基于扩展型无创产前筛查技术发现软骨发育不全症1例_陈祥.pdf

doi:1013819/jissn2096708X202302019引用本文格式:陈祥，熊秀，刘启胜，等基于扩展型无创产前筛查技术发现软骨发育不全症 1 例J湖北医药学院学报，2023，42(2):197200基于扩展型无创产前筛查技术发现软骨发育不全症 1 例陈祥1，熊秀2，刘启胜3，管建4，陈卉1，姜锋5，段洁6，7，8(1鄂州市妇幼保健院，湖北 鄂州436000;2武汉市江夏区妇幼保健院，湖北 武汉430200;3湖北科技学院附属咸宁市中心医院，湖北 咸宁437100;4孝感市妇幼保健院，湖北 孝感432000;5安诺优达基因科技(北京)有限公司，北京100176;6武汉大学中南医院产科，湖北 武汉430071;7湖北省产前诊断与优生临床医学研究中心，湖北 武汉430071;8武汉市生殖健康和优生临床医学研究中心，湖北 武汉430071)关键词 软骨发育不全;显性单基因遗传病;FGF3;扩展型无创产前筛查;孕早期 基金项目 鄂州市科技计划项目(EZ0100220210113)通信作者 段洁(1987)，女，新疆昌吉人，主治医师，博士，研究方向:妇产科学。Email:jieduan131 hotmailcom软骨发育不全(achondroplasia，ACH)是短肢型侏儒中最常见的类型，在活产儿中的发生率约为 1 16 0001 28 0001。患者表现为非匀称性身材矮小、特征性面容(头颅大且伴前额突出)、腰椎前凸、手肘伸展受限、膝内翻和三叉手等，其智力和生育能力通常与常人无异2。由于目前仍缺乏治疗ACH 的有效药物，因此早发现、早干预是降低 ACH患儿发生率的有效手段。超声影像和分子遗传学技术是目前临床上常用于检测软骨发育不全的两种产前检测手段。超声影像具有无创性、重复性好和准确性高等优点3，但缺点在于发现时通常胎儿已处于孕晚期，可采取的干预措施较为有限。而分子遗传学技术受孕周影响较小，可在孕早期或中期实现精准的 ACH 检测4，因此在产前疾病检测领域越来越受到重视和普及。1病例资料孕妇，28 岁，G1P0。孕妇身高 155 cm，无任何软骨发育异常表征。夫妻双方非近亲结婚，均否认家族遗传病史和孕前用药史等。实施扩展型无创产前筛查前获得了孕妇的书面知情同意。11超声筛查孕妇于 2019 年 6 月 21 日在湖北省恩施华龙总医院就诊并行超声 NT 筛查，NT 结果未见异常，超声测值估测的孕周为 12+3周，与根据孕妇末次月经(2019 年 3 月 19 日)所推测的临床孕周相符。随后孕妇于 22+2周和 26+2周分别在湖北省宣恩县人民医院和湖北省恩施华龙总医院进行了常规产前超声检查，但均未提示任何骨骼发育异常。31+3周时，孕妇于恩施土家族苗族自治州中心医院行常规超声检查，首次提示股骨长和肱骨长小于 2 个正常标准差(2SD)，该结果进一步在湖北省妇幼保健 院(32+5)、宜昌市第一人民医院(34+5)以及武汉大学人民医院(34+6)的复诊中得到确认(表 1)。经过医师咨询后，孕妇选择继续妊娠，最后于 39+6周分娩一女婴，具有典型的 ACH 新生儿临床特征，即出生时头部和躯干一般表现正常，但四肢呈现不成比例的短小。由于患儿没有观察到其他并发症，观察 1 d后出院。12扩展型无创产前筛查以及 Sanger 测序情况孕 12+4周采集孕妇外周血 5 mL，并使用二次离心法分离血浆和血细胞。使用血浆 cfDNA 提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司 从孕妇血浆中提取 cfDNA。扩展型无创产前筛查结合了扩增子测序技术和普通 NIPS 技术，其中扩增子测序技术参考了文献 5 并进行了改进:根据 FGF3 和 FG-F2 基因上 7 个致病位点设计引物(表 2)，使用cfDNA 作为模板进行多重 PC，扩增条件为:25 10 min;95 2 min;98 15 s、60 5 min，运行 25791陈祥，等基于扩展型无创产前筛查技术发现软骨发育不全症 1 例个循环;4 永久。再将扩增产物与 cfDNA 按一定比例混合用于后续建库。建库使用的是 T21/T18/T13 三体检测试剂盒(国械注准:20173400331)，测序在 Nextseq 550A 平台进行。下机数据进行 5 种单基因病的位点分析、染色体非整倍体以及 10 Mb以上的拷贝数变异分析。表 1产前超声检测胎儿股骨和肱骨长度表(mm)临床孕周检测单位股骨长肱骨长超声孕周12+3恩施华龙总医院12+322+2宣恩县人民医院35(21+1)33(21+2)22+226+2恩施华龙总医院44(NA)40(NA)26+0*31+3恩施土家族苗族自治州中心医院48(NA)47(NA)30+2*32+5湖北省妇幼保健院50(26+6)47(27+3)30+2*34+5宜昌市第一人民医院52(27+5)47(27+5)32+5*34+6武汉大学人民医院54(NA)48(NA)34+2注:*号表示超声提示长骨短小;括号内的数字为股骨或肱骨所对应的理论孕周;NA 为未给出理论孕周表 2单基因病致病基因位点及其引物序列表单基因病基因位点扩增引物软骨发育不全FGF3c1138GAF:CAGTGTGTATGCAGGCATCCc1138GC:AGGCGGCAGAGCGTCACA软骨发育不良FGF3c1620CAF:TGAAGATGATCGGGAAACACAAAAACc1620CG:AGGAGGGCCGCCCAGC致死性骨发育不全FGF3c1949ATF:CGTGCACAACCTCGACTAC:TGTGGGAAGGCGGTGTTGApert 综合征FGF2c755CGF:TTTCTTCCCTCTCTCCACCAGc755CT:CTACGTCTCCTCCGACCACc758CGJacksonWeiss 综合征FGF2c866ACF:GGTTTACAGTGATGCCCAGC:AACCTTGAGGTAGGGCAGCc1031CGF:GAGGACGCTGGGGAATATACG:AAAGAACAGTATATACCTGGCAGAAC由于孕妇不同意抽取羊水行产前诊断，因此待胎儿出生后，经同意取其足跟血并提取基因组DNA，同时对父母取全血 5 mL 提取基因组 DNA。PC 扩增的上下游引物分别为 5TCACTGGCGT-TACTGACTGC3和 5ACCCTAGGCTCTACATGGT-GA3。反应体系为 50 L，包括 10PC Buffer 5L，25 mmol/L dNTP 4 L，5 U/L LATaq 04 L，上下游引物各 2 L，DNA 模板 50 ng，无菌水补足至50 L。PC 反应程序为 95 预变性5 min;945 变性 20 s，62 退火 20 s，72 延伸 40 s，此过程为40 个循环;最后 72 延伸 5 min。PC 产物送至诺赛基因进行 Sanger 测序。结果显示，21、18 和 13三体均为低风险，亦无其他染色体异常以及 10 Mb 以上的拷贝数变异;而 FGF3 基因的 1138 位点发现存在 GA 突变，其余 6 个位点无异常。Sanger 测序验证患儿 1138 位点为 G/A 杂合，其父母均为野生型 G/G(图 1)。891湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)注:A:胎儿的 1138 位点为 G/A 杂合;BC:孕妇及其配偶的 1138 位点为 G/G 纯合;黑色箭头为突变位点图 1Sanger 测序图2讨论ACH 是一种常染色体显性单基因遗传病，其相关致病基因为 FGF3，研究显示超过 99%的 ACH 患者是由于 FGF3 基因的第 1138 位碱基由 G 变成了A 或 C，其中 GA 约占98%99%，GC 约占1%6。两种突变均导致第 380 位氨基酸从甘氨酸变成精氨酸，造成 FGF3 持续活化，抑制软骨内成骨过程7。目前已有几种产前筛查的技术见于文献报道，包括 PC限制性酶切法(PCED)8、高分辨率溶解曲线分析法9、质谱法10、微滴数字 PC 法11 以及高通量测序法等。高通量测序技术由于具有极高的灵敏度和特异度，一直受到临床检测领域的关注。任远等12 针对 ACH 和致死性骨发育不全的热点突变建立了一套扩增子测序技术方法，在模拟样本中的检测灵敏度和特异度均达到 100%，适用于3%以上胎儿浓度的无创产前预测。Wang CY 等13 建立了一套检测 11 种常见的骨骼发育异常的扩增子测序技术体系，适用于 25%以上的胎儿浓度的母血样本，灵敏度和特异度均达到 100%。Chitty LS等14 以 ACH 和致死性骨发育不全高危孕妇人群为研究对象，将 PCED 与扩增子测序技术进行了比较，发现后者的准确性明显高 于 PC ED(88.6%vs 962%)。鉴于高通量测序技术的卓越表现，我们也建立了一套针对 5 种显性单基因病的扩增子测序技术，并将其融入普通 NIPS 实验流程，可以一次性筛查 5种显性单基因病、染色体非整倍体和 10 Mb 以上的拷贝数变异。我们利用该技术成功在孕 12+4周发现了此例由 FGF3 基因1138GA 突变所致的 ACH 胎儿，初步表明其在无创产前检测中的潜在应用价值。然而由于 ACH 发病率较低、临床案例获取较为困难，对于 ACH 以及其他 4 种单基因病的灵敏度、特异度等均无法进行有效统计，因此还需要接受长期的临床检验。参考文献 1Horton WA，Hall JG，Hecht JT AchondroplasiaJ Lancet，2007，370(9582):162172 2Kubota T，Adachi M，Kitaoka T，et alClinical practiceguidelines for achondroplasia J Clin Pediatr Endocri-nol，2020，29(1):2542 3潘晓玲超声诊断胎儿软骨发育不全的临床价值 J 中国临床新医学，2012，5(12):11551156 4Terasawa S，Kato A，Nishizawa H，et alMultiplex PCin noninvasive prenatal diagnosis for FGF3 relateddisorders J Congenit Anom(Kyoto)，2019，59(1):410 5en Y，Zhao J，Li，et alNoninvasive prenatal test forFGF3related skeletal dysplasia based on nextgener-ation sequencing and plasma cellfree DNA:Test per-formance analysis and feasibility exploration J PrenatDiagn，2018，38(11):821828 6Savarirayan，Ireland P，Irving M，et alInternationalConsensus Statement on the diagnosis，multidisciplinarymanagement and lifelong care of individuals with achon-droplasia J Nat ev Endocrinol，2022，18(3):173189 7Ornitz DM，LegeaiMallet LAchondroplasia:Develop-ment，pathogenesis，and therapyJ Dev Dyn，2017，246(4):291309 8Chitty LS，Griffin D，Meaney C，et alNew aids for thenoninvasive prenatal diagnosis of achondroplasia:Dys-morphic features，charts of fetal size and molecular con-firmation using cellfree fetal DNA in maternal plasma J Ultrasound Obstet Gynecol，2011，37(3):283 289 9Vivanti AJ，Costa JM，osefort A，et alOptimal nonin-vasive diagnosis of fetal achondroplasia combining ultra-sonography with circulating cellfree fetal DNA analysis J Ultrasound Obstet Gynecol，2019，53(1):8794 10Chen J，Yu C，Zhao Y，et alA novel noninvasive de-tection method for the FGF3 gene mutation in mater-nal plasma for a fetal achondroplasia diagnosis based onsignal amplification by heminMOFs/PtNPsJ Bio-sens Bioelectron，2017，91:892899 11张鑫悦孕早中期胎儿肢体短小病因分析及胎儿软骨发育不全无创检测 D 北京:中国人民解放军医学院，2019991陈祥，等基于扩展型无创产前筛查技术发现软骨发育不全症 1 例 12任远，高雅，卢彦平，等新一代测序技术无创产前检测胎儿 FGF3 基因突变J 解放军医学院学报，2017，38(1):1418，21 13Wang CY，Tang YA，Lee IW，et al Development andvalidation of an expanded targeted sequencing panel fornon invasive prenatal diagnosis of sporadic skeletaldysplasiaJ BMC Med Genomics，2021，14(Suppl3):212 14Chitty LS，Mason S，Barrett AN，et alNoninvasive pre-natal diagnosis of achondroplasia and thanatophoric dys-plasia:Nextgeneration sequencing allows for a safer，more accurate，and comprehensive approach J PrenatDiagn，2015，35(7):656662 收稿日期20220531(本文编辑:邴云云)doi:1013819/jissn2096708X202302020引用本文格式:袁杰，杨丽，张华，等乳腺癌术后胸壁肿物的诊治策略(附 1 例病例报告)J 湖北医药学院学报，2023，42(2):200202乳腺癌术后胸壁肿物的诊治策略(附 1 例病例报告)袁杰1，杨丽2，张华1，张丹峰1，黄军1，王群1(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院1乳腺甲状腺血管外科;2检验部，湖北 十堰442000)关键词 乳腺肿瘤;胸壁肿物;胸骨转移;内乳淋巴结复发 基 金 项 目湖 北 省 教 育 厅 科 研 计 划 指 导 性 项 目(B2020365);十堰市太和医院院级科研项目(2022JJXM034)通信作者王群(1976)，男，湖北十堰人，副主任医师，硕士，研究方向:乳腺癌的临床诊疗。Email:mmy8696 163com乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，是女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌致死的主要原因是远处转移，晚期乳腺癌中约 60%75%的患者发生骨转移，以胸腰段椎骨与骨盆的转移最多见，发生率分别为 647%与 412%1，骨转移多与内脏转移合并存在，仅发生骨转移的患者约占 27%50%2。笔者经治了 1 例乳腺癌术后胸壁肿物的患者，初步诊断为胸壁复发，经详细诊治后诊断为孤立性胸骨转移的晚期乳腺癌。结合文献报道，本文重点对乳腺癌术后胸壁肿物的诊治策略进行阐述。1临床资料患者，女，53 岁，因“左乳癌术后 5 年，发现胸壁肿物逐渐增大伴疼痛 6 月”入院。患者 5 年前于当地医院行“左侧乳腺改良根治术”(术后病检不详)，自诉术后行化疗，具体方案不详，化疗结束后行放疗，后规律行内分泌治疗(他莫昔芬)。6 月前无意中发现胸壁肿物，大小约“核桃”，自觉肿物逐渐增大，目前约“桃子”大小，伴“咳嗽”时胸部疼痛。查体见胸壁近胸骨中段一质硬肿物，大小约 50 cm5.0 cm，边界不清，表面粗糙，不可推动。2022 年 3月 23 日于十堰市太和医院乳腺甲状腺血管外科就诊，彩超示:胸壁近胸骨中段水平左侧肌肉层见大小52 mm48 mm30 mm 椭圆形不均质中等回声，内密集分布斑点状强回声，提示左侧胸壁肿物:胸壁复发?入院后完善相关检查，血常规、肝肾功能、电解质、颅脑 CT、心电图、子宫附件彩超、泌尿系彩超、腹部彩超未见异常。血脂:总胆固醇、甘油三酯升高。性激素为绝经后水平。肿瘤标志物:癌胚抗原10.04 ng/mL(05 ng/mL)，糖类抗原 CA153 399U/mL(014 U/mL)，余未见明显异常。骨放射性核素显像示胸骨骨质代谢活跃不均，考虑肿瘤骨转移可能，胸壁复发侵犯胸骨不能除外(图 1)。胸部CT 示:双肺未见明显异常，胸骨柄及胸骨体骨质破坏并不规则软组织肿块，贯穿胸壁内外，较大层面大小约 56 mm51 mm37 mm(影像学诊断:左侧乳腺癌术后改变，胸骨转移?)(图 2A)。进一步完善胸骨 MI 示:胸骨见团状占位，境界模糊，范围约 64002湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)