ampcb内酰胺酶的分子生物学研究应用进展.doc

文章编号： () 045203AmpC B-内酰胺酶分子生物学研究进展蔡琰综述范昕建吕晓菊审校(四川大学华西医院传染科，成都610041)摘要：AmpC B2内酰胺酶是属Bush 功能分类 群,Ambler 分子分类C 类头孢菌素酶，重要由染色体介导产生，不被克拉维酸抑制，能水解第三代头孢菌素、头霉素等广谱B2内酰胺类抗生素。AmpC B2内酰胺酶表达受amp 复合操纵子调控，与肽聚糖合成密切有关。amp 复合操纵子由ampC、ampR、ampD 和ampG 构成，分别编码AmpC B2内酰胺酶、转录调节因子AmpR,N 2乙酰葡萄糖胺2L 2丙氨酸酰胺酶AmpD 和膜结合转运蛋白AmpG。其中AmpR 与UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽结合可抑制ampC 转录，与N 2乙酰胞壁酰酐三肽结合可激活ampC 转录。调控基因突变及B2内酰胺类抗生素诱导作用均可使肽聚糖合成与水解反映失衡，导致N 2乙酰胞壁酰酐肽积聚，从而使AmpC B2内酰胺酶产量提高。近年来，质粒编码AmpC B2内酰胺酶逐渐增多，源于肠杆菌科细菌，与染色体编码AmpC B2内酰胺酶在分子构造上具不同限度同源性。AmpC B2内酰胺酶诱导产生及质粒编码AmpC B2内酰胺酶浮现是细菌针对抗生素导致选取压力而进化成果，临床实践中必要慎用超广谱B2内酰胺类抗生素。核心词：AmpC B2内酰胺酶；B2内酰胺耐药性；去抑制突变；诱导作用中图分类号：Q 556+ . 4,Q 756文献标记码：A收稿日期：211204作者简介：蔡琰，女，生于1977 年，在读研究生研究生，重要从事感染性疾病及细菌耐药机制研究。B2内酰胺类抗生素是临床惯用且有效抗感染药物，但是细菌几乎对每一种新B2内酰胺类抗生素都浮现了耐药性。产生B2内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌最重要耐药机制 1 。当前新B2内酰胺酶中，以超广谱酶( ex tended2spect rum beta2lactam ases，ESBL ) 和AmpC B2内酰胺酶最具临床意义。ESBL 是由质粒介导、能赋予细菌对各种B2内酰胺类抗生素耐药一类酶 2 ，重要由大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌产生。1AmpC B-内酰胺酶发现和普通特性AmpC B2内酰胺酶由革兰氏阴性杆菌产生，不被克拉维酸抑制，因其优先底物是头孢菌素类抗生素又称头孢菌素酶，属Bu sh 功能分类 群,Am b ler 分子分类C 类 3 。最初AmpC B2内酰胺酶由染色体介导自然产生，重要见于阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷氏菌及铜绿假单胞菌。1967 年Hennessey 4 报道了一种阴沟肠杆菌产生可诱导B2内酰胺酶，即目前所知染色体介导AmpC B2内酰胺酶。20 世纪80 年代后来，许多质粒介导AmpC B2内酰胺酶被陆续报道。依照能否被B2内酰胺类抗生素诱导,AmpC B2内酰胺酶又可分为诱导酶和非诱导酶。后者存在于大肠埃希氏菌及志贺氏菌中。而肠杆菌、摩氏摩根菌、弗氏柠檬酸杆菌等细菌中,AmpC B2内酰胺酶可被诱导产生，由于这些细菌中有AmpC B2内酰胺酶调节基因ampR 5，6 ，而产生非诱导性AmpC B2内酰胺酶细菌缺少该基因。据报道，将弗氏柠檬酸杆菌中ampC与ampR 克隆至大肠埃希氏菌后，大肠埃希氏菌中AmpC B2内酰胺酶可被诱导表达 7 。产AmpC B2内酰胺酶细菌对第二和第三代头孢菌素类、头霉素类、单环内酰胺类、酶抑制剂耐药，且肠杆菌科细菌往往同步带有氨基糖苷类、氯霉素、四环素等药物耐药基因,导致多重耐药，对于这些耐药株，碳青霉烯类抗生素是最有效药物。2AmpC B-内酰胺酶基因表达调控机理（AmpC 酶是AmpC内酰胺酶简称。 是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌染色体或质粒介导产生一类内酰胺酶,属内酰胺酶Ambler 分子构造分类法中C 类和Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制内酰胺酶。故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。）2. 1amp 复合操纵子AmpC B2内酰胺酶表达受amp 复合操纵子调控，由4 个不持续基因ampC、ampR、ampD、ampG 构成(图1)。ampC 是构造基因，编码AmpC B2内酰胺酶。ampR 与ampC 相邻排列在染色体上，呈逆向转录，编码AmpC B2内酰胺酶转录调节因子AmpR 8 。AmpR 属ly sR 调节子家族，结合在ampR - ampC 间区DNA 上，与ampC 启动基因及ampR 操纵基因直接互相作用 9 ，在有诱导剂时起激活子作用，没有诱导剂时起抑制子作用 9 。ampD 位于远处染色体上，编码N 2乙酰葡萄糖胺2L 2丙氨酸酰胺酶(AmpD) ，参加粘肽代谢。ampG 编码转膜蛋白AmpG，在AmpC B2内酰胺酶表达调控中起向胞浆内传递诱导信号作用 10 。 5 6 1 国外医药抗生素分册 年7 月第23 卷第4 期 1995- Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd. All rights reserved.图1AmpC 表达调控2. 2AmpC B2内酰胺酶基因表达与肽聚糖代谢关系AmpC B2内酰胺酶诱导与细胞壁代谢直接相关 11 。在细胞代谢过程中，水解酶降解胞壁质产生N 2乙酰葡萄糖胺2N 2乙酰胞壁酰三肽，具透性酶活性AmpG 将其转至胞浆，继而被AmpD 水解，或先由细胞质B2N 2乙酰氨基葡糖苷酶( cyto so lic B2N 2acetylgluco sam in idase，Gm ase) 降解为N 2乙酰胞壁酰三肽，再被AmpD 水解。两种水解方式均产生L 2丙氨酰2D 2谷氨酰2消旋二氨基二酸三肽，参加粘肽循环，生成胞壁质重要前体物质UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽 12 。研究表白，UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽能与AmpR 结合，变化其与ampC 启动基因联系，抑制其对RNA聚合酶转录活性增进作用。N 2乙酰胞壁酰三肽则能与UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽竞争与AmpR 结合，从而解除其抑制作用，恢复AmpR 激活ampC 转录功能 13 。由此可见,AmpC B2内酰胺酶表达受到胞浆内这两种肽相对水平调控 11 。此外,D ietz 等 16 研究发现N 2乙酰葡萄糖胺2N 2乙酰胞壁酰五肽也可被AmpG 转运至胞浆，其水解产物N 2乙酰胞壁酰五肽亦可取代UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽与AmpR 结合，使AmpR 由抑制子变为激活子。2. 3调控基因突变在正常生长条件下，野生型菌株中AmpR 重要与UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽结合，ampC 转录处在受抑制状态，只产生极微量酶。但是阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌等野生型群体在自然状态下就可以10- 5 10- 7频率发生去抑制突变，其中完全去抑制型AmpC B2内酰胺酶产量可比突变前提高1000倍以上。去抑制突变重要是ampD 突变，产生有缺陷AmpD，致使N 2乙酰胞壁酰三肽大量积聚于胞浆内，而UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽生成量减少，与AmpR结合位点被取代,AmpR 变成激活子。使用B2内酰胺类抗生素将清除敏感菌株，而突变株得以繁殖，成为优势菌群。此为抗生素对去抑制突变株选取作用。ampR 突变可产生缺陷型AmpR，不受诱导剂及其她调节基因影响，失去调控ampC 转录能力,AmpCB2内酰胺酶呈持续高表达。3B-内酰胺类抗生素诱导作用B2内酰胺类抗生素能与细菌青霉素结合蛋白(PBP) 形成共价键，抑制其活性。PBP 是位于细菌内膜表面酶，参加肽聚糖合成。高分子量PBP la，1b，2,3 为细菌生长所必须，PBP la，1b 为转肽酶及转糖苷酶，催化多聚糖链延伸及肽聚糖交联。PBP2，3 为转肽酶，PBP2 启动新生肽聚糖插入延伸位点，PBP3 特异作用于横隔形成 12 。低分子量PBP4，5，6a，6b，7 非细菌生长所必须，多为D 2羧肽酶，能使五肽侧链末端D 2丙氨酸水解生成四肽。大肠埃希氏菌中有4 种不同水解肽聚糖糖苷键酶，其中Slt70 能与PBP la，1b 和2 作用，肽链交联能阻断Slt70 与肽聚糖链作用，从而减少该酶活性 14 。周质间隙中B2内酰胺类抗生素与PBP 结合导致肽聚糖合成与水解反映失衡。抗生素对D 2羧肽酶PBP4，5，6a，6b 抑制导致肽聚糖中五肽侧链水平升高；对PBP la，1b 和或2 抑制导致转肽酶活性丧失，胞壁质中肽链交联水平下降，导致Slt70 等水解酶进一步降解胞壁质 15 。因而周质间隙中N 2乙酰胞壁酰肽积聚，其中最重要降解产物N 2乙酰胞壁酰五肽被转运至胞质中 16 ，取代UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽与AmpR 结合，使AmpR 由抑制子变为激活子 8 。抑制Slt70 活性可减少B2内酰胺类抗生素诱导水平。B2内酰胺类抗生素诱导能力有明显差别：亚胺培南是强诱导剂；第三代头孢菌素类为弱诱导剂，但具选取性；氨曲南和三唑巴坦则没有诱导性。这种差别和抗生素与PBP 亲和力不同关于。强诱导剂与PBP亲和力远远高于非诱导剂，且必须抑制细菌所有D 2羧肽酶及PBP la，lb 和或PBP2 19 。4质粒介导AmpC B-内酰胺酶编码AmpC B2内酰胺酶基因常用于染色体上,近年来浮现了向质粒转移趋势。质粒中ampC 没有调控基因，呈持续高表达，且由于质粒迅速复制和可转移性，导致了更多菌株耐药。第一种被报道质粒介导AmpC B2内酰胺酶是M IR2l，据DNA 序列分析，其来源于阴沟肠杆菌染色体。当前，质粒编码AmpC B2内酰胺酶分布于世界各地，并以平均每年发现l 2 个新质粒速度增长。J ing 等 17 发现了克 6 6 1 国外医药抗生素分册 年7 月第23 卷第4 期 1995- Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd. All rights reserved.雷伯氏菌产生新AmpC B2内酰胺酶CM Y28，其核苷酸及氨基酸序列与CM Y21、MOX21 高度有关，也许具备相似来源，且3 种酶底物轮廓高度相似，均介导细菌对头孢噻吩、头孢噻肟高度耐药。质粒编码与染色体编码AmpC B2内酰胺酶具不同限度同源性(37% 99% )。阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌产生染色体编码AmpCB2内酰胺酶分别与如下3 组质粒编码AmpC B2内酰胺酶高度有关：CM Y2 3，LA T 1 4 (98% 氨基酸同源) ;MR I(90% 氨基酸同源) ,ACT 21;DAH21。1999 年Delph ine 等 19 发现蜂房哈夫尼菌产生染色体编码AmpC B2内酰胺酶与来自肺炎克雷伯氏菌ACC21 有一定同源性。这些表白质粒编码AmpC B2内酰胺酶源自肠杆菌科细菌 9 。但AmpC B2内酰胺酶如何由染色体编码转向质粒编码仍不清晰，值得进一步研究。5结束语AmpC B2内酰胺酶分子生物学研究为寻找和设计新型抗生素和酶抑制剂提供了新靶位。但从AmpCB2内酰胺酶诱导产生及质粒介导AmpC B2内酰胺酶浮现不难看出，随着越来越多新型抗生素应用于临床，细菌也不断通过耐药性逃避厄运。耐药性是细菌针对抗生素应用导致选取压力而进化必然结果 18 。质粒或染色体介导耐药性普通只发生在少数细菌内，只有当占优势敏感菌因抗生素选取作用被消灭，耐药菌才干得以大量繁殖。抗生素广泛应用特别是滥用导致了耐药性发展，因此控制耐药性不能单纯寄但愿于开发和研制新抗生素，临床实践中特别要注意严格掌握用药适应证，合理使用超广谱B2内酰胺类抗生素，加强细菌耐药性监测及医院内严格消毒隔离制度。参照文献 1 No rdmann P，Noas T. The increasing p roblem ofresistance to cephalo spo rins. J . Curr Op in Inf D is,1997，l0：435 2 孙长贵，陈汉美. 超广谱B2内酰胺酶研究进展. J . 国外医药抗生素分册，21 (3) ：111 3 Bush K，Jacoby GA ，M edeiro s AA. A funct ionalclassificat ion scheme fo r beta2lactamases and itsco rrelat ion w ith mo lecular st ructure. J . A nt im icrobA gents Chemo ther，l995，39 ：1211 4 Hennessey TD. Inducible B2lactamase in E nterbactercloacae. J . J GenM icrobio l，1967，49：277 5 L indberg F，No rmark S. Cont ribut ion of ch romo someB2lactamase to B2lactam resistance in E nterobacteria.J . Rev infect D is，l986，8：s292 6 L indqust S，L indberg F，No rmark S. B inding of theC itrobacter f reud ii AmpR regulato r to a singnal DNAsite p rovides bo th auto regulat ion and act ivat ion of theinducible ampC B2lactamase gene. J . J Bacterio l，l989,171：3746 7 L ingderg F，L indqust S，No rmark S. Inact ivat ion of theampD gene causes sem i2consit ive overp roduct ion of theinducible C itrobacter f reund ii B2lactamase. J . JBacterial，l987，l69：1923 8 Jacobs C，F rere JM ，No rmark S. Cyto so lic intermediatesfo r ce1l w all bio synthesis and degradat ion cont ro linducible beta2lactamase resistance in Gram 2negat ivebacteria. J . Cell，l997，88. 823 9 Cirlich D，N aas T，Bellais S. B iochem ical2genet iccharacterizat ion and regulat ion of exp ression of an A cc2I2like ch romo some2bo rne cephalo spo rinase from H af niaalvei. J . A nt im icrob A gents Chemo ther，44 :l470 10 Stap leton P，Shannon K，Ph illip s I. DNA sequencedifferences of ampD mutants of C itrobacter f reund ii.J . A nt im icrob A gents Chemo ther，1995，39 (11) ：249411 Jacobs C. L ife in the balance：cell w alls and ant ibio t icresistance. J . Science，1997，278 (5344) ：173112 王以光，主译. 抗生素多学科研究入门. M . 北京：人民卫生出版社，1998 13 张磊. AmpC B2内酰胺酶：抗感染治疗面临新挑战. J .国外医药抗生素分册，21 (3) ：116 14 B ramh ill D. Bacteria cell division. J . A nnu Rev CellDev B io l，1997；13：395 15 W iedemann B. B2lactamase induct ion and cell w allrecycling in Gram2negat ive bacteria. J . D rug ResistU pdates，l998，1：223 16 D ietz H，P teit le D，Schw arzU. The signalmo lecule fo r B2lactamase int roduct ion in E nterbacter cloacae is theanhydromuramyl pentapep t ide. J . A nt im icrob A gentsChemo ther，1997，41：2113 17 Yan JJ ,W u SM ，T sai SH. P revalence of SHV 212 amongclinical iso lates of K lebsiella p neum onia p roducingextended2spect rum B2lactamases and ident ificat ion of anovel AmpC enzyme (CM Y28) in Souther Tainan. J .A nt im icrob A gents Chemo ther，44 ：143818 邢旺兴. 论抗生素与细菌耐药性. J . 医学与哲学,1998，19 (1) ：1 19 D iete P，Eva J ，Bernd W. Ro le of penicillin2bindingp ro teins in the init iat ion of the AmpC B2lactamaseExp ression in E nterobacter cloacae. J . A nt im icrobA gents Chemo ther，44 (1) ：169 7 6 1 国外医药抗生素分册 年7 月第23 卷第4 期 1995- Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd. All rights reserved.作者单位:03 上海,第二军医大学附属长征医院实验诊断科继续教诲园地AmpC内酰胺酶检测赵虎孔宪涛AmpC内酰胺酶(简称AmpC 酶) 是由肠杆菌科细菌或/ 和绿脓假单胞菌染色体或质粒介导产生一类内酰胺酶,属内酰胺酶Ambler 分子构造分类法中C 类和Bush2Jacoby2Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制内酰胺酶。故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶 1 ,2 。AmpC 酶按其产生方式分为3 类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶 2 ,3 。(1) 诱导高产酶:AmpC 酶合成往往与2内酰胺类抗生素存在关于。绝大某些肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无内酰胺类抗生素存在条件下) 只产生少量AmpC 酶。而当有诱导作用内酰胺类抗生素存在条件下,AmpC 酶产量明显增长,增长范畴在1001 000 倍之间。(2) 持续高产酶:另有一某些产AmpC 酶菌株无论在有无内酰胺类抗生素存在条件下均可持续高水平产生AmpC 酶,其原由于去阻遏突变,即调控基因之一ampD 基因发生突变,产生有缺陷AmpD 蛋白,不能与另一种调控蛋白AmpR 蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶大量表达。质粒介导AmpC 酶往往都属于此类AmpC 酶。产生这种AmpC 酶细菌对临床危害最大,是临床微生物实验室检测重点。(3) 持续低产酶:尚有极少某些产AmpC 酶菌株,无论在有无内酰胺类抗生素存在条件下均持续低水平产生AmpC 酶,其因素也许是另一种调节基因ampR 基因发生突变，产生有缺陷AmpR 蛋白,不能在无内酰胺类抗生素存在条件下起到抑制子作用,也不能在有内酰胺类抗生素存在条件下起到激活子作用,故AmpC 酶得以持续低水平地表达。检测不同类型AmpC 酶或检测产不同类型AmpC 酶菌株,其办法也有所不同。近年来,随着内酰胺类抗生素、特别是头孢菌素广泛应用,产AmpC 酶革兰阴性杆菌越来越多见,特别是出现了(去阻遏) 持续高产AmpC 酶和质粒介导AmpC 酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染治疗困难,已引起临床高度注重,故检测AmpC 酶具备非常重要临床意义。当前已陆续报道了各种检测AmpC 酶办法,除改良三维实验较为典型外,其她检测办法还不成熟,尚在摸索、实验阶段,检测成果也各不相似。现讲述如下。一、头孢西丁敏感实验 4 AmpC 酶可以水解头孢西丁( FOX) ,即产AmpC 酶菌株对头孢西丁耐药。而ESBLs 等其她内酰胺酶普通不能分解头孢西丁,即产ESBLs 菌株对头孢西丁敏感。运用AmpC 酶这一特性,可以对产AmpC 酶菌株进行初步筛选。详细操作办法：(1) 纸片扩散法:按美国临床实验室原则化委员会(NCCLS) 纸片扩散( K2 法进行。FOX 纸片含量为30g。判断原则为抑菌环 16g/ ml ,表达待检菌株对FOX耐药。对FOX 耐药菌株,应怀疑产AmpC 酶也许。固然,不是所有对头孢西丁耐药菌株都是产AmpC 酶菌株(当前产ESBLs 菌株对头孢西丁耐药率已超过30 %) 。故此办法仅仅作为初步筛选。需做三维实验或纸片协同实验等实验,进行进一步拟定。二、AmpC 酶表型筛选实验 5 依照AmpC 酶对大某些头孢菌素、特别是三代头孢菌素耐药特性,选用各种头孢菌素纸片对产AmpC 酶菌株进行表型筛选。可选用亚胺培南( IP) 、头孢吡肟( FEP) 、头孢她啶/ 克拉维酸(CTD/ Cla) 、头孢噻肟(CTX) 和头孢噻肟/ 克拉维酸(CTX/ Cla) 5 种抗生素纸片进行筛选实验。详细操作办法按NCCLS K2B 法进行。判断原则：(1) IP、FEP 敏感,而CTX、CTD/ Cla 和CTX/Cla 耐药；(2) IP、FEP 敏感,而在CTX、CTD/ Cla 和CTX/ Cla抑菌环内存在散在菌落；(3) IP 敏感,而FEP、CTD/ Cla和CTX/ Cla 耐药。以上3 种成果提示,待检菌株产AmpC酶。最后一种表型提示,待检菌株产AmpC 酶同步,产生其她内酰胺酶,如产ESBLs。此办法操作简便、迅速省时,较三维实验简朴得多,成果基本可靠,与三维实验符合率达89158 %。可以在各临床微生物实验室推广应用。三、氟氯西林(FCC) 双抑制剂扩散协同实验 6 ,7 氟氯西林(FCC) 可抑制AmpC 酶活性,使产AmpC 酶菌株不能及时水解和破坏头孢菌素,保存了这些抗生素抗菌活性。运用这一特性,可选用FCC 与其她超广谱头孢菌素( ESC) 进行双抑制剂扩散协同实验( double inhibitorsdiffuse synergy test ，DIDST) ,观测其有无协同作用。因FCC在琼脂中扩散能力较差,故实验过程中不直接选用FCC 纸片,而是将FCC 药液直接加在空白纸片上进行扩散,这样才 0 9 3 中华检查医学杂志 年6 月第26 卷第6 期Chin J Lab Med ，J une ，Vol 26 ，No1 6 1995- Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd. All rights reserved.能观测到协同实验效果。详细操作办法:在M2H 平板上均匀涂布待检菌株,中央贴一空白纸片,并在其周边2025 mm 处贴上CTD、头孢曲松(CRO) 、头孢哌酮(CFP) 、氨曲南(ATN) 、CTX和CPI 纸片,再在空白纸片上滴加10 mg/ ml FCC 20l ,35 孵育1824 h ,观测纸片之间抑菌环状况。FCC 与任何一种头孢菌素协同为阳性,提示产AmpC酶。此办法与AmpC 酶表型筛选实验相仿,即采用纸片扩散办法即可迅速检测AmpC 酶,操作简便、迅速省时。成果基本可靠,可以在各临床微生物实验室推广应用。四、三维实验 4 ,5 ,7 ,9 三维实验也是运用AmpC 酶可以水解头孢西丁原理,先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中内酰胺酶提取出来(粗提) ,观测这种酶粗提物对头孢西丁抑制状况。如果粗提物中有AmpC 酶存在,即可抑制头孢西丁活性,使其周边对头孢西丁敏感大肠埃希菌得以生长;反之,大肠埃希菌受头孢西丁抑制则不能生长。详细操作办法：(1) 制备内酰胺酶粗提物:将待检菌株接种在M2H 肉汤或胰蛋白大豆胨水中增菌,离心收集细菌,用0101 mol/ L 磷酸盐缓冲液或PBS(pH710) 冲洗后制成一定浓度细菌悬液,再用冻融法( - 70 迅速冷冻、室温或37 水浴迅速解冻,重复5 次) 或超声粉碎法(4 ,超声粉碎) 破碎菌细胞，使其菌体内酶释放出来，再离心(12 ,000 r/ min ,1 h) 去除细菌碎片,收集上清液即为内酰胺酶粗提物。取某些上清液接种M2H 平板常规培养,证实无活菌存在。再用头孢硝噻吩纸片拟定有内酰胺酶存在。(2) 三维实验:将大肠埃希菌原则菌株ATCC25922 按NCCLS K2B 法涂布在M2H 平板上,在平板中央贴一张FOX纸片,从距离纸片5 mm 处用无菌刀片在平板琼脂上向外缘方向(离心方向) 切一裂隙(一块平板可切45 条裂隙) ,每一裂隙中加入2530l 一种待检菌株内酰胺酶粗提物(注意内酰胺酶粗提物不可溢出裂隙) ,35 培养1824 h ,观测裂隙内侧端(头孢西丁纸片抑菌环内) 周围有无细菌生长。判断原则:裂隙内侧端周边有细菌生长、导致头孢西丁纸片抑菌环有缺失者为阳性,表白该裂隙内内酰胺酶为AmpC 酶,也就是说这种待检细菌产AmpC 酶。因运用酶粗提物而不是活菌做检测,不受抗生素诱导影响,故三维实验是当前公认、较为典型检测(去阻遏) 持续高产AmpC 酶办法,也是当前检测质粒AmpC 酶最佳办法。但缺陷是需增菌、破碎菌细胞并提取酶粗提物,操作繁琐、费时,难以在临床微生物实验室常规应用。五、等电聚焦及氟氯西林抑制实验 5 ,9 ,10 AmpC酶等电点相对集中,为6101010 ,且大多910 ,故可用物理办法先将其从待检菌细胞中释放出来,制成酶粗提物,再用等电聚焦办法在琼脂糖凝胶板上将其与其她 内酰胺酶或其她蛋白成分分开。头孢硝噻吩(nitrocephin) 是一种标记有硝基环头孢菌素,溶于水后呈黄色,被内酰胺酶(涉及AmpC 酶) 水解后呈红色。氟氯西林可以抑制AmpC 酶活性,而对其她内酰胺酶活性则无明显抑制作用。若先用氟氯西林对凝胶板上酶进行抑制,再用头孢硝噻吩进行显色反映,被抑制掉条带即可能为AmpC 酶条带。详细操作办法:用超声粉碎法制备待检细菌中内酰胺酶粗提物,再用Phastsystem 电泳法进行等电聚焦(用两份同种内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板,电泳条件完全相同) 。将一用氟氯西林(1 mmol/ L) 浸润滤纸条覆盖在第一块凝胶板(A 板) 上,而第二块凝胶板(B 板) 上仅覆盖用无菌蒸馏水浸润滤纸条,30 s 后去除两块凝胶板上滤纸,再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩(500g/ ml) 滤纸条,1 min后揭去滤纸条,观测凝胶板上各条带显色状况。成果判断:如果A、B 两块凝胶板上条带颜色不同,即在B 板上变色(由黄变红者) 、而在A 板上不变色(仍为黄色) 条带,即为AmpC 酶,表白待检菌株产AmpC 酶。与三维实验相似,该办法也是运用酶粗提物而不是活菌作检测,不受抗生素诱导影响,也是用来检测(去阻遏)持续高产AmpC 酶办法,也可检测质粒AmpC 酶。但缺陷较三维实验更繁琐、费时,不适当在临床微生物实验室推广应用。六、AmpC 酶基因检测AmpC 酶基因组是由一种构造基因amp C 和4 种调控基因ampR、ampD、amp E 和amp G所构成 2 ,3 。AmpC酶基因存在于阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌、拘橼酸杆菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产AmpC酶细菌染色体远端或质粒中。存在于不同细菌中AmpC 酶基因其特定核苷酸序列都是相似,即无论是构造基因ampC 还是各种调控基因,均有其特定核苷酸序列。故通过查找待检细菌中有无特定AmpC 酶基因片段(通过特异性基因引物，扩增待检细菌中特定AmpC 酶基因片段,分析其特定核苷酸序列) ,即可拟定待检细菌能否产AmpC 酶。当前有报道可以检测AmpC 酶基因有ampC 基因和ampD 基因 5 ,11 ,12 。详细操作办法：用煮沸法提取待检细菌DNA 或质粒DNA ,再用PCR 法进行扩增(94 1 min ，56 1 min ,72 3min ,共35 个循环) 。扩增ampC 基因引物分别为:引物1( 52CTGATGAAAGCCCAGTCTGT23) 和引物2 ( 52TTCGCGAGCATCACAATACC23) ,扩增ampD 基因引物分别为：引物3 (52CCGAGTAACAGCACCATAGA23) 和引物4 (52TATTGCGCATCGGTGTAAGG23) 。收集扩增产物(110 %琼脂糖凝胶电泳) ,经DNA 自动测序仪测定其核苷酸序列,并与基因库中AmpC 酶ampC 基因或ampD 基因序列进行分析、比较,最后得出成果。判断原则:待检细菌中找出AmpC 酶特定基因片段(ampC 基因或ampD 基因片段) ,表白该菌具有AmpC 酶 1 9 3 中华检查医学杂志 年6 月第26 卷第6 期Chin J Lab Med ，J une ，Vol 26 ，No1 6 1995- Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd. All rights reserved.基因,也许产生AmpC 酶。AmpC 酶基因检测法可直接检测待检细菌中染色体或质粒(两者提取办法不同) 上ampC 基因或ampD 基因片段,判断细菌能否产AmpC 酶。不受表型和外界因素影响,精确性高。特别是检测ampD 基因更故意义,由于不但可以检测有无正常ampD 基因序列,判断能否产AmpC酶;还可检测突变ampD 基因序列,判断能否产生(去阻遏) 持续高产AmpC 酶。但该办法实验操作仍较繁琐,只适合于科学研究工作。以上综述了当前检测AmpC 酶各种办法。头孢西丁敏感实验(涉及纸片扩散法和肉汤稀释法) 因操作简便,可作为临床微生物实验室检测AmpC 酶寻常筛选办法。AmpC酶表型筛选实验和氟氯西林双纸片扩散协同实验均运用纸片扩散法对产AmpC 酶菌株进行检测,操作简便,迅速省时,成果基本可靠,可以在各临床微生物实验室推广应用。三维实验和等电聚焦及氟氯西林抑制实验均是检测细菌胞体内AmpC 酶活性,不存在抗生素诱导作用,故检测是(去阻遏) 持续高产AmpC 酶,也可检测质粒AmpC 酶。尤其是三维实验是当前公认质粒AmpC 酶或(去阻遏) 持续高产AmpC 酶典型办法。但两种办法缺陷是需增菌、破碎菌细胞并提取酶粗提物,操作繁琐、费时,难以在临床微生物实验室常规应用。AmpC 酶基因检测是运用分子生物学办法测定待检细菌中特异性AmpC 酶基因序列办法,成果精确。缺陷仍是操作繁琐,并且需严格防止因污染导致假阳性或假阴性成果。参照文献1 Bush K，Jacoby GA ，Medeiros AA. A functional classification for2lactoamases and its correlation with molecular structure.Antimicrob Agents Chemother ，1995 ,39 :.2 赵虎,孔宪涛. AmpC 酶及其耐药性. 世界感染杂志，,2 :205.3 张永龙,李家泰,赵鸣武. AmpC 酶研究进展. 中华人民共和国临床药理学杂志,1999 ,15 :3812383.4 蒋燕群,王坚强,陈珊珊,等. 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒2内酰胺酶筛选. 上海医学检查杂志， ,16 :10212.5 周志慧,李兰娟,俞云松,等. 两种检测阴沟肠杆菌AmpC 酶方法比较. 中华检查医学杂志， ，25 :88290.6 Pai H ，Lyu S ，Lee J H ，et al. Survey of extended2spectrum2lactamases in clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiellapneumoniae：prevalence of TEM252 in Korea. J Clin Microbiol