ampcb内酰胺酶的分子生物学研究应用进展.doc

文章编号： () 045203
AmpC B-内酰胺酶分子生物学研究进展
蔡琰　综述　　范昕建　吕晓菊　审校
(四川大学华西医院传染科，　成都610041)
　　摘要：　AmpC B2内酰胺酶是属Bush 功能分类É 群,Ambler 分子分类C 类头孢菌素酶，重要由染色体介导
产生，不被克拉维酸抑制，能水解第三代头孢菌素、头霉素等广谱B2内酰胺类抗生素。AmpC B2内酰胺酶表达受
amp 复合操纵子调控，与肽聚糖合成密切有关。amp 复合操纵子由ampC、ampR、ampD 和ampG 构成，分别编码
AmpC B2内酰胺酶、转录调节因子AmpR,N 2乙酰葡萄糖胺2L 2丙氨酸酰胺酶AmpD 和膜结合转运蛋白AmpG。其
中AmpR 与UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽结合可抑制ampC 转录，与N 2乙酰胞壁酰酐三肽结合可激活ampC 转录。调
控基因突变及B2内酰胺类抗生素诱导作用均可使肽聚糖合成与水解反映失衡，导致N 2乙酰胞壁酰酐肽积聚，从
而使AmpC B2内酰胺酶产量提高。近年来，质粒编码AmpC B2内酰胺酶逐渐增多，源于肠杆菌科细菌，与染色
体编码AmpC B2内酰胺酶在分子构造上具不同限度同源性。AmpC B2内酰胺酶诱导产生及质粒编码
AmpC B2内酰胺酶浮现是细菌针对抗生素导致选取压力而进化成果，临床实践中必要慎用超广谱B2内酰胺
类抗生素。
核心词：　AmpC B2内酰胺酶；　B2内酰胺耐药性；　去抑制突变；　诱导作用
中图分类号：　Q 556+ . 4,Q 756　　　文献标记码：　A
收稿日期：211204
作者简介：蔡琰，女，生于1977 年，在读研究生研究生，重要从事感染性疾病及细菌耐药机制研究。
　　B2内酰胺类抗生素是临床惯用且有效抗感染
药物，但是细菌几乎对每一种新B2内酰胺类抗生素
都浮现了耐药性。产生B2内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌
最重要耐药机制[ 1 ]。当前新B2内酰胺酶中，以超广
谱酶( ex tended2spect rum beta2lactam ases，ESBL ) 和
AmpC B2内酰胺酶最具临床意义。ESBL 是由质粒介
导、能赋予细菌对各种B2内酰胺类抗生素耐药一
类酶[ 2 ] ，重要由大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌产生。
1　AmpC B-内酰胺酶发现和普通特性
AmpC B2内酰胺酶由革兰氏阴性杆菌产生，不被
克拉维酸抑制，因其优先底物是头孢菌素类抗生素又
称头孢菌素酶，属Bu sh 功能分类É 群,Am b ler 分子
分类C 类[ 3 ]。最初AmpC B2内酰胺酶由染色体介导自
然产生，重要见于阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质
沙雷氏菌及铜绿假单胞菌。1967 年Hennessey[ 4 ]报道
了一种阴沟肠杆菌产生可诱导B2内酰胺酶，即目
前所知染色体介导AmpC B2内酰胺酶。20 世纪
80 年代后来，许多质粒介导AmpC B2内酰胺酶被陆
续报道。依照能否被B2内酰胺类抗生素诱导,AmpC B2
内酰胺酶又可分为诱导酶和非诱导酶。后者存在于大
肠埃希氏菌及志贺氏菌中。而肠杆菌、摩氏摩根菌、弗
氏柠檬酸杆菌等细菌中,AmpC B2内酰胺酶可被诱导
产生，由于这些细菌中有AmpC B2内酰胺酶调节基
因ampR [ 5，6 ] ，而产生非诱导性AmpC B2内酰胺酶细
菌缺少该基因。据报道，将弗氏柠檬酸杆菌中ampC
与ampR 克隆至大肠埃希氏菌后，大肠埃希氏菌中
AmpC B2内酰胺酶可被诱导表达[ 7 ]。产AmpC B2内酰
胺酶细菌对第二和第三代头孢菌素类、头霉素类、单
环内酰胺类、酶抑制剂耐药，且肠杆菌科细菌往往同步
带有氨基糖苷类、氯霉素、四环素等药物耐药基因,
导致多重耐药，对于这些耐药株，碳青霉烯类抗生素是
最有效药物。
2　AmpC B-内酰胺酶基因表达调控机理（AmpC 酶是AmpCβ内酰胺酶简称。 是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌染色体或质粒介导产生一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler 分子构造分类法中C 类和Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制β内酰胺酶。故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。）

2. 1　amp 复合操纵子
AmpC B2内酰胺酶表达受amp 复合操纵子调
控，由4 个不持续基因ampC、ampR、ampD、ampG 构
成(图1)。ampC 是构造基因，编码AmpC B2内酰胺酶。
ampR 与ampC 相邻排列在染色体上，呈逆向转录，编
码AmpC B2内酰胺酶转录调节因子AmpR [ 8 ]。
AmpR 属ly sR 调节子家族，结合在ampR - ampC 间
区DNA 上，与ampC 启动基因及ampR 操纵基因直
接互相作用[ 9 ] ，在有诱导剂时起激活子作用，没有诱导
剂时起抑制子作用[ 9 ]。ampD 位于远处染色体上，编码
N 2乙酰葡萄糖胺2L 2丙氨酸酰胺酶(AmpD) ，参加粘肽
代谢。ampG 编码转膜蛋白AmpG，在AmpC B2内酰胺
酶表达调控中起向胞浆内传递诱导信号作用[ 10 ]。
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图1　　AmpC 表达调控
2. 2　AmpC B2内酰胺酶基因表达与肽聚糖代谢关系
AmpC B2内酰胺酶诱导与细胞壁代谢直接相
关[ 11 ]。在细胞代谢过程中，水解酶降解胞壁质产生N 2
乙酰葡萄糖胺2N 2乙酰胞壁酰三肽，具透性酶活性
AmpG 将其转至胞浆，继而被AmpD 水解，或先由细
胞质B2N 2乙酰氨基葡糖苷酶( cyto so lic B2N 2
acetylgluco sam in idase，Gm ase) 降解为N 2乙酰胞壁酰
三肽，再被AmpD 水解。两种水解方式均产生L 2丙氨
酰2D 2谷氨酰2消旋二氨基二酸三肽，参加粘肽循环，生
成胞壁质重要前体物质UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽[ 12 ]。
研究表白，UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽能与AmpR 结
合，变化其与ampC 启动基因联系，抑制其对RNA
聚合酶转录活性增进作用。N 2乙酰胞壁酰三肽则能
与UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽竞争与AmpR 结合，从而
解除其抑制作用，恢复AmpR 激活ampC 转录功
能[ 13 ]。由此可见,AmpC B2内酰胺酶表达受到胞浆
内这两种肽相对水平调控[ 11 ]。此外,D ietz 等[ 16 ]研
究发现N 2乙酰葡萄糖胺2N 2乙酰胞壁酰五肽也可被
AmpG 转运至胞浆，其水解产物N 2乙酰胞壁酰五肽
亦可取代UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽与AmpR 结合，使
AmpR 由抑制子变为激活子。
2. 3　调控基因突变
在正常生长条件下，野生型菌株中AmpR 重要与
UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽结合，ampC 转录处在受抑制
状态，只产生极微量酶。但是阴沟肠杆菌、弗氏柠檬
酸杆菌、铜绿假单胞菌等野生型群体在自然状态下就
可以10- 5～ 10- 7频率发生去抑制突变，其中完全去抑
制型AmpC B2内酰胺酶产量可比突变前提高1000
倍以上。去抑制突变重要是ampD 突变，产生有缺陷
AmpD，致使N 2乙酰胞壁酰三肽大量积聚于胞浆
内，而UDP2N 2乙酰胞壁酰五肽生成量减少，与AmpR
结合位点被取代,AmpR 变成激活子。使用B2内酰
胺类抗生素将清除敏感菌株，而突变株得以繁殖，成为
优势菌群。此为抗生素对去抑制突变株选取作用。
ampR 突变可产生缺陷型AmpR，不受诱导剂及其她
调节基因影响，失去调控ampC 转录能力,AmpC
B2内酰胺酶呈持续高表达。
3　B-内酰胺类抗生素诱导作用
B2内酰胺类抗生素能与细菌青霉素结合蛋白
(PBP) 形成共价键，抑制其活性。PBP 是位于细菌内膜
表面酶，参加肽聚糖合成。高分子量PBP la，1b，2,
3 为细菌生长所必须，PBP la，1b 为转肽酶及转糖苷
酶，催化多聚糖链延伸及肽聚糖交联。PBP2，3 为转肽
酶，PBP2 启动新生肽聚糖插入延伸位点，PBP3 特异
作用于横隔形成[ 12 ]。低分子量PBP4，5，6a，6b，7 非细
菌生长所必须，多为D 2羧肽酶，能使五肽侧链末端D 2
丙氨酸水解生成四肽。大肠埃希氏菌中有4 种不同
水解肽聚糖糖苷键酶，其中Slt70 能与PBP la，1b 和
2 作用，肽链交联能阻断Slt70 与肽聚糖链作用，从而
减少该酶活性[ 14 ]。周质间隙中B2内酰胺类抗生素与
PBP 结合导致肽聚糖合成与水解反映失衡。抗生素对
D 2羧肽酶PBP4，5，6a，6b 抑制导致肽聚糖中五肽侧
链水平升高；对PBP la，1b 和ö或2 抑制导致转肽酶
活性丧失，胞壁质中肽链交联水平下降，导致Slt70 等
水解酶进一步降解胞壁质[ 15 ]。因而周质间隙中N 2乙
酰胞壁酰肽积聚，其中最重要降解产物N 2乙酰胞壁
酰五肽被转运至胞质中[ 16 ] ，取代UDP2N 2乙酰胞壁酰
五肽与AmpR 结合，使AmpR 由抑制子变为激活
子[ 8 ]。抑制Slt70 活性可减少B2内酰胺类抗生素诱
导水平。B2内酰胺类抗生素诱导能力有明显差别：亚
胺培南是强诱导剂；第三代头孢菌素类为弱诱导剂，但
具选取性；氨曲南和三唑巴坦则没有诱导性。这种差别
和抗生素与PBP 亲和力不同关于。强诱导剂与PBP
亲和力远远高于非诱导剂，且必须抑制细菌所有
D 2羧肽酶及PBP la，lb 和ö或PBP2[ 19 ]。
4　质粒介导AmpC B-内酰胺酶
编码AmpC B2内酰胺酶基因常用于染色体上,
近年来浮现了向质粒转移趋势。质粒中ampC 没
有调控基因，呈持续高表达，且由于质粒迅速复制和
可转移性，导致了更多菌株耐药。第一种被报道
质粒介导AmpC B2内酰胺酶是M IR2l，据DNA 序
列分析，其来源于阴沟肠杆菌染色体。当前，质粒编
码AmpC B2内酰胺酶分布于世界各地，并以平均每
年发现l～ 2 个新质粒速度增长。J ing 等[ 17 ]发现了克
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雷伯氏菌产生新AmpC B2内酰胺酶CM Y28，其核
苷酸及氨基酸序列与CM Y21、MOX21 高度有关，也许
具备相似来源，且3 种酶底物轮廓高度相似，均介
导细菌对头孢噻吩、头孢噻肟高度耐药。
质粒编码与染色体编码AmpC B2内酰胺酶
具不同限度同源性(37%～ 99% )。阴沟肠杆菌、弗氏
柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌产生染色体编码AmpC
B2内酰胺酶分别与如下3 组质粒编码AmpC B2内酰
胺酶高度有关：CM Y2～ 3，LA T 1～ 4 (98% 氨基酸同
源) ;MR I(90% 氨基酸同源) ,ACT 21;DAH21。1999 年
Delph ine 等[ 19 ]发现蜂房哈夫尼菌产生染色体编码
AmpC B2内酰胺酶与来自肺炎克雷伯氏菌ACC2
1 有一定同源性。这些表白质粒编码AmpC B2内
酰胺酶源自肠杆菌科细菌[ 9 ]。但AmpC B2内酰胺酶如
何由染色体编码转向质粒编码仍不清晰，值得进一步研
究。
5　结束语
AmpC B2内酰胺酶分子生物学研究为寻找和设
计新型抗生素和酶抑制剂提供了新靶位。但从AmpC
B2内酰胺酶诱导产生及质粒介导AmpC B2内酰胺
酶浮现不难看出，随着越来越多新型抗生素应用
于临床，细菌也不断通过耐药性逃避厄运。耐药性是细
菌针对抗生素应用导致选取压力而进化必然结
果[ 18 ]。质粒或染色体介导耐药性普通只发生在少数
细菌内，只有当占优势敏感菌因抗生素选取作用
被消灭，耐药菌才干得以大量繁殖。抗生素广泛应用
特别是滥用导致了耐药性发展，因此控制耐药性不
能单纯寄但愿于开发和研制新抗生素，临床实践中
特别要注意严格掌握用药适应证，合理使用超广谱B2
内酰胺类抗生素，加强细菌耐药性监测及医院内严格
消毒隔离制度。
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© 1995- Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd. All rights reserved.作者单位:03 上海,第二军医大学附属长征医院实验诊断
科
·继续教诲园地·
AmpCβ内酰胺酶检测
赵虎　孔宪涛
　　AmpCβ内酰胺酶(简称AmpC 酶) 是由肠杆菌科细菌或
/ 和绿脓假单胞菌染色体或质粒介导产生一类β内酰胺
酶,属β内酰胺酶Ambler 分子构造分类法中C 类和Bush2
Jacoby2Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、
且不被克拉维酸所抑制β内酰胺酶。故AmpC 酶又称作
为头孢菌素酶[ 1 ,2 ] 。
AmpC 酶按其产生方式分为3 类:诱导高产酶、持续
高产酶和持续低产酶[ 2 ,3 ] 。(1) 诱导高产酶:AmpC 酶合成
往往与β2内酰胺类抗生素存在关于。绝大某些肠杆菌科
细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素
存在条件下) 只产生少量AmpC 酶。而当有诱导作用
β内酰胺类抗生素存在条件下,AmpC 酶产量明显增长,
增长范畴在100～1 000 倍之间。(2) 持续高产酶:另有一
某些产AmpC 酶菌株无论在有无β内酰胺类抗生素存在
条件下均可持续高水平产生AmpC 酶,其原由于去阻遏突
变,即调控基因之一ampD 基因发生突变,产生有缺陷
AmpD 蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR 蛋白结合形
成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起
AmpC酶大量表达。质粒介导AmpC 酶往往都属于此
类AmpC 酶。产生这种AmpC 酶细菌对临床危害最大,
是临床微生物实验室检测重点。(3) 持续低产酶:尚有极
少某些产AmpC 酶菌株,无论在有无β内酰胺类抗生素
存在条件下均持续低水平产生AmpC 酶,其因素也许是
另一种调节基因—ampR 基因发生突变，产生有缺陷
AmpR 蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在条件下起到
抑制子作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在条件下
起到激活子作用,故AmpC 酶得以持续低水平地表达。检
测不同类型AmpC 酶或检测产不同类型AmpC 酶菌株,
其办法也有所不同。
近年来,随着β内酰胺类抗生素、特别是头孢菌素广
泛应用,产AmpC 酶革兰阴性杆菌越来越多见,特别是出
现了(去阻遏) 持续高产AmpC 酶和质粒介导AmpC 酶,导
致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染治疗困难,已
引起临床高度注重,故检测AmpC 酶具备非常重要临床
意义。
当前已陆续报道了各种检测AmpC 酶办法,除改良
三维实验较为典型外,其她检测办法还不成熟,尚在摸索、
实验阶段,检测成果也各不相似。现讲述如下。
一、头孢西丁敏感实验[ 4 ]
AmpC 酶可以水解头孢西丁( FOX) ,即产AmpC 酶菌
株对头孢西丁耐药。而ESBLs 等其她β内酰胺酶普通不能
分解头孢西丁,即产ESBLs 菌株对头孢西丁敏感。运用
AmpC 酶这一特性,可以对产AmpC 酶菌株进行初步筛
选。
详细操作办法：(1) 纸片扩散法:按美国临床实验室原则
化委员会(NCCLS) 纸片扩散( K2 法进行。FOX 纸片
含量为30μg。判断原则为抑菌环< 18 mm ,表达待检菌株
对FOX耐药。(2) 稀释法:手工(微量) 肉汤稀释办法参照
NCCLS 办法进行;也可用MicroScan 等微生物分析仪进行
分析,操作办法按其操作规程进行。判断原则为MIC > 16
μg/ ml ,表达待检菌株对FOX耐药。对FOX 耐药菌株,应
怀疑产AmpC 酶也许。固然,不是所有对头孢西丁耐药菌
株都是产AmpC 酶菌株(当前产ESBLs 菌株对头孢西丁
耐药率已超过30 %) 。故此办法仅仅作为初步筛选。需
做三维实验或纸片协同实验等实验,进行进一步拟定。
二、AmpC 酶表型筛选实验[ 5 ]
依照AmpC 酶对大某些头孢菌素、特别是三代头孢菌素
耐药特性,选用各种头孢菌素纸片对产AmpC 酶菌株进
行表型筛选。可选用亚胺培南( IP) 、头孢吡肟( FEP) 、头孢
她啶/ 克拉维酸(CTD/ Cla) 、头孢噻肟(CTX) 和头孢噻肟/ 克
拉维酸(CTX/ Cla) 5 种抗生素纸片进行筛选实验。
详细操作办法按NCCLS K2B 法进行。
判断原则：(1) IP、FEP 敏感,而CTX、CTD/ Cla 和CTX/
Cla 耐药；(2) IP、FEP 敏感,而在CTX、CTD/ Cla 和CTX/ Cla
抑菌环内存在散在菌落；(3) IP 敏感,而FEP、CTD/ Cla
和CTX/ Cla 耐药。以上3 种成果提示,待检菌株产AmpC
酶。最后一种表型提示,待检菌株产AmpC 酶同步,产生
其她β内酰胺酶,如产ESBLs。
此办法操作简便、迅速省时,较三维实验简朴得多,成果
基本可靠,与三维实验符合率达89158 %。可以在各临床
微生物实验室推广应用。
三、氟氯西林(FCC) 双抑制剂扩散协同实验[ 6 ,7 ]
氟氯西林(FCC) 可抑制AmpC 酶活性,使产AmpC 酶
菌株不能及时水解和破坏头孢菌素,保存了这些抗生素
抗菌活性。运用这一特性,可选用FCC 与其她超广谱头孢
菌素( ESC) 进行双抑制剂扩散协同实验( double inhibitors
diffuse synergy test ，DIDST) ,观测其有无协同作用。因FCC
在琼脂中扩散能力较差,故实验过程中不直接选用FCC 纸
片,而是将FCC 药液直接加在空白纸片上进行扩散,这样才
· 0 9 3 · 中华检查医学杂志 年6 月第26 卷第6 期　Chin J Lab Med ，J une ，Vol 26 ，No1 6
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能观测到协同实验效果。
详细操作办法:在M2H 平板上均匀涂布待检菌株,中央
贴一空白纸片,并在其周边20～25 mm 处贴上CTD、头孢
曲松(CRO) 、头孢哌酮(CFP) 、氨曲南(ATN) 、CTX和CPI 纸
片,再在空白纸片上滴加10 mg/ ml FCC 20μl ,35 ℃孵育18
～24 h ,观测纸片之间抑菌环状况。
FCC 与任何一种头孢菌素协同为阳性,提示产AmpC
酶。
此办法与AmpC 酶表型筛选实验相仿,即采用纸片扩散
办法即可迅速检测AmpC 酶,操作简便、迅速省时。成果基
本可靠,可以在各临床微生物实验室推广应用。
四、三维实验[ 4 ,5 ,7 ,9 ]
三维实验也是运用AmpC 酶可以水解头孢西丁原理,
先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中β内酰胺酶提取
出来(粗提) ,观测这种酶粗提物对头孢西丁抑制状况。
如果粗提物中有AmpC 酶存在,即可抑制头孢西丁活性,
使其周边对头孢西丁敏感大肠埃希菌得以生长;反之,大
肠埃希菌受头孢西丁抑制则不能生长。
详细操作办法：(1) 制备β内酰胺酶粗提物:将待检菌
株接种在M2H 肉汤或胰蛋白大豆胨水中增菌,离心收集细
菌,用0101 mol/ L 磷酸盐缓冲液或PBS(pH710) 冲洗后制
成一定浓度细菌悬液,再用冻融法( - 70 ℃迅速冷冻、室温
或37 ℃水浴迅速解冻,重复5 次) 或超声粉碎法(4 ℃,超声
粉碎) 破碎菌细胞，使其菌体内酶释放出来，再离心
(12 ,000 r/ min ,1 h) 去除细菌碎片,收集上清液即为β内酰
胺酶粗提物。取某些上清液接种M2H 平板常规培养,证
实无活菌存在。再用头孢硝噻吩纸片拟定有β内酰胺酶
存在。(2) 三维实验:将大肠埃希菌原则菌株ATCC25922 按
NCCLS K2B 法涂布在M2H 平板上,在平板中央贴一张
FOX纸片,从距离纸片5 mm 处用无菌刀片在平板琼脂上
向外缘方向(离心方向) 切一裂隙(一块平板可切4～5 条裂
隙) ,每一裂隙中加入25～30μl 一种待检菌株β内酰胺
酶粗提物(注意β内酰胺酶粗提物不可溢出裂隙) ,35 ℃培养
18～24 h ,观测裂隙内侧端(头孢西丁纸片抑菌环内) 周
围有无细菌生长。
判断原则:裂隙内侧端周边有细菌生长、导致头孢西
丁纸片抑菌环有缺失者为阳性,表白该裂隙内β内酰胺
酶为AmpC 酶,也就是说这种待检细菌产AmpC 酶。
因运用酶粗提物而不是活菌做检测,不受抗生素诱
导影响,故三维实验是当前公认、较为典型检测(去阻
遏) 持续高产AmpC 酶办法,也是当前检测质粒AmpC 酶
最佳办法。但缺陷是需增菌、破碎菌细胞并提取酶粗提
物,操作繁琐、费时,难以在临床微生物实验室常规应用。
五、等电聚焦及氟氯西林抑制实验[ 5 ,9 ,10 ]
AmpC酶等电点相对集中,为610～1010 ,且大多≥
910 ,故可用物理办法先将其从待检菌细胞中释放出来,制成
酶粗提物,再用等电聚焦办法在琼脂糖凝胶板上将其与
其她β 内酰胺酶或其她蛋白成分分开。头孢硝噻吩
(nitrocephin) 是一种标记有硝基环头孢菌素,溶于水后呈
黄色,被β内酰胺酶(涉及AmpC 酶) 水解后呈红色。氟氯西
林可以抑制AmpC 酶活性,而对其她β内酰胺酶活性则
无明显抑制作用。若先用氟氯西林对凝胶板上酶进行
抑制,再用头孢硝噻吩进行显色反映,被抑制掉条带即可
能为AmpC 酶条带。
详细操作办法:用超声粉碎法制备待检细菌中β内酰
胺酶粗提物,再用Phastsystem 电泳法进行等电聚焦(用两份
同种β内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板,电泳条件完全相
同) 。将一用氟氯西林(1 mmol/ L) 浸润滤纸条覆盖在第
一块凝胶板(A 板) 上,而第二块凝胶板(B 板) 上仅覆盖用无
菌蒸馏水浸润滤纸条,30 s 后去除两块凝胶板上滤纸,
再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩(500μg/ ml) 滤纸条,1 min
后揭去滤纸条,观测凝胶板上各条带显色状况。
成果判断:如果A、B 两块凝胶板上条带颜色不同,即
在B 板上变色(由黄变红者) 、而在A 板上不变色(仍为黄
色) 条带,即为AmpC 酶,表白待检菌株产AmpC 酶。
与三维实验相似,该办法也是运用酶粗提物而不是活
菌作检测,不受抗生素诱导影响,也是用来检测(去阻遏)
持续高产AmpC 酶办法,也可检测质粒AmpC 酶。但缺陷
较三维实验更繁琐、费时,不适当在临床微生物实验室推广应
用。
六、AmpC 酶基因检测
AmpC 酶基因组是由一种构造基因—amp C 和4 种调
控基因———ampR、ampD、amp E 和amp G所构成[ 2 ,3 ] 。AmpC
酶基因存在于阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌、拘橼酸杆菌、大肠埃
希菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产
AmpC酶细菌染色体远端或质粒中。存在于不同细菌
中AmpC 酶基因其特定核苷酸序列都是相似,即无论
是构造基因ampC 还是各种调控基因,均有其特定核苷酸
序列。故通过查找待检细菌中有无特定AmpC 酶基因
片段(通过特异性基因引物，扩增待检细菌中特定
AmpC 酶基因片段,分析其特定核苷酸序列) ,即可拟定
待检细菌能否产AmpC 酶。
当前有报道可以检测AmpC 酶基因有ampC 基因
和ampD 基因[ 5 ,11 ,12 ] 。
详细操作办法：用煮沸法提取待检细菌DNA 或质粒
DNA ,再用PCR 法进行扩增(94 ℃1 min ，56 ℃1 min ,72 ℃3
min ,共35 个循环) 。扩增ampC 基因引物分别为:引物1
( 5′2CTGATGAAAGCCCAGTCTGT23′) 和引物2 ( 5′2
TTCGCGAGCATCACAATACC23′) ,扩增ampD 基因引物
分别为：引物3 (5′2CCGAGTAACAGCACCATAGA23′) 和引
物4 (5′2TATTGCGCATCGGTGTAAGG23′) 。收集扩增产物
(110 %琼脂糖凝胶电泳) ,经DNA 自动测序仪测定其核苷
酸序列,并与基因库中AmpC 酶ampC 基因或ampD 基因
序列进行分析、比较,最后得出成果。
判断原则:待检细菌中找出AmpC 酶特定基因片段
(ampC 基因或ampD 基因片段) ,表白该菌具有AmpC 酶
· 1 9 3 · 中华检查医学杂志 年6 月第26 卷第6 期　Chin J Lab Med ，J une ，Vol 26 ，No1 6
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基因,也许产生AmpC 酶。
AmpC 酶基因检测法可直接检测待检细菌中染色体
或质粒(两者提取办法不同) 上ampC 基因或ampD 基因
片段,判断细菌能否产AmpC 酶。不受表型和外界因素影
响,精确性高。特别是检测ampD 基因更故意义,由于不但
可以检测有无正常ampD 基因序列,判断能否产AmpC
酶;还可检测突变ampD 基因序列,判断能否产生(去阻
遏) 持续高产AmpC 酶。但该办法实验操作仍较繁琐,只
适合于科学研究工作。
以上综述了当前检测AmpC 酶各种办法。头孢西丁
敏感实验(涉及纸片扩散法和肉汤稀释法) 因操作简便,可作
为临床微生物实验室检测AmpC 酶寻常筛选办法。AmpC
酶表型筛选实验和氟氯西林双纸片扩散协同实验均运用纸
片扩散法对产AmpC 酶菌株进行检测,操作简便,迅速省
时,成果基本可靠,可以在各临床微生物实验室推广应用。
三维实验和等电聚焦及氟氯西林抑制实验均是检测细菌胞
体内AmpC 酶活性,不存在抗生素诱导作用,故检测
是(去阻遏) 持续高产AmpC 酶,也可检测质粒AmpC 酶。尤
其是三维实验是当前公认质粒AmpC 酶或(去阻遏) 持续
高产AmpC 酶典型办法。但两种办法缺陷是需增菌、破碎
菌细胞并提取酶粗提物,操作繁琐、费时,难以在临床微生
物实验室常规应用。AmpC 酶基因检测是运用分子生物
学办法测定待检细菌中特异性AmpC 酶基因序列办法,
成果精确。缺陷仍是操作繁琐,并且需严格防止因污染导致
假阳性或假阴性成果。
参照文献
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5 周志慧,李兰娟,俞云松,等. 两种检测阴沟肠杆菌AmpC 酶方
法比较. 中华检查医学杂志， ，25 :88290.
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pneumoniae：prevalence of TEM252 in Korea. J Clin Microbiol