鸡冠花活性成分的提取及其抑菌效果_苏包顺.pdf

第 51 卷第 2 期2023 年 1 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.2Jan.2023鸡冠花活性成分的提取及其抑菌效果苏包顺1,刘志彤2(1 大理市林韵生物科技开发有限责任公司;云南 大理 671099;2 巍山彝族回族自治县农业农村局园艺工作站;云南 大理 672400)摘 要:以鸡冠花为原料,采用回流提取法提取鸡冠花不同部位活性成分,采用其琼脂平板二倍稀释法进行体外抑菌活性实验,对不同活性成分进行热处理、紫外线照射研究其稳定性,统计抑菌物质的的最低抑菌浓度以及不同条件下的稳定性。结果表明,鸡冠花二氯化碳部位有较好的抑菌效果,在紫外照射的情况下,抑菌性的稳定性较好,但不宜长时间在高温环境中。关键词:鸡冠花;提取;抑菌作用;活性部位;稳定性中图分类号:TQ917 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)02-0123-03 第一作者:苏包顺(1980-),男,农艺师,主要从事中药种植及质量检测。通讯作者:刘志彤(1978-),男,高级农艺师,主要从事中药种植及质量检测。Extraction and Antibacterial Effect of Active Components from Celosia cristataSU Bao-shun1,LIU Zhi-tong2(1 Dali Linyun Biotechnology Development Co.,Ltd.,Yunnan Dali 671000;2 Horticultural Stationof Agriculture and Rural Bureau of Weishan Yi Hui Autonomous County,Yunnan Dali 671000,China)Abstract:Taking Celosia cristata as raw material,the active components of different parts of Celosia cristata wereextracted by reflux extraction method,and the in vitro antibacterial activity experiment was carried out by the doubledilution method on the agar plate,and the stability of different active components was studied by heat treatment andultraviolet irradiation,the minimum inhibitory concentration of antibacterial substances and their stability under otherconditions.The results showed that the carbon dichloride part of Celosia cristata had a better antibacterial effect,and theantibacterial stability was better under ultraviolet irradiation.Still,it should not be exposed to high temperatures for long.Key words:Celosia cristata L;extras;bacteriostatic effect;active site;stability抗生素及合成抗菌药物的发明与使用,是 20 世纪医药领域的一项重大成果。人类使用抗生素及合成抗菌药物有效地治愈了多种严重细菌感染性疾病,并有效地减少了多种严重细菌感染死亡率,继而引发了抗菌药物开发与广泛使用热潮。但随着世界人口增长、疾病谱改变、医疗水平提高等原因,抗生素使用日益增多,民众习惯于只要有头痛脑热、喉痒咳嗽等症状即自用抗菌药物,耐药菌株也随之增加,滥用或过度使用造成菌群失调已成为当今世界普遍面临的问题。在抗生素尚未被发现以前,我国依靠丰富的中药资源与病原微生物作斗争,应用传统中药治疗感染已有上千年历史,中草药种类繁多,不同药物有各自的特点,化学成分复杂多样,一方面通过中药中含有的抗菌物质作用于微生物,且副作用少、不易产生耐药性,另一方面从整体对人体进行调节,调动人体免疫系统杀死细菌。在这种情况下,对中药抗菌深入研究已经迫在眉睫,为今后进一步探讨中医药防治感染性疾病提供参考依据。鸡冠花,又名鸡髻花、芦花鸡冠、笔鸡冠、大鸡公花、鸡角根等,为苋科青葙属植物鸡冠花 Celosia cristata L.的干燥花序。鸡冠花原产于非洲和亚洲热带地区,现在我国南北各地均有栽培,广布于温暖地区,栽培供观赏,花和种子供药用。含有黄酮类、皂苷类、甾体、有机酸类、萜类等化合物1。中医认为,其性甘涩、无毒,归肝、大肠经。能收敛止血,止带,止痢2。研 究 表 明,鸡 冠 花 具 有 止 血3-5、镇 痛6、抗 衰老7、抗肿瘤8、抗阴道毛滴虫9、防治糖尿病10、防治动脉粥样硬化11、防治骨质疏松12-13、增强机体耐受力14、增强机体免疫力15等药理作用。临床可用于妇科慢性炎症、心绞痛、赤白带、热毒带下、痢疾、小儿消化不良等的治疗16-19。通过对文献查阅发现,目前对鸡冠花的研究主要集中在药理作用、生态研究、栽培管理等方面,对不同部位的抑菌效果研究尚未有相关报道。基于此,作者就鸡冠花的乙酸乙酯部位、正丁醇部位、二氯化碳部位、萃取后水部位 4 个部位的抑菌作用进行实验对比,为后续鸡冠花的开发利用提供实验依据。1 实 验1.1 仪器与材料1.1.1 实验仪器电子天平,奥豪斯仪器上海有限公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;中药真空提取浓缩机,天津三延精密机械有限公司;超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;双人单面124 广 州 化 工2023 年 1 月净化工作台,苏州净化设备厂;冷冻干燥机,宁波新芝冻干设备股份有限公司;生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司。1.1.2 材料与试剂鸡冠花,购自安徽亳州药材市场,经重庆三峡学院周浓老师鉴定为苋科青葙属植物鸡冠花 Celosia cristata L.的干燥花序。盐酸万古霉素(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,批号:20210326);氯霉素(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,批号:20200906);二氯化碳(云南汕滇药业有限公司,批号:20170612);乙酸乙酯(天津风船化学试剂科技有限公司,批号:090905);正丁醇(利安隆博华医药化学有限公司,批号:20131025);LB 培养基(广东环凯微生物科技有限公司,批号:1090641);BHI 培养基(广东环凯微生物科技有限公司,批号:1095901)。1.1.3 实验菌种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌,购买于北京莱耀生物科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 不同活性部位的制备(1)乙酸乙酯部位称取鸡冠花花序 250 g,剪成小块,以 60%乙醇室温浸泡后加热回流提取 3 次,第 1 次 8 倍量,第 2 次 6 倍量,第 3 次4 倍量,每次 2 h。将三次提取液合并,过滤,滤液减压回收溶剂后加适量蒸馏水超声混悬,转移至 2000 mL 分液漏斗中,加乙酸乙酯萃取至无色,减压回收得溶剂浓缩液,浓缩液进行冷冻干燥,得到乙酸乙酯部位 10 g,水层备用。(2)正丁醇部位取步骤 1 中剩余的水层液,加入正丁醇萃取至无色,减压回收得溶剂浓缩液,浓缩液进行冷冻干燥,得正丁醇部位提取物 25 g,剩余水层备用。(3)二氯化碳部位取步骤 2 中剩余的水层液,加入二氯化碳萃取至无色,减压回收得溶剂浓缩液,浓缩液进行冷冻干燥,得二氯化碳部位8 g,剩余水层备用。(4)萃取后水部位取步骤 3 中剩余的水层液,减压浓缩,浓缩液进行冷冻干燥,得萃取后水部位提取物 15 g。1.2.2 不同活性部位的体外抗菌活性用琼脂平板二倍稀释法20进行体外抑菌活性试验,分别测定鸡冠花乙酸乙酯部位、二氯化碳部位、正丁醇部位、萃取后水部位和对 3 株病原菌的体外抑菌活性。1.2.3 最小抑菌浓度测定将鸡冠花 4 个部位提取液(1000 mg/mL),用无菌水进行倍比稀释,分别为 1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6 和7.8 mg/mL 共8 个浓度。将上述不同浓度梯度的稀释液1 mL 和14 mL 分别加入一次性无菌培养皿中,充分混合,待培养基冷却凝固后备用。取 120 L 供试菌悬浮液均匀涂布于平板上。将培养皿倒扣放在培养箱中,37 培养 24 h。观察试验菌的生长情况,每组重复 3 次。挑取 3 株细菌适量菌体至液体培养基试管,转至振荡培养箱中,37,150 rpm,培养 1 h 后调整细菌溶液浓度至 1.5108CFU/mL。取 120 L 供试菌悬液加入不同浓度梯度的含药板和阳性对照板,均匀涂布,使用 DMSO 代替细菌溶液作为阴性对照,盐酸万古霉素为 MRSA 的阳性对照,氯霉素为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的阳性对照。将平板至于 4 冰箱中 4 h,再放入 37 恒温培养箱中培养,8 24 h 内进行观察拍照,并对含不同浓度梯度药物平板的抑菌圈进行统计,每组重复 3次。与阴性、阳性对照比较,培养皿中无细菌生长的最小质量浓度是试验部位对细菌的最小抑制质量浓度(MIC)。1.2.4 热处理对 4 个部位提取液抑菌稳定性的影响将 4 个部位提取液分别在 60、80、100 和 121 下依次处理 30 min,未经处理的提取液用作对照,分别进行 3 组抑菌试验以确定抑菌区的直径,计算平均值。1.2.5 紫外线照射对 4 个部位提取液抑菌稳定性的影响将 4 个部位提取液分别在紫外灯下照射 10、20、30、40 和50 min,未经处理的提取液用作对照,分别进行 3 组抑菌试验以确定抑菌区的直径,计算平均值。1.2.6 数据处理与分析采用 Microsoft Office 2010 和 Graphpad Prism 9.0 进行数据处理与分析。2 结果与讨论2.1 鸡冠花不同活性部位的体外抗菌活性使用牛津杯法研究了4 个部分的提取物对3 种细菌的抗菌作用,实验结果为:鸡冠花乙酸乙酯部位对 MRSA 有抑制作用,二氯化碳部位对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用,正丁醇部位、萃取后水部位对粪肠球菌有抑制作用。通过抑菌圈直径测量可知,乙酸乙酯部位对 MRSA 抑菌的抑菌圈直径为(22.50.5)mm;二氯化碳部位对 MRSA、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(25.90.2),(21.60.5)mm;正丁醇部位对粪肠球菌的抑菌圈直径为(23.10.3)mm;萃取后水部位对粪肠球菌的抑菌圈直径为(23.90.6)mm。因此,鸡冠花不同活性部位对革兰阳性菌具有良好抑菌效果。2.2 鸡冠花不同活性部位的最低抑菌浓度采用二倍稀释法,进行鸡冠花不同活性部位最低抑菌浓度试验,确定鸡冠花不同活性部位对 MRSA、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的最低抑菌浓度。结果如表 1 所示。表 1 4 个部位鸡冠花提取液的最低抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentrations ofCelosia cristata L.extract from 4 sites样品MIC/(mg/mL)MRSA金黄色葡萄球菌粪肠球菌鸡冠花乙酸乙酯层 31.2/31.2/31.2鸡冠花正丁醇层31.2/15.2/31.2鸡冠花二氯化碳层 15.2/15.2/31.2 31.2/62.5/31.2鸡冠花萃取后水层31.2/31.2/15.2 注:“”表示在试验最大浓度时,未表现出抑菌活性2.3 热处理对鸡冠花不同活性部位抑菌稳定性的影响对鸡冠花不同活性部位在不同条件下进行热处理,并进行抑菌试验,以确定其热稳定性,结果如图 1 所示。从图 1 可以看出,随着热处理温度的升高,鸡冠花不同活性部位对三种试验菌的抑菌效果呈下降趋势。在 60 和 80 加热后,鸡冠花的四个活性部位对三种试验菌的抑菌环直径略有减小,抑菌效果略有下降,但仍保持明显的抑菌效果。经过 100 处理后,抑菌效果均明显下降,其中萃取后水部位对粪肠球菌的抑菌圈直径减小 41.7%。尤其是经过 121 处理后,抑菌圈直径大幅下降,抑菌效果明显变差。实验结果表明不同活性部位的鸡冠花对高温较敏感,具有热敏性,在长时间的高温下抑菌效果明显受到影响,应避免长时间高温处理。第 51 卷第 2 期苏包顺,等:鸡冠花活性成分的提取及其抑菌效果125 图 1 热处理对鸡冠花不同活性部位抑菌效果的影响Fig.1 Effect of heat treatment on the antibacterial efficacy of different active sites of Celosia cristata L.2.4 紫外照射对鸡冠花不同活性部位抑菌稳定性的影响由图 2 可知,和对照相比,鸡冠花 4 个活性部位分别经紫外线处理 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 后,以MRSA、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌为指示菌,随着紫外线处理时间的延长,鸡冠花 4 个活性部位的对 3 种细菌的抑菌活性都受到了不同程度的影响,抑菌活性在一定时间段呈上下波动的趋势,除鸡冠花乙酸乙酯部位在40 min 处理对 MRSA 抑菌效果有较大的减弱,其余部位在 30 min 处理对菌体抑菌效果有较大减弱。在一定时间范围内,不同时长的紫外线处理对鸡冠花不同活性部位的抑菌效果都受到了不同程度的影响,但总的来说,紫外线照射对鸡冠花不同活性部位的影响不大,4 个活性部位的对 3 种细菌的抑菌活性任然处于较好的状态 结果表明,鸡冠花不同活性部位抑菌性对紫外照射的稳定性较好。图 2 紫外照射对鸡冠花不同活性部位抑菌稳定性的影响Fig.2 Effect of UV irradiation on the antibacterial stability ofdifferent active sites of Celosia cristata L.3 结 论鸡冠花既是很好的观赏植卉,又具有非常高的药用和食用价值,其价格低廉、分布地域广泛、易成活、易获取。对鸡冠花的古文献记载、现代文献报道进行研究发现,鸡冠花在抗菌方面可能具有深入研究的价值。在此基础上,本实验研究了鸡冠花中乙酸乙酯部位、正丁醇部位、二氯碳部位和萃取后水部位 4 个不同部位的体外抗菌活性,实验结果显示鸡冠花对革兰阳性菌抑菌效果较好,与相关文献报道一致21-22。在鸡冠花 4 个活性部位的实验比较下,鸡冠花对革兰阳性菌有较好的抑菌活性,其中二氯化碳部位的抑菌效果最好,且对 MRSA 效果最明显,表明二氯化碳部位是鸡冠花抑菌主要的活性部位。鸡冠花中含有的天然抑菌成分,本实验对鸡冠花不同部位的抑菌活性进行了研究,实验结果表明鸡冠花对细菌特别是革兰阳性菌有较强的抑菌活性,对革兰阳性菌特别是 MRSA 抑菌效果好,从食品领域、医学领域,都具有广阔的开发前景。本研究仅对鸡冠花不同活性部位抑菌性进行了初步综合对比分析,对其提取物安全性、对细菌是否具有耐药性还有待进一步探究,后续将会开展细胞毒性试验、动物毒理性试验、药理实验,测定相关指标,进一步探讨鸡冠花抑菌机制,以期为天然抑菌药物的开发奠定基础。参考文献1 赵润琴,张允菲,冯程,等.鸡冠花的化学成分和药理作用研究进展J.中医药信息,2017,34(3):129-131.2 李时珍.本草纲目M.北京:人民卫生出版社,1975.3 郭立玮,殷飞,王天山,等.鸡冠花止血作用及其作用机制的初步研究J.南京中医药大学学报,1996(3):24-26.4 曲艳玲,张海晶,陈大忠.鸡冠花中有效部位止血作用机制的初步研究J.时珍国医国药,2014,25(5):1113-1114.5 包贝华,赵显,曹雨诞,等.鸡冠花对致热复合出血模型大鼠的凉血止血效应机制研究J.中国药理学通报,2013,29(10):1457-1461.6Islam S,Shajib M S,Ahmed T.Antinociceptive effect of methanolextract of Celosia cristata Linn.in miceJ.BMC Complement AlternMed,2016,16(1):400.7 姜秀梅.鸡冠花对衰老动物模型作用的研究J.云南中医中药杂志,2005(1):33-34.8 Gholizadeh A,Kapoor H C.Modifications in the purification protocol ofCelosia cristata antiviral proteins lead to protein that can be N-terminally sequencedJ.Protein Pept Lett,2004,11(6):551-561.9 陈建芳,闫艳.鸡冠花体外抗阴道毛滴虫作用研究J.中国病原生物学杂志,2010,5(9):720-724.10 郭晓玲,李万里,尉辉杰,等.鸡冠花黄酮化合物对糖尿病小鼠脾脏及巨噬细胞吞噬功能的影响J.新乡医学院学报,2005(4):324-325.11 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