鸡毒支原体PstS蛋白的原核表达及其定位_宋春.pdf

收稿日期:20220614修回日期:20221125基金项目:国家自然科学基金项目(32060786、31660723);贵州省科技计划项目(黔科合支撑 2021 一般 161 号);贵州省优秀青年科技人才项目(黔科合平台人才 2021 5646)作者简介:宋春(1994)，女研究方向:动物疫病Email:1061655121 qqcom通信作者程振涛(1979)，男，教授研究方向:动物病原病理Email:chengzhentao sohucom鸡毒支原体 PstS 蛋白的原核表达及其定位宋春1，杨美1，岳筠2，单春兰1，王开功1，3，程振涛1，3(1贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025;2贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 5500083;贵州大学贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)摘要:通过 SOE-PC 技术获得 PstS 基因全长并克隆到 pCold，将重组表达载体 pCold-PstS 转化进 BL21(DE3)后经 IPTG诱导表达融合蛋白 PstS，将其纯化后免疫新西兰兔制备多克隆兔抗血清，提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白，通过Western blot 分析 PstS 蛋白的亚细胞定位结果表明，PstS 基因长度为 1 065 bp，其蛋白在氨基酸 931 之间存在跨膜区，pCold-PstS 经诱导表达获得融合蛋白 PstS(存在于细胞膜和胞浆中)，其约 43 ku 并具有较好的抗原性 PstS 蛋白是鸡毒支开放科学(资源服务)标识码(OSID)原体膜表面的免疫原性蛋白，可为进一步研究其生物学功能和基因工程疫苗提供依据关键词:鸡毒支原体;PstS 基因;原核表达;亚细胞定位中图分类号:S85262文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0344-07DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303009Prokaryotic expression and localization of Mycoplasmagallisepticum PstS proteinSONG Chun1，YANG Mei1，YUE Jun2，SHAN Chunlan1，WANG Kaigong1，3，CHENG Zhentao1，3(1College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2Guizhou Provincial Center forAnimal Disease Control and Prevention，Guiyang，Guizhou 550008，China;3Guizhou Key Laboratory of AnimalDisease and Veterinary Public Health，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China)Abstract:The full length of PstS gene was firstly amplified by SOE-PC and cloned into expression vector pCold Then the vectorpCold-PstS was transformed into BL21(DE3)to express the fusion protein PstS by IPTG induction，based on which polyclonal rabbitanti-serum was generated by immunizing New Zealand rabbit with the purified PstS protein The total protein，membrane protein andcytoplasmic protein of Mgallisepticum were extracted to analyze the distribution of PstS by Western blot with the rabbit anti-serumThe PstS gene was 1 065 bp in length，and its encoded protein had a transmembrane region between amino acid 9 and 31 The re-combinant protein PstS obtained by the induced expression of pCold-PstS was about 43 ku in size and had good antigenicity ThePstS existed on the membrane and in the cytoplasm of Mgallisepticum To summarize，PstS was an immunogenic protein on themembrane of Mgallisepticum，which provided theoretical support for further research on its biological function and genetic engineer-ing vaccineKey words:Mycoplasma gallisepticum;PstS gene;prokaryotic expression;subcellular localization鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)是鸡慢性呼吸道疾病的重要病原，导致鸡呼吸困难甚至发生肺炎，阻碍鸡的生长发育，降低产蛋量，也会引起死胚率升高12 养禽业集约化养殖模式和管理不善等多种原因导致鸡毒支原体、传染性喉气管炎等呼吸道疾病普遍发生，多种病原混合感染并长期存在，严重危害禽业经济34 目前，控制 MG 感染的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗在一定程度上，灭活疫苗可以控制感染，减少发病鸡的数量，降低产蛋量损失，但无法抵抗强毒株的攻击5 有研究表明，弱毒疫苗 F 株、6/85 和 ts-11 可有效控制 MG 在鸡体内传播68 但是弱毒疫苗免疫鸡群必须为健康鸡群，且蛋鸡在产蛋福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月期不宜接种，这限制了弱毒疫苗的使用9 鸡毒支原体缺乏细胞壁结构，脂质相关膜蛋白在其膜表面大量存在，可介导支原体黏附、侵入宿主细胞等过程，决定了支原体致病性强弱10 所以 MG 膜蛋白筛选及其黏附特性研究是解析 MG 致病机理和亚单位疫苗靶标的关键如 TM-1 蛋白、PvpA 蛋白、烯醇化酶、醛缩酶、pMGA 蛋白等 MG 外膜蛋白均有研究报道1112 本试验基于 MG F 株基因组，分析磷酸盐 ABC 转运蛋白底物结合蛋白(phosphate ABC transport-er substrate-binding protein，PstS)具有跨膜结构和良好的 B 细胞抗原表位，可能是 MG 的膜蛋白早期研究表明，PstS 是结核分支杆菌的膜蛋白，将其免疫小鼠后，可刺激细胞产生高水平的特异性抗体和 Th1 型细胞因子 IL-2、IFN-，具有较强的保护效率13 PstS 抗原是结核分支杆菌血清学诊断的最佳单抗原14 有研究表明，PstS 蛋白参与癌症、细菌和病毒感染等许多致病性相关的过程1516 但关于 PstS 蛋白在 MG 中的生物功能相关研究未见报道，本试验通过原核表达重组蛋白 PstS 制备多克隆抗体，并应用 Western blot 对PstS 蛋白在 MG 内的分布进行定位分析，为进一步研究 MG PstS 蛋白的生物功能提供依据1材料与方法11菌株MG F 菌株购自中国兽医监察所;感受态 DH5 购自宝生物工程(大连)有限公司;BL21(DE3)购自江苏科晶生物科技有限公司12主要试剂改良 Frey 氏培养基购自中海生物科技有限公司;pMD-19T 载体、pCold表达载体由贵州大学动物科学学院提供PfuDNA Polymerase、限制性内切酶 Sal、BamH购自宝生物工程(大连)有限公司;His 标签蛋白纯化试剂盒购自 NOVAGEN 公司;BCA 蛋白定量试剂盒、过硫酸铵、5SDS 蛋白上样缓冲液、预染蛋白 Marker、SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒、DAB 显色液均购自上海碧云天生物技术有限公司;膜蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物公司;弗氏佐剂、羊抗兔标记抗体(HP-IgG)均购自 SIGMA 公司13PstS 蛋白的生物信息学分析选择 15 株鸡毒支原体 NC06、NC08、NC95、NC96、VA94、S6、NY01、StrF、Str(high)、Str(low)、F、f99lab、NCTC、W101、CA06 参考菌株序列，应用相关软件17 分析 MG F 株 PstS 基因(AHB993661)的保守性、色氨酸密码子(TGA)，PstS 蛋白序列的理化性质、亲/疏水区、跨膜区、信号肽、B 细胞表位14PstS 基因的 SOE-PC 扩增与克隆MG 使用改良 Frey 氏培养基进行培养，提取其基因组为模板PstS 基因在 210 和 1 017 bp 处存在 2 个TGA 密码子，在大肠杆菌中表达为终止密码子，本试验利用 SOE-PC 将 2 个 TGA 点突变改变为编码色氨酸的 TGG根据 GenBank 上已发表的鸡毒支原体 StrF(CP0018731)中 PstS 基因信息，设计特异引物(表1)，利用 PstS p1/p2 扩增 PstS 的基因片段 231 bp，PstS p3/p4 扩增 849 bp，将 2 个 TGA 突变成 TGG，按照条件 94 3 min、94 30 s、60 30 s、72 2 min、30 个循环、72 延伸 5 min 进行 PC 反应经凝胶电泳并回收 2 个片段为模板，PstS p1/p4 引物扩增 PstS 基因1 065 bp按照条件 94 3 min、94 30 s、58 1 min、72 20 s、30 个循环、72 延伸7 min 进行 PC 扩增扩增 PstS 基因全长后回收并克隆至 pMD-19T载体，构建正确的克隆质粒 pMD-PstS表 1PstS 基因引物序列1)Table 1Primer sequences for PstS genePstS 基因引物名称引物序列 53预扩增片段bp片段 1PstS-p1CAGGGATCCATGAATACAAGGGGTTC231PstS-p2AGTCTTGATCTCAAGATCTTTCCATTGTTGAGTAGTTCTAGG片段 2PstS-p3CTTGAGATCAAGACTGTTGCTTTAGCTAAAGATGCAATCGCAG849PstS-p4CGGGTCGACTTAGAATTCAACCCCAAATTTAACTGGATTAAATGAAAAGTCACTAACCC1)下划线部分为限制性内切酶 BamH(GGATCC)、Sal(GTCGAC)序列，下划双线部分为点突变位点543第 3 期宋春等:鸡毒支原体 PstS 蛋白的原核表达及其定位15pCold-PstS 原核表达载体的构建将 pMD-PstS、pCold表达载体用 BamH、Sal进行双酶切后，经 10%琼脂糖凝胶电泳鉴定并胶回收 PstS 基因和 pCold载体大片段，然后进行连接、转化至 BL21(DE3)感受态细胞，于 LB 固体平板(Amp+)培养，挑单菌落于 LB 液体(Amp+)培养，提取重组质粒经 PC、双酶切鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，构建正确的 pCold-PstS 表达载体16PstS 蛋白的表达与纯化将 pCold-PstS 转化至 BL21(DE3)感受态细胞，摇床培养至 D600 nm为 0608，加入异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导，将诱导菌液高速离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗涤菌体沉淀并重悬，取4 体积菌液和1 体积 SDS 上样缓冲液混匀并置于沸水中 10 min，12%(体积分数)SDS-PAGE 电泳检测 PstS 蛋白表达超声裂解诱导菌体，高速离心后采用SDS-PAGE 检测，分离上清与沉淀采用亲和层析柱法纯化 PstS 蛋白后进行 12%SDS-PAGE 电泳，然后转印于聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，采用 QuickBlockTMWestern 液封闭1 h，TBST(Tris-HCl，NaCl，Tween20)漂洗 35 次，以 His-tag 抗体(稀释比例 1 1 000)为 1 抗于 4 孵育过夜，漂洗后以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HP)标羊抗小鼠 IgG(稀释比例1 5 000)为2 抗于37 孵育1 h，漂洗后采用 DAB 显色液进行显色，利用 Odyssey红外扫描仪进行扫描以验证 PstS 蛋白的表达17PstS 蛋白抗血清制备及效价测定将纯化后的 PstS 蛋白经过弗氏完全(不完全)佐剂等比乳化，通过皮下多点注射免疫约 2 kg 的新西兰大白兔，每只每次 400 g每隔 14 d 再次免疫，第 4 次免疫后的第 3 天采集心脏血，收集兔抗 PstS 血清后采用 ELISA 测效价18Western blot 鉴定 PstS 蛋白的定位取 40 mL 108CCU(color change unit，颜色变化单位)的 MG 液体培养物，4、12 000 rmin1离心 30min，弃上清沉淀中加 1 mL Western 及 IP 细胞裂解液，混匀后冰上裂解 210 min，离心得到上清为 MG 总蛋白再取 40 mL MG 液体培养物，参考膜蛋白提取试剂盒说明书对 MG 膜蛋白、胞浆蛋白进行提取将 3种蛋白用 BCA 蛋白定量试剂盒测定后进行 SDS-PAGE 电泳、转膜，PVDF 膜用 QuickBlockTMWestern 液封闭 1 h，TBST 漂洗 35 次，加 1 800 稀释的 PstS 兔抗血清 37 孵育 2 h，漂洗，再用 HP-山羊抗兔 IgG(1 5 000)孵育 1 h，漂洗，于 DAB 显色液中显色后利用 Odyssey红外扫描仪进行扫描2结果与分析21PstS 蛋白的生物信息学分析对 GenBank 中 15 株 MG PstS 基因核苷酸序列进行分析，PstS 基因同源性为 975%100%，PstS 基因在 210 和 1 017 bp 处存在 TGA 密码子，需要人工突变为色氨酸同义密码子 TGG经预测，其蛋白分子式为C1919H3001N499O583S7，pI=511，分子质量 426 ku，为亲水性蛋白931 区域有跨膜区，128 区域有信号肽在 8389、95105、121127、194201、297303、319328、352358 具有丰富的 B 细胞表位，很可能是鸡毒支原体的优势抗原表位区域22PstS 基因的 SOE-PC 扩增及克隆以 MG F 株的 DNA 为模板，用突变引物 PC 扩增出231 和849 bp PstS 基因片段，后经 SOE-PC 扩增PstS 基因全长 1 065 bp，均得到符合预期的目的片段(图 1)将 PstS 基因全长胶回收后克隆至 pMD19-T中，构建正确的 pMD-PstS23重组表达载体 pCold-PstS 的构建重组表达载体 pCold-PstS 经 PC 和 BamH/Sal双酶切鉴定，获得 1 065 bp 的目的基因条带，与预期相符(图 2)重组质粒测序结果表明，已将 PstS 基因成功亚克隆至表达载体 pCold24PstS 蛋白的诱导表达与纯化pCold-PstS 的阳性克隆菌经过 IPTG 诱导，对表达产物进行 SDS-PAGE 电泳，利用考马斯亮蓝染色并643福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷脱色后，凝胶上呈现出 43 ku 的目的蛋白条带(图 3A)，诱导菌液超声裂解后，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳，可见融合蛋白 PstS 在上清中高效表达(图 3B)，主要为可溶性表达融合蛋白 PstS 纯化后，采用 Western blot 检测，在 43 ku 处有显色条带(图 3C)，说明纯化的融合蛋白 PstS 能与 His 标签单抗发生特异性反应M:DL 2 000 Marker;1:阴性对照;2:PstS 基因片段 1 扩增产物;3:PstS 基因片段 2 扩增产物;45:阴性对照;6:PstS 基因全长扩增产物图 1MG F 株 PstS 基因 PC 扩增Fig1PC amplification of PstS gene in F strain of Mgallisepticum1:DL 2 000 Marker;23:pCold-PstS 重组质粒;4:阴性对照;5:DL 5 000 Marker;6:pCold-PstS 重组质粒;7:pCold空载体图 2pCold-PstS 重组质粒的 PC(A)及双酶切(B)鉴定Fig2Identification of recombinant plasmid pCold-PstS by PC(A)and double digestion(B)M:Marker;1:空载体诱导;2:重组菌诱导;3:重组菌未诱导;4:重组菌诱导沉淀;5:重组菌诱导上清;67:纯化蛋白图 3PstS 蛋白的诱导表达(A)、表达形式分析(B)与纯化(C)Fig3Induced expression(A)，expression form analysis(B)and purification(C)of PstS protein743第 3 期宋春等:鸡毒支原体 PstS 蛋白的原核表达及其定位25兔抗 PstS 血清效价测定ELISA 方法测得制备的兔抗 PstS 血清效价为 1 25 600(图 4)制备的兔抗血清与免疫原呈现阳性反应，且效价较高，说明融合 PstS 蛋白具有较好的免疫原性图 4PstS 抗血清的效价测定Fig4Titer determination of antiserum of PstS26MG 总蛋白、胞浆蛋白和膜蛋白的提取提取 MG 总蛋白、胞浆蛋白和膜蛋白进行浓度测定及 SDS-PAGE 电泳(图 5)检测，在约 43 ku 的位置处均可见目的蛋白条带，且膜蛋白在总蛋白中的占比较低27PstS 融合蛋白在鸡毒支原体中的亚细胞定位将 MG 总蛋白、胞浆蛋白和膜蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，分别用兔抗 PstS 血清孵育，通过 Western blot检测均可呈现出 43 ku 的免疫印迹条带(图 6)说明 PstS 存在于细胞膜组分和胞浆组分中，是鸡毒支原体的膜蛋白，也是 MG 的胞浆蛋白M:Marker;1:膜蛋白;2:胞浆蛋白;3:总蛋白图 5MG 总蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白的表达Fig5Expression of total protein，cytosolic protein and membraneprotein in Mgallisepticum1:总蛋白;2:胞浆蛋白;3:膜蛋白图 6PstS 蛋白在 MG 中的亚细胞定位Fig6Subcellular localization of PstS protein in Mgallisepticum3讨论磷以磷酸盐的形式存在于生物体中，在菌体组成结构、能量代谢、信号传递等方面发挥重要作用磷酸盐特殊转运(phosphate specific transport，Pst)系统是细菌中磷酸盐吸收转运的关键系统，PstS 蛋白在 Pst系统中主要负责外界磷酸盐的摄取，是 ABC 磷酸盐摄取机制中的结合元件1819 有研究表明，在膜表面，具有表达 PstS 蛋白的细胞，其捕获磷酸盐的能力更强20 而大肠杆菌过表达溶磷菌 PstS 蛋白后，对磷酸盐的吸收也显著增加21 Zaborina et al22 从肠上皮组织分离出富含 PstS 蛋白的高毒力铜绿假单胞菌，证明了 PstS 蛋白参与肠上皮细胞的黏附过程并破坏细胞完整性此外，PstS 蛋白还通过影响细菌生物被膜的形成，介导细菌耐药23 有研究表明，PstS 蛋白可以增强细菌对青霉素、氟喹诺酮类等抗生素的耐药843福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷性2425 因此，膜表面的 PstS 蛋白在原核生物中具有重要的生物学意义支原体缺乏细胞壁，其表面膜蛋白与致病过程和免疫应答密切相关26 跨膜区是膜受体蛋白、离子通道蛋白或膜锚定蛋白的重要特征，常用来预测是否为膜蛋白2728 Western blot 是进行膜定位的常用方法2931，本试验采用 Western blot 对鸡毒支原体 PstS 蛋白进行亚细胞定位分析，结果表明，PstS 蛋白既存在于细胞膜上，也存在于胞浆中这种多分布、多功能特性在支原体膜蛋白定位研究中均有报道3233，可能是因为支原体作为最小的原核微生物，其基因组有限的编码能力决定了支原体系统中蛋白的多功能兼职性34，所以相同蛋白在胞浆中发挥生理功能的同时也会分泌到膜表面参与病原菌黏附、入侵等过程而PstS 蛋白作为磷酸转运系统中的关键成员，其生理作用决定了其同时存在于膜蛋白和胞浆蛋白中4结论本试验通过生物信息学分析揭示 MG PstS 蛋白具有跨膜结构和良好的抗原表位特征，并在原核表达系统中成功表达了 MG PstS 蛋白(约 43 ku)通过 Western blot 证实 PstS 蛋白同时存在于 MG 膜组分和胞浆组分中，属于鸡毒支原体的膜蛋白，为后续 MG 致病机理、耐药性机制和基因工程疫苗研究提供了依据参考文献 1BEK K，KEIZINGE Z，SULYOK K M，et al Genotyping Mycoplasma gallisepticum by multilocus sequence typingJ Veterinary Microbiology，2019，231:191196 2牛家强，徐业芬，胡思顺，等藏鸡鸡毒支原体的分离鉴定及对常用抗菌药物的敏感性试验 J 中国兽医学报，2018，38(11):20842087，2093 3KANCI C A，UNDEWOOD G J，SHIL P K，et al Mycoplasma gallisepticum strain ts-304 is a safe and effective live attenua-ted vaccine for use in chickens J Veterinary Microbiology，2020，244:108654 DOI:101016/jvetmic2020108654 4辛梅，张頔，李金斗，等鸡毒支原体 TM-1 蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建及鉴定 J 中国兽医学报，2021，41(4):655660，669 5KANCI A，WIJESUENDA D S，WAWEGAMA N K，et al Evaluation of Mycoplasma gallisepticum(MG)ts-304 vaccine asa live attenuated vaccine in 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