(见图 1)。通过 Network Analysis 插件对网络拓扑特征分析可知，本研究度值居前 3 位的核心成分分别为山柰酚(kaempferol)、谷甾醇(beta-sitosterol)和雷公藤甲素(triptolide)。蓝色三角形图标为雷公藤核心成分，黄色菱形图标为潜在作用靶点图 1雷公藤核心成分 潜在靶点网络分析图Figure 1Core components of Tripterygium wilfordii-potential target network analysis2 1 2肾纤维化疾病靶点及雷公藤抗纤维化的潜在靶点分析通过 GeneCards、OMIM、DisGeNET 数据库筛选 F 疾病靶点，去重后得到 3 002 个，与雷公藤核心成分的潜在作用靶点进行匹配映射，并绘制维恩图，共获得 76 个共同靶点，进一步确定了雷公藤与肾纤维化的靶向作用关系，结果见图 2。2 1 3PPI 分析在 STING 数据库导入 76 个交集靶点，设置 confidence 0 4，获得各靶点之间的互作关系，得到 PPI 网络关系信息，并导入 Cytoscape对蛋白网络进行可视化分析，构建 PPI 网络图，结果见图3。由 PPI 网络图可见，共包括76 种蛋白，它们之间形成了 707 个蛋白相互作用关系，节点大小及由绿变紫的程度与度值间呈正相关，度值越大，节点越大，则节点颜色也越深。图 2雷公藤潜在作用靶点 肾纤维化靶点维恩图Figure 2Venn diagram of potential targets of Tripterygiumwilfordii and targets of renal fibrosis21 4KEGG 富集分析应用 Metascape 数据平台对雷公藤调节 F 相关靶点进行信号通路分析，通835J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4过 KEGG 分析得到气泡图，结果见图 4。筛选排名靠前的 20 条信号通路，包括 WNT 信号通路、FOXO信号、VEGF 信号通路和 TNF 信号通路等多个细胞信号通路，来实现其抗肾间质纤维化的作用。结果分析提示，雷公藤可能是通过干预上述信号通路，进而实现其抗肾纤维化的功能。节点大小及由绿变紫的程度与度值相关，节点越大颜色越深;度值越大，为核心基因的可能性越大;节点之间的连线代表两个基因之间的相互关系，线条越深相关性越强图 3雷公藤抗肾纤维化 PPI 网络图Figure 3PPI network of Tripterygium wilfordii against renal fibrosis图 4雷公藤抗肾纤维化 KEGG 分析Figure 4KEGG analysis of Tripterygium wilfordii against renal fibrosis935山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期2 2不同浓度的核心成分对 HKC 细胞存活率的影响按照122，对山柰酚、谷甾醇、雷公藤甲素分别采用5 种浓度溶液处理 HKC 细胞并计算其存活率，结果见表 2。单因素方差分析结果表明，与0 mol/L组相比，15，20 mol/L 山柰酚作用后细胞存活率显著降低(F=37 76，P 0 01)。与0 mol/L相比，15，20 mol/L 谷甾醇作用后细胞存活率显著下降(F=11 54，P 0 01)。与0 nmol/L相比，10，15，20 nmol/L 雷公藤甲素作用后细胞存活率均显著下降(F=28 10，P 0 01)。故选定山柰酚浓度 10 mol/L、谷甾醇浓度 10 mol/L 和雷公藤甲素浓度 5 nmol/L 浓度展开实验。表 2三种核心成分干预对 HKC 细胞存活率的影响(?x s，n=6)Table 2Effect of three core components on HKC cell survival rate(?x s，n=6)山柰酚浓度细胞存活率(%)谷甾醇浓度细胞存活率(%)雷公藤甲素浓度细胞存活率(%)0 mol/L103 12 3 970 mol/L99 37 3 960 nmol/L100 00 2 985 mol/L101 48 2 825 mol/L96 09 3 365 nmol/L98 37 3 8510 mol/L100 48 3 3710 mol/L94 31 2 2010 nmol/L89 88 3 59 15 mol/L94 04 1 77 15 mol/L89 76 3 12 15 nmol/L86 69 2 62 20 mol/L85 79 1 51 20 mol/L88 11 3 69 20 nmol/L83 73 3 37 与未加药比较，P0 012 3核心成分对 HKC 细胞 PLD-1 蛋白和基因表达的影响不同蛋白印迹法实验结果分析知，与空白组相比，雷公藤甲素组 PLD-1 表达量明显降低(P 0 01)，而山柰酚组和 谷甾醇组差异无统计学意义(P 0 05，见图 5)。与空白组比较，山柰酚组和 谷甾醇组 PLD-1 蛋白及基因表达，尚未发现差异有统计学意义(P 0 05)，表明山柰酚和 谷甾醇对 Wnt通路中的 PLD-1 无影响;而雷公藤甲素组 PLD-1 蛋白及基因表达降低(P 0 01)，表明其通过调节PLD-1 影响 Wnt 通路。由此可筛选出雷公藤甲素为降低 PLD-1 蛋白和基因表达的雷公藤核心成分。与空白组比较，P0 01图 5三种核心成分对 PLD-1 蛋白及 mNA 表达的影响Figure 5Effect of three core components on PLD-1 protein and mNA expression2 4TGF-+雷公藤甲素可抗 TGF-诱导的 HKC向纤维化转化由细胞形态图可知，与对照组相比，TGF-组细胞向梭形形态转化增多(P 0 01)，并且生长缓慢。与 TGF-组相比，TGF-+雷公藤甲素组细胞向梭形形态转化减少(P 0 01，见图 6)。由此可见，TGF-+雷公藤甲素具有抗 TGF-诱导的 HKC 向纤维化转化，维持肾小管上皮形态特征的作用。2 5雷公藤甲素可抑制 TGF-诱导的 HKC 细胞中-SMA 蛋白和基因表达蛋白质印迹及 real-time qPC 分析结果表明，与对照组相比，TGF-组-SMA 蛋白及 mNA 表达水平明显升高(P 0 01)，说明肾纤维化模型造模成功;与对照组相比，雷公藤甲素组-SMA 蛋白及mNA 表达水平差异无统计学意义(P 0 05，见图7)，提示雷公藤甲素本身对正常细胞的肾纤维化无045J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4影响。与 TGF-组相比，TGF-+雷公藤甲素组-SMA 蛋白及 mNA 表达水平显著降低(P 0 01，见图 7)，提示雷公藤甲素可缓解肾纤维化的进展。图 6雷公藤甲素对 HKC 细胞形态学改变的影响(倒置显微镜，100)Figure 6Effect of Triptolide on morphological changes in HKC cells(inverted microscope，100)与对照组比较，P0 01;与 TGF-组比较，#P0 01图 7雷公藤甲素对-SMA 蛋白条带及 mNA 表达的影响Figure 7Effect of Triptolide on-SMA protein and mNA expression3讨论肾脏纤维化是进行性慢性肾脏疾病与肾损害常见的结果，慢性肾脏病的高发病率和高死亡率给社会和患者家庭带来了沉重的经济负担。由于肾纤维化发病机制复杂，临床尚未有针对肾纤维化的防治措施。如何有效减缓甚至治疗肾纤维化从而逆转慢性肾脏病病程进展成为当代医学研究的重要课题之一。根据中医理论湿热浊毒内蕴，瘀血内阻是导致肾脏纤维化的主因14，15。雷公藤具有清热解毒、祛风通络的作用，现代药理研究也发现雷公藤具有抗炎、止痛和免疫抑制等作用。与糖皮质激素有相似的治疗效应，雷公藤发挥缓解肾脏纤维化的作用。既往相关的网络药理学研究表明雷公藤具有缓解肾脏纤维化的作用。雷公藤甲素抑制细胞炎症因子释放，雷公藤红素可抑制肾脏基质金属蛋白酶抑制剂 1表达，共同发挥缓解纤维化的作用16;关于应用雷公藤多甙治疗肾脏纤维化的实验研究17，18，也均证实雷公藤对于肾脏纤维化有缓解作用。为进一步阐明雷公藤缓解肾纤维化的活性成分145山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期及其作用机制，本研究运用网络药理学方法，分析得出山柰酚、谷甾醇、雷公藤甲素是 3 个主要的核心成分，进而采用 Western blot 结合 qPC，在分子水平上证实了雷公藤甲素可以通过抑制 PLD-1表达，降低-SMA 的表达，抑制肾小管细胞 间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)过程，发挥缓解肾脏纤维化的作用。有研究表明肾小管细胞 EMT 在肾脏纤维化中起着关键作用，若能有效抑制 EMT 过程，或通过治疗使受损细胞向正常细胞逆转，即可被阻断肾脏纤维化进程19。经对损伤肾脏的微阵列分析也表明，Wnt 表达上调与上皮细胞对损伤的反应、肾小管细胞损伤、纤维胶原和免疫球蛋白转录物表达相关。而 Wnt 信号可阻断-catenin 的降解，允许其在胞质和核内积累，与 TCF 转录因子结合，并特异性激活Wnt 靶基因，诱导细胞纤维化20 24。TGF-和 Wnt通路可独立或协同调节纤维化基因。这些信号通路相互作用，共同控制纤维化的发生和发展。这些细胞内信号通路的交互，依赖于共同的转录辅助因子-catenin，-catenin 是一种保守的多功能蛋白，其特异性和活性取决于其特异性结合伙伴。连续的泛素化和降解使其在细胞质中保持在低水平 25。纤维形成信号通路都聚集在-catenin 上，-catenin/TCF复合物形成启动纤维化。因此，特异性阻断-catenin/TCF 复合物形成将可以有效缓解纤维化。相关的研究报道 PLD 是一类能够催化磷脂酰胆碱水解的酶，其中 PLD-1是 PLD 在哺乳动物的两种亚型之一，能正反馈调节 Wnt/-catenin 信号通路26，水解产生磷脂酸能够通过促进-catenin/TCF-4 转录复合物的形成，进一步活化 Wnt/-catenin 信号通路的相关基因 27。抑制 PLD-1活性可以有效地减少-catenin/TCF-4 转录复合物，这一结果已被 Kang 等28 的研究证实。本研究结果表明 TGF-+雷公藤甲素组与TGF-组相比-SMA 的表达降低，表明雷公藤甲素可以有效抑制 EMT 过程。此外，雷公藤甲素可以抑制 PLD-1在细胞内的表达，这与雷公藤甲素的相关研究结果一致29，30。因此，推断雷公藤甲素作为雷公藤的有效成分，干预肾小管上皮细胞可使 PLD-1表达下降，进而减少-catenin/TCF-4 转录复合物的形成，从而阻止肾小管上皮细胞纤维化的发生和发展。综上所述，雷公藤甲素可能通过降低人肾小管上皮细胞中 PLD-1 的表达，发挥抑制 EMT 过程的作用，进而缓解肾脏纤维化，为雷公藤甲素治疗肾脏纤维化提供了重要的实验基础，也可为雷公藤甲素缓解纤维化作用机制的研究提供新的思路。但是目前实验研究的研究对象仅停留在细胞层面，并不能完全模拟雷公藤甲素在体内的作用机制。我们的下一步，将以动物为模型，展开雷公藤甲素相关药理治疗研究。参考文献:1Djudjaj S，Boor P Cellular and molecular 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