一株真菌产生的强抗癌活性新的山酮类化合物及其作用机制的研究应用.doc

一株真菌产生强抗癌活性新山酮类化合物及其作用机制研究

路新华，郑智慧，可爱兵，马瑛，范玉玲，朱京童，林洁，李业英，崔晓兰，张华，贺建功
（华北制药集团新药研究开发公司，微生物药物国家研究工程中心，石家庄050015 ）

目：发现新抗肿瘤先导化合物，并对其进行进一步抗癌机制研究。办法：运用MTT抗肿瘤细胞增殖筛选办法从微生物次生代谢产物中筛选具备抗肿瘤化合物，运用各种色谱手段分离活性化合物,通过化合物理化性质及波谱数据分析进行构造鉴定；并运用细胞形态、流式细胞仪、caspase 3/7活性在细胞周期、凋亡诱导效应、凋亡诱导机制等方面对其进行了抗肿瘤机制研究。成果：从一株真菌F02Z-1593固体发酵产物得到5个山酮类化合物F02Z-1593 I、J、T、U和V，其中1593 I、T、U分别鉴定为Austocystin D、H、F， 1593 J和V为新化合物；5个化合物均体现出较好体外抗肿瘤和抑制血管内皮细胞增殖活性，并且对正常细胞人胚肝细胞体现出较低细胞毒作用。新化合物1593 J将肿瘤细胞周期阻滞在G1期，并引起细胞明显变圆、皱缩和核固缩等凋亡现象。1593 J能剂量和时间依赖地增长细胞中caspase 3/7活性。结论：分离得到两个新F02Z-1593J和V和三个已知山酮类化合物，该类化合物通过caspase 3/7途径诱导肿瘤细胞和血管内皮细胞凋亡起抗癌作用。
核心词：Austocystin；细胞凋亡；山酮；caspase

ABSTRACT Objective：To discover new anticancer compounds and study their active mechanism. Methods：Screening anticancer compounds from microbial metabolites by measuring the antiproliferation effects on MCF-7 cell line by MTT method. The active compounds were isolated and purified by various chromatographic techniques and their structures were elucidated based on analysis of physicochemical properties and spectroscopic data. Results：Five active xanthones named F02Z-1593 I，J，T，U，V were isolated from the solid fermentate of fungus F02-1593. F02Z-1593 I，T，U were identified as known compounds Austocystin D，H and F respectively and F02Z-1593 J and V were two novel ones. All of the five compounds showed strong inhibitory activity against human cancer cell lines and vascular endothelial cell ECV304，while had low toxity to normal human embryo hepatocyte L02 in vitro. F02Z-1593 J could arrest the cell cycle at phase G1，and induce the activities of caspase 3/7 in human cancer cells in dose and time dependent manner. Conclusion：Five anticancer xanthones were obtained . Among them two were novel and the other three were known. They play anticancer effect by induction apoptosis of tumor and vascular endothelial cell lines through activation of caspase 3/7 pathway.

KEY WORDS：Xanthones；Austocystin；anticancer；caspase；apoptosis

癌症是人类最严重致死性疾病之一。在国内，癌症已长期居于病死因素之首。进入新世纪以来，这一危险趋势不但没有得到有效遏制，反而随着人类接触到致病因素不断增多而日益严重。寻找高效抗癌新化合物、新构造、新作用靶点始终是国际新药研发热点。
本研究运用体外肿瘤细胞增殖抑制筛选办法，从一株真菌F02Z-1593发酵产物中分离得到5个山酮类化合物F02Z-1593I、J、T、U和V，其中F02Z-1593J和V为新构造化合物。本文就这5个化合物分离、纯化、构造解析，其抗肿瘤活性以及其抗肿瘤诱导凋亡机制进行了阐述。
1 材料与办法
1.1 筛选用微生物菌株
真菌菌株由本研究室从云南、四川和广西采集土壤中分离得到。筛选用样品为这些菌株发酵产物。
1.2 试剂及仪器
RPMI-1640，培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(购于华美生物工程公司)。肿瘤细胞株HT29、MCF、MDA-MB-231、Hela，人胚肝细胞L02以及人脐静脉内皮细胞ECV304均购自于美国ATCC，均在含10%小牛血清RPMI-1640、5%CO2饱和湿度、37℃条件下培养,并保存于本室。
Caspase-3/7四肽荧光底物Ac-DEVD-AMC和Hochest3328购自于sigma公司
色谱试剂购自Merck公司；Victor２ 1420多标计数仪（PE）；中压层析系统（BUCHI）；高效液相系统（Waters 515×2+ PDA）；液相色谱柱： Phenomenex C18 21.2×250mm，10μm；核磁共振仪 500MHz（Inova，Varian）质谱仪（Micromass，Waters）；流式细胞仪（BECKMAN COULTERⅡ，USA）。
1.3 真菌F02Z-1593培养
将菌株F02Z-1593斜面接种于种子培养基（淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O　0.1％，NaCl 0.2%，pH7.0），27℃，220rp，摇瓶培养3天。按1%接种量接种到固体培养基 (大米97.5%，黄豆饼粉2.5%) 27℃培养14天。
1.4 F02Z-1593提取分离
F02ZA-1593固体培养物2 kg，用4L乙酸乙酯萃取，减压蒸去溶剂得到红褐色油状物9g。上述粗提物经硅胶柱（φ2.6×50cm）色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱，每50 ml收集一管，合并活性组分，减压蒸干。各某些活性物质使用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(Pharmcia，φ16×50mm ) 进一步分离纯化，制备型HPLC进行单组分制备[流动相为CH3CN-(1‰CF3COOH)H2O（30~70%）， 流速为16ml/min]，得到化合物F02-1593I、J、T、U、V。
1.5 细胞增殖抑制活性测定
将培养瓶中培养好肿瘤细胞株胰酶消化、计数，以每孔约为1-2×104 细胞数铺板，并加入不同稀释浓度测试样品，5% CO2、37℃条件下孵育72 h后,运用MTT法进行细胞增殖抑制活性测定。细胞增殖抑制率按如下公式计算：细胞增殖抑制率=(1-实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100%。IC50为细胞增殖抑制50%样品浓度。
1.6化合物对肿瘤细胞细胞及细胞核形态变化影响
以每孔约为1-2×104 细胞数铺板，并加入不同稀释浓度测试样品，培养1天后，在电镜下观测细胞形态变化并拍照；细胞与样品共孵育培养一定期间后，运用4%甲醛固定20分钟，然后并用1µg/mlHochest 33258荧光染色剂进行细胞核染色15分种。荧光显微镜下观测并拍照记录。
1.7 流式细胞对细胞周期和凋亡分析
不同药物浓度或药物不同解决时间后收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。3ml PBS洗一次。离心去PBS，加入冰预冷70％乙醇固定，4℃，1h。离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。用1ml （含5mg/ml PI，0.1% RNase A）PI染液，4℃避光30min。上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡分析检测。
1.8细胞中caspase 3/7活性影响测定
样品解决3天后，收集细胞，并用PBS洗涤一次，加入细胞裂解液，保温15min后加caspase-3/7四肽荧光底物Ac-DEVD-AMC，37°C反映2h。分析荧光强度（激发光波长355nm，发射光波长为460nm）。依照释放荧光强度大小，测定caspase-3/7活性。

2 成果
2.1 F02Z-1593 I、J、T、U、V理化性质及构造鉴定
F02Z-1593 I、J、T、U、V均为淡黄色粉末或细小针晶，易溶于氯仿和二甲基亚砜，溶于甲醇、丙酮， UV（MeCN）光谱显示它们吸取相似，均在225，254，325nm附近有三个吸取峰，推测它们为同类物质。ESI-MS给出F02Z-1593 I、T、U质核比分别为413.2，395.2，327.2[M+H]+，依照MS、1H、13C–NMR数据分析结合数据库检索拟定它们分别与Austocystin D[1] [2]、H[1] [2]、F[3]相似，化学构造见Figure 1。
图1 F02Z-1593 I，J，T，U and V化学构造
Figure 1 Chemical structures of F02Z-1593 I，J，T，U and V

F02Z-1593 J：ESI-MS成果显示F02Z-1593 J 分子量比F02Z-1593 I 大16，13C –NMR显示它们具备相似碳原子个数，并且除δ63.7碳信号代替了δ23.5碳信号外，其他13C –NMR数据基本相似，推测两个化合物具备相似母核，区别仅是在侧链上多一羟基。依照HMQC拟定了侧链上碳与氢连接，HMBC中连氧碳上氢与C5，6，10a有关阐明侧链连在C-5上，羟基连在C1”上，依照H-H COSY中H-1”与H-2”有关以及HMBC中H-2”与C-1”,3”,4”,5”,5有关拟定了侧链连接顺序，最后拟定了F02Z-1593 I化学构造(见Figure 1)。通过2D NMR数据分析并与F02Z-1593 I核磁数据比较对化合物F02Z-1593 J1H、13C–NMR数据进行了全归属，成果见Table 1。
F02Z-1593 V：ESI-MS给出F02Z-1593 Vm/e为359.1[M-H]-，同位素峰是m+2且高度达到分子离子峰1/3左右，阐明分子中具有氯原子，与F02Z-1593 U 相比较，分子量多34，推测F02Z-1593 U分子中其中一种H被Cl取代。1H–NMR中， 除化合物U 中三个相邻H变成了V中两个相邻H；13C-NMR中，除7，8位碳位移值变化较大外（δ111.1和160.4分别变化为δ115.1，156.2），1H 、13C-NMR其他数据与F02Z-1593U基本相似，因而拟定化合物F02Z-1593 V 为氯代Austocystin F。氯原子取代位置依照HMBC有关关系拟定，HMBC谱显示8-OHH与季C7有有关，与苯环上两个连HC没有浮现明显有关信号；H6与C8有有关，H5与C10a有关但与C8无有关，由此断定Cl原子取代位置在8-OH邻位C7上，至此拟定了F02Z-1593V化学构造（见Figure 1）并对其1H、13C–NMR数据进行了全归属（见Table 1）。
经Scifinder数据库检索没有发现与F02Z-1593 J和V构造相似化合物，因而拟定该两个化合物为新化合物，分别命名为Austocystin K 和Austocystin L。

表1. 化合物F02Z-1593 J 和 V1H (500MHz)和13C (125MHz)数据归属表

Table 1. 13C (125MHz) and 1H (500MHz) NMR assignments for F02Z-1593 J and V
position
1593-J**
1593-V*
δc
δH J (Hz)
COSY
HMBC (H to C)
δc
δH J (Hz)
COSY
HMBC (H to C)
1
157.2

157.7

1 –OH

12.20(1H，s)

C-1,2,9a

12.12

C-1,2,9a
2
112.0

111.1

3
166.3

167.1

4
90.4
6.65(1H，s)

C-2,3,4a,9a,9
91.0
6.47(1H，s)

C-2,3,4a,9a
4a
157.7

158.8

5
124.8

107.8
6.89(1H，d，8.9)
H-6
C-7,8a,10a
6
134.6
7.83(1H，d，8.5)
H-7
C-1”,8,10a
137.0
7.66(1H，d，8.9)
H-5
C-7,8,10a
7
110.5
6.85(1H，d，8.5)
H-6
C-5,8,8a
115.1

8
158.8

156.2

8 –OH

11.63(1H，s)

C-7,8,8a

12.37(1H，s)

C-7,8,8a
8a
106.3

107.9

9
184.5

184.5

9a
103.0

103.4

10a
150.9

154.4

1’
88.4

89.6

1’ –OH

2’
106.6
5.62(1H，d，3.0)
H-3’
C-1’,3’,5’
106.0
5.70(1H，d，2.7)
H-3’
C-1’,3’,5’
3’
148.3
6.78(1H，d，3.0)
H-2’
C-1’,2’,5’
149.1
6.58(1H，d，2.7)
H-2’
C-1’5’
5’
117.3
6.42(1H，s)

117.5
6.45(1H，s)

1”
63.7
5.37(1H，br)
H-2”
C-2”,5,6,10a

1” –OH

5.38(1H，br)

C-5,1”,2”

2”
50.5
1.71(2H，br)
H-1”
C-1”,3”,4”,5”,5

3”
69.8

3” –OH

4.67(1H，br)

C-2”,3”4”,5”

4”
29.2
1.30(3H，s)

C-2”,3”,5”

5”
30.4
1.19(3H，s)

C-2”,3”,4”

*In CDCl3 **In CD3OD

2.2 F02Z-1593I、J、T、U和V对细胞增殖抑制活性
F02Z-1593I、J、T、U和V对结肠癌HT29、乳腺癌MCF、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela等肿瘤细胞株以及对肝细胞LO2抗增殖活性见表3. 5个化合物对HT29、MCF、乳腺癌MDA-MB-231均体现出较好增殖抑制活性，其IC50在0.007-6.0µg/ml，但对宫颈癌Hela抑制活性很弱，其IC50〉50ug/ml。为了验证该类化合物毒性，本研究测定5个化合物对正常肝细胞L02抑制作用，成果表白该类化合物对正常细胞体现较低毒性，其IC50不不大于100µg/ml

表2. F02Z-1593 I，J，T，U and V对各种肿瘤细胞株和正常细胞L02抑制IC50 (µg/ml)
Table 2. The antiproliferation activities of F02Z-1593 I，J，T，U and V on cancer cell lines and human embryo hepatocyte L02
细胞株
1593-I
1593-J
1593-T
1593-U
1593-V
HT29
0.007±0.001
0.02±0.004
0.20±0.03
6.1±0.32
1.9±0.2
MCF
0.25±0.04
1.6±0.22
0.05±0.02
6.0±0.48
6.0±0.33
MDA-MB-231
11.4±2.01
15.6±1.24
15.4±1.76
25.4±2.82
22.8±3.01
Hela
〉50
〉50
〉50
〉50
〉50
L02
〉100
〉100
〉100
〉100
〉100
2.3 F02Z-1593 J对结肠癌细胞HT29细胞形态变化影响
F02Z-1593J是本研究发现一种新山酮化合物，对结肠癌细胞株HT29体外体现出极强抗增殖活性，IC50为0.007±0.001µg/ml。因此，运用该化合物在结肠癌HT-29细胞株上进行了系列抗肿瘤机制研究。
用10µg/ml-0.1µg/mlF02Z-1593J解决结肠癌细胞，加药6小时后，细胞开始浮现明显细胞变园、皱缩和细胞黏附性减少现象，并有大量细胞浮现悬浮，并且这种效应具备较好浓度依赖关系（见图2）。这些现象是典型细胞凋亡凋亡特性。

图2. F02Z-1593J对结肠瘤细胞形态影响
Figure 2. The effects of F02Z-1593J on the morphology of HT-29 cells
2.4 F02Z-1593J对肿瘤细胞核形态影响
HO33258 (Hoechst 33258)是惯用DNA特异性染料,可以鉴定凋亡细胞细胞核染色质高度凝聚、边沿化或凋亡小体等典型凋亡形态[4，5]。从本研究成果（图3）可以看出经F02Z-1593J解决后，大量细胞中细胞核呈固缩状态，并且这种固缩细胞数量与F02Z-1593J浓度呈较好浓度依赖关系。

DMSO
0.10 µg/ml

0.01 µg/ml

10 µg/ml

图3. F02Z-1593J对肿瘤细胞核影响

Figure 3 The induced effects of F02Z-1593J on cell nuclear condense in HT-29 (staining by Hoechst 33258)
2.5 流式细胞仪分析F02Z-1593J对肿瘤细胞周期和凋亡效应
A
DMSO
0.1mg/ml
1.0mg/ml
B
1.0mg/ml
0.1mg/ml
DMSO
运用0.1mg/ml和1.0mg/ml浓度F02Z-1593J解决HT-29细胞， 1天后收集细胞，进行流式细胞仪对细胞周期和凋亡分析。成果如图4 所示，经药物解决细胞G2／M期细胞明显减少， G1期细胞由明显增长，阐明F02Z-1593J使细胞周期停滞在G1/G0期。通过F02Z-1593J解决后细胞在流式细胞仪上浮现了明显亚G1期凋亡峰，并且随着浓度凋亡峰所占比例从5.1%增长到22.7%（图）。
G1/G0

G2/M
S

Sub-G1

Sub-G1
Sub-G1

图4. F02Z-1593J 对结肠癌细胞周期影响
Figure 4 The effect of F02Z-1593J on the cell cycle (A) and apoptosis (B) of HT-29
2.6 F02Z-1593J对肿瘤细胞caspase 3/7活性诱导作用
在介导细胞凋亡过程中caspase家族起着非常重要作用，其中caspase-3/7为核心执行分子，它在凋亡信号传导许多途径中发挥功能[4]。从图5可以看出在细胞被1593J解决一天后，随着样品浓度增长，细胞中caspase-3/7活性与F02Z-1593J浓度有较好依赖关系，最大活性可增长到4-5倍。用10 µg/ml F02Z-1593J解决细胞，成果表白该化合物对caspase-3/7活性诱导效应具备具备时间依赖关系（图6 ）。

图5. F02Z-1593J对肿瘤细胞中caspase 3/7诱导浓度依赖关系
Figure 5. The activity of Caspase 3，7 of HT29 exposured to different concentration of F02Z-1593J

图6. F02Z-1593J对肿瘤细胞中caspase 3/7诱导时间依赖关系
Figure 6. The induced effect of F02Z-1593J on Caspase 3，7 in HT29 for different time
2.7 F02Z-1593J对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖抑制活性
肿瘤生长、浸润和转移都依赖于新生血管形成，血管内皮细胞直接参加血管生成以及肿瘤细胞浸入[7]。本研究进一步研究了F02Z-1593J对人脐静脉内皮细胞ECV304抑制活性。成果证明F02Z-1593J对ECV304有明显抑制作用，IC50为0.24µg/ml。从解决后经荧光染色细胞核固缩现象阐明F02Z-1593J能引起 ECV304凋亡（图7）。

DMSO
1.0 mg/ml

图7. F02Z-1593J对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞核核作用
Fig 7. The effects of F02Z-1593J on cell nuclears of ECV304 (staining by Hoechst 33258)
3 讨论
本研究从真菌F02Z-1593发酵产物中分离得到五个山酮类化合物F02Z-1593I、J、T、U和V，其中F02Z-1593 J和V为两个新化合物。五个山酮均对各种肿瘤细胞株增殖体现出较好抑制活性，其中1593I 和J 对肿瘤细胞增殖抑制IC50 在7-20ng/ml,体现出极强抗增殖作用。并且对正常肝细胞有较低细胞毒，阐明该类化合物对肿瘤细胞有较好选取性。
细胞凋亡（Apoptosis）是在基因调控下发生细胞自杀行为。而癌细胞特性就是通过逃避机体正常凋亡而达到永生，因此选取性诱导癌细胞凋亡是抗肿瘤药物研发方向之一[6]。半胱氨酸蛋白质酶（Caspase）是一类具备特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能蛋白酶，是细胞凋亡过程重要启动和执行者。迄今已有13个分子得到命名，分别为Caspase 1~13，其中Caspase -3和7被以为在各种组织、细胞类型中最常涉及凋亡效应分子[4]。本研究对新化合物F02Z-1593J抗癌机制进行了初步研究，成果表白其将肿瘤细胞周期阻滞在G1期，并引起细胞明显变园、皱缩和核固缩等凋亡现象，并且能剂量和时间依赖地增长细胞中caspase 3/7活性，证明新化合物F02Z-1593J是通过Caspase途径诱导肿瘤细胞凋亡而起抗癌作用。
肿瘤生长、浸润和转移都依赖于新生血管形成 [7，8]。本研究证明F02Z-1593J对人脐静脉内皮细胞ECV304有较好抑制活性，因而该化合物有也许通过抑制内皮细胞增殖、诱导其凋亡从而在肿瘤生长和转移方面具备较好效果。
该类化合物在体外已体现出较好抗肿瘤作用，其体内抗肿瘤活性正在进行中。
参照文献：
1. R. Marthinus Horak，Pieter S. Steyn，and Robert Vleggaar. Biosynthesis of Austocystin D in Aapergillus ustus. A Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Study. [J]. J Chem Soc Perkin Trans.1. 1983，8：1745-1748.
2. Steyn PS，Vleggaar R，Austocystins. Six novel dihydrofuro (3'，2'：4，5) furo (3，2-b) xanthenones from Aspergillus ustus. [J]. J Chem Soc [Perkin 1]. 1974，19：2250-6
3. WILLIAM A. AYER and JOHN B. MACAULAY，Metabolites of the honey mushroom，Armillaria mellea. [J]. Can. J. Chem. 1987,65,7:
4. Saini KS，Walker NI. Biochemical and molecular mechanisms regulating apoptosis. Molecular and Cellular Biochemistry,1998∶9～25
5. Hannun YA. Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy. Blood,1997:1845～1853
6. Fisher DE. Apoptosis in cancer therapy：crossing the threshold [J]. ell,1994∶529～542
7. Maniotis AJ,Folberg R,Hess A,et al.Vascular channel formation by human melanoma cellsin vivoand in vitro:vasculogenic mimicry[J].Am H Pathol，1999,155(3):739-752
8. Claesson-Welsh L,Welsh M，ITO N，et al. Angiostatin induces endothelial cell apoptosis and activation of focal adhesion kinase independently of the integrin-binding motif RGD.Proc Natl Acad Sci USA，1998,95(10):5579-5583.