褪黑素缓解玉米赤霉烯酮引发的卵巢颗粒细胞氧化应激与雌二醇合成异常.pdf

Journal of Southwest Minzu University(NaturalScienceEdition)Vol.50 No.2第50 卷第2 期Mar.20242024年3月西南民族大#自然科学版）doi:10.11920/xnmdzk.2024.02.004褪黑素缓解玉米赤霉烯酮引发的卵巢颗粒细胞氧化应激与雌二醇合成异常李巧，马梓峰”，徐红梅，李悦悦，李键-2 3，付伟1.2,3（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都6 10 0 41；2.西南民族大学动物科学国家民委重点实验室，四川成都6 10 0 41；3.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都6 10 0 41)摘要：旨在研究玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）对卵巢颗粒细胞的毒性作用以及对雌二醇（Estradiol,E,）合成的影响，为筛选缓解ZEN毒性的药物提供参考.试验利用人颗粒细胞系（KGN）建立ZEN细胞攻毒模型，采用CCK-8法检测细胞活力，使用试剂盒检测细胞活性氧及线粒体膜电位水平，利用RT-qPCR检测E,合成基因的mRNA表达水平；同时，筛选缓解ZEN毒性的药物并验证其挽救作用.结果显示，添加ZEN(O、30、9 0 M）后，细胞活力随着ZEN浓度的升高而显著降低(P0.05）,细胞内ROS水平增加并且线粒体膜电位水平显著下降（P0.05）,E,合成基因CYP19A1、CYP11A1、ST A R 及HSD3B的mRNA表达水平显著下调（P0.05）.与ZEN处理组相比，联合添加褪黑素（Melatonin，MT）可以增加活细胞数量并显著提高细胞活力（P0.05），同时,E,合成基因CYP19A1、CYP11A 1、ST A R 及HSD3B的mRNA表达水平显著上调（P0.05），细胞内ROS水平及细胞膜电位水平显著恢复.综上,ZEN导致KCN细胞氧化应激及E,合成紊乱，而MT可部分缓解上述中毒症状，提示MT可用于缓解ZEN毒性，关键词：玉米赤霉烯酮；褪黑素；卵巢颗粒细胞；雌二醇合成中图分类号：S859文献标志码：A文章编号：2 0 9 5-42 7 1(2 0 2 4)0 2-0 141-0 9Melatonin alleviates zearalenone-induced oxidative stress andabnormal synthesis of estradiol in ovarian granulosa cellsLI Qiao,MA Zhi-feng,XU Hong-mei,LI Yue-yue,LI Jian-2.3,FU Weil.2.3(1.School of Animal and Veterinary Sciences,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China;2.Key Laboratoryof Animal Science of National Ethnic Affairs Commission of China,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China;3.Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China)Abstract:The aim of this experiment was to study the toxic effects of zearalenone(ZEN)on ovarian granulosa cells and itseffect on estradiol(E,)synthesis,and to provide a reference for the screening of drugs to alleviate the toxicity of ZEN.In thepresent study,human granulosa cell line(KGN)was utilized to establish a ZEN cell model.Cell viability was assessed usingthe CCK-8 method,while levels of reactive oxygen species(ROS)and mitochondrial membrane potential were measured usingcommercial kits.Additionally,mRNA expression levels of genes involved in E,synthesis were determined through RT-qPCR a-nalysis.Simultaneously,compounds with potential alleviating effects on ZEN toxicity were screened and their rescue efficacy wasvalidated.The results showed that the cell viability was significantly decreased with the increase of ZEN concentration(PO.05).Meanwhile,the intracellular ROS level increased and the mitochondrial membrane potential level decreased significantly收稿日期：2 0 2 4-0 1-0 9通信作者：付伟（19 8 9-），男，讲师，博士，研究方向：动物配子与胚胎工程；E-mail：f u w e i s w u n.e d u.c n基金项目：四川省自然科学基金项目（2 0 2 2 NSFSC1629）；西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（2 0 2 3NYXXS136）142第50 卷西南民族大报（自然科学版(P0.05).Additionally,the mRNA expression levels of E2 synthesis genes CYP19A1,CYP11A1,STAR and HSD3B were sig-nificantly downregulated(PO.05).Compared with the ZEN treatment group,the combined addition of melatonin(MT)couldincrease the number of living cells and significantly improve the cell viability(P0.05).The mRNA expression levels of E,synthesis genes CYP19A1,CYP11A1,STAR and HSD3B were significantly upregulated(P0.05),and the intracellular ROSlevel and cell membrane potential level were significantly restored.In summary,ZEN caused oxidative stress and disordered E2synthesis in KGN cells,while MT partially alleviated the above toxic symptoms,suggesting that MT could be used to alleviate thetoxicity of ZEN.Keywords:zearalenone;melatonin;ovarian granulosa cell;estrogen secretion卵巢卵泡是雌性生殖系统的核心功能单元 ,而卵巢颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）是卵泡中参与卵泡发育的重要体细胞.GCs可通过分泌类固醇激素、生长因子及细胞因子等调控卵泡的发育和成熟2 ,进而影响雌性动物的发情、排卵及妊娠等繁殖过程3.GCs是合成雌二醇（Estradiol,E,）的主要场所，该过程以胆固醇为底物,通过类固醇生成路径合成E，【4,其中CYP19A1、CYP11A 1、ST A R 和HSD3B等是其合成通路的关键酶5.E,通过与其受体(Estrogen receptor,ER)结合,进而调控雌性动物生殖与发育，而环境雌激素可竞争性结合ER，干扰繁殖进程.其中，玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是环境雌激素的典型代表，其与ER结合会扰乱动物内分泌系统，引发繁殖障碍6 .ZEN又称F-2毒素,是一种主要由镰刀菌属（Fu s a r i u m)产生的霉菌毒素7 ,具有细胞毒性、免疫毒性、肝肾毒性和生殖毒性等多种毒性8 .ZEN广泛污染饲料及其原材料，容易沉积于生殖系统并造成严重损伤，给养殖业造成巨大经济损失，但目前仍然缺少有效的ZEN脱毒方法以及治疗药物9 1.ZEN可引起氧化损伤、内质网应激和细胞调亡，导致全身毒性作用10 .其中,ZEN最典型的毒性作用之一是生殖毒性,其作用的靶点包括生殖系统的各个器官.ZEN可扰乱生殖系统排卵、产生精子等生理功能,影响生殖细胞分化及胚胎细胞发育.ZEN可导致雄性小鼠附睾精子数量下降，未成熟精子比例升高，通过诱导睾丸组织细胞线粒体路径的调亡，损伤小鼠生殖能力.Lee等12 发现,ZEN诱导GC-1精原细胞发生调亡和自噬，具有毒性作用.Li等13 发现，ZEN诱导猪卵母细胞早期调亡、氧化应激和内质网应激，导致卵母细胞减数分裂停滞，干扰猪卵母细胞的发育能力.暴露于ZEN中不仅会降低生殖相关细胞的活力,造成细胞亡和细胞周期阻滞14,还会破坏类固醇激素的合成及分泌过程15.ZEN能与调节卵巢合成雌激素的类固醇酶相互作用，干扰下丘脑-垂体-性腺轴（HPG），破坏细胞内的激素平衡16 .研究证明,ZEN主要通过参与雌激素负反馈调节影响雌激素的生物合成,从而产生生殖毒性，干扰睾酮和E,等雌激素的合成17 ,在不同剂量下,ZEN对不同类型细胞的毒性作用存在差异.ZEN不仅能刺激细胞增殖，还可通过诱导细胞周期停滞、氧化应激和线粒体损伤，导致细胞调亡，产生毒性作用.ZEN暴露可通过降低抗氧化酶活性、ROS积累和降低线粒体膜电位来诱导猪小肠IPEC-J2细胞线粒体损伤18 .ZEN会破坏线粒体的抗氧化防御机制，导致过量的ROS产生，引起氧化应激.研究发现，一些抗氧化物可以调节氧化应激水平，如褪黑素（Melatonin，M T）通过SIRT1信号通路阻止棕榈酸诱导的ROS产生和线粒体功能障碍19 .目前,ZEN对卵巢颗粒细胞E,合成的调控作用尚不清楚,且缺少有效的治疗药物.基于此，本研究以卵巢颗粒细胞KGN为模型，通过建立ZEN体外攻毒模型,探究ZEN对颗粒细胞的毒性作用及其对卵巢颗粒细胞E,合成的影响，并筛选能够缓解ZEN的毒性作用的挽救药物，为研究ZEN的作用机制提供基础数据,并为研究缓解ZEN毒性的药物提供参考.1材料与方法1.1材料玉米赤霉烯酮（ZEN）和褪黑素（MT）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM/F-12培养基购自上海GIBCO公司；胎牛血清购自新西兰NE-WZERUM公司；青霉素-链霉素溶液购自美国Invitro-143李巧素缓解玉米赤霉烯酮引发的卵巢颗粒细胞氧化应激与醇合成异常第2 期gen公司;CCK-8试剂盒和总RNA提取试剂购自北京兰杰柯科技有限公司；ROS试剂盒和JC-1试剂盒购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司；反转录试剂盒和qPCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司.1.2颗粒细胞培养使用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM/F12培养基将人颗粒细胞系（KGN）接种于6cm培养皿，在37 和5%CO,的细胞培养箱中培养，每隔2 4h更换一次培养基.当细胞汇合度达到80%9 0%的时候进行传代取对数生长期的细胞进行后续试验1.3细胞增殖活力检测将颗粒细胞以每孔510 4个的密度接种于9 6 孔板中，设置空白对照.当细胞汇合度达到7 0%时，使用添加不同浓度药物的完全培养基处理细胞.加药24h后，每孔加入10 LCCK-8工作液，于培养箱中孵育1h.用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度（OD值）,计算细胞活力.细胞活力x（%）=A（加药）-A（空白）/A（0 加药）-A（空白）10 0%.A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度；A（O 加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度1.4ROS水平检测将颗粒细胞以每孔510 5个的密度接种于12 孔板中.当细胞生长汇合度达到7 0%时，使用添加不同浓度药物的完全培养基处理细胞.加药2 4h后，每孔添加0.5mL含有10 mol/LDCFH-DA的培养基,培养箱内孵育2 0 min,其后用无血清培养基清洗细胞三次.在荧光显微镜下拍照获得荧光图像，用ImageJ软件评估ROS的荧光水平1.5细胞膜电位JC-1水平检测细胞培养及处理方式同1.4同.加药2 4h后，每孔加人JC-1染料工作液,培养箱内孵育30 min，孵育结束后用无血清培养基清洗细胞3次，以充分去除细胞外的JC-1染料.在荧光显微镜下拍照获得荧光图像,用ImageJ软件评估JC-1的荧光水平.1.6基因表达量分析细胞培养及处理方式同1.4同.收集加药处理后的细胞,用总RNA提取试剂提取细胞RNA,分光光度法测定RNA含量.根据反转录试剂盒说明书，用两步法将1g总RNA反转录成互补cDNA.根据NCBI数据库序列信息设计引物（表1），以-ACTIN作为内参基因,用RT-qPCR检测不同条件下KCN细胞中E,合成相关基因CYP19A1、CYP11A 1、ST A R 及HSD3B的表达情况，并采用2-C法分析数据。表1RT-qPCR引物序列Tab.1Primers for RT-qPCR基因名称上下游引物序列(5-3)NCBI参考序列产物长度Gene nameForward and reversed primersSequence(5-3)NCBI Reference SequenceProduct lengthForwardGCAGAAGGAGATCACTGCCCT-ACTINNM_001101.5136 bpReversedGCTGATCCACATCTGCTGGAAForwardGACTTTGCCACTGAGTTGATTTCYP19A1NM_001347252.288bpReversedCGATCAGCATTTCCAATATGCAForwardACCAAGAACTTTTTGCCCCTCYP11A1NM_001099773.2104 bpReversedATGTCCCCCGAGTAATTTCCForwardACGTGGATTAACCAGGTTCGSTARNM_000349.3149 bpReversedCAGCCCTCTTGGTTGCTAAGForwardCTCTTCTGTCCAGCTTTTAACHSD3BNM_000862.3116 bpReversedCATCCAAAGTAGCAGGAATC1.7数据统计与分析所有数据至少包括3次生物学重复.应用Graph-Pad Prism8软件对数据进行显著性t检验或单因素方差（ANOVA)统计分析，得到的结果用“平均值标准差”表示.P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著,不同小写字母代表差异显著（P0.05）.144第50 卷西南民族大自然科学版2结果2.1ZEN抑制KGN细胞活力为了探究不同浓度ZEN对KGN细胞形态和细胞活力的影响，试验分别添加ZEN（O、30、9 0 M)处理颗粒细胞2 4h.镜下观察结果显示，对照组KGN细胞形态正常，呈成纤维样或梭形并向周围伸出伪足.30、9 0 MZEN处理后贴壁的细胞数量逐渐减少，细胞形态逐渐皱缩变圆，失去梭形和伪足样结构，且随着浓度的增加，形态改变愈加明显（图1A）.采用CCK-8检测不同浓度ZEN对KGN的细胞活力的影响.结果显示，添加30 MZEN处理细胞后，细胞活力显著下降至7 9.7 6%；添加9 0 MZEN处理细胞后，细胞活力显著下降至44.9 9%（P0.05）（图1B）.结果表明，高浓度的ZEN显著抑制KGN细胞活力.AB120a100-b8060-C4000100um20CtrlZEN30MZEN90M0ZEN(M)03090A.ZEN处理后KGN细胞的生长状态;B.CCK-8检测ZEN对KGN细胞活力的影响图1不同浓度ZEN对KGN生长和细胞活力的影响Fig.1Effect of different concentrations of ZEN on the growth and cell viability of KGN cells注：不同字母代表差异显著（P0.05），下同2.2ZEN诱导KGN细胞氧化应激利用DCFH-DA染色检测不同浓度ZEN对KGN细胞内活性氧（ROS）水平的影响.结果显示，与对照组相比,ZEN处理组中KGN细胞的DCFH荧光信号明显增强（图2 A）.荧光强度分析发现，ZEN（30、90M)处理细胞后,细胞内ROS水平显著升高(P0.05）.上述结果提示，ZEN诱导KGN细胞大量产生ROS,进而导致其氧化应激.AB20115a10-5100um100um100mCtrlZEN30MZEN90M0ZEN(uM)03090A.ZEN处理后KCN细胞中ROS的荧光染色图;B.ROS水平荧光强度分析图2不同浓度ZEN对KGN细胞ROS水平的影响Fig.2Effects of different concentrations of ZEN on ROS levels in KGN cells2.3ZEN诱导KGN细胞线粒体功能损伤利用JC-1染色检测不同浓度ZEN对KGN细胞内线粒体膜电位水平的影响.正常细胞中JC-1聚集在线粒体基质中产生红色荧光；线粒体膜电位降低（去极化)时,JC-1不能聚集，转变为单体产生绿色荧光.结果显示，随着ZEN浓度的提高，JC-1单体产生的绿色荧光信号逐渐增强（图3A）.ZEN（30、9 0 M）处理组中JC-1聚合体/JC-1单体比例显著降低（P0.05）（图3B），表明ZEN处理导致KGN细胞线粒体膜电位水平显著下降，引发线粒体功能损伤2.4ZEN抑制KCN细胞雌二醇合成相关基因的表达利用RT-qPCR检测不同浓度ZEN对KGN细胞雌二醇（E）合成相关基因mRNA表达水平的影响.结果显示，与对照组相比，在添加30 MZEN处理时，CYP19A1、ST A R 及HSD3B基因的mRNA表达水平显145李巧赤霉烯酮引发的卵巢颗粒细胞氧化应激醇合成异常第2 期著下调（P0.05），但CYP11A1显著上升.同时，90MZEN显著下调了上述四个基因的表达量（P0.05）（图4）.上述结果表明，ZEN总体上显著抑制KGN细胞中E,合成相关基因的表达，使得雌二醇合成受阻.ABJC-I聚合体64100100ub2JC-单体0ZEN(uM)03090100um100um100HmMerge100um100umCtrlZEN30MZEN90MA.ZEN处理后KCN细胞中线粒体膜电位染色图；B.线粒体膜电位荧光强度分析图3不同浓度ZEN对KCN细胞线粒体膜电位水平的影响Fig.3Effects of different concentrations of ZEN on mitochondrial membrane potential in KGN cells1.5-CYP19A12.0CYP11A11.5STAR1.5-HSD3Baaa1.5-a1.01.0-1.0-b1.00.50.5-0.5-b0.50.00.00.00.0ZEN(uM)03090ZEN(M)03090ZEN(M)03090ZEN(uM)030 90图4不同浓度ZEN对KGN细胞中E,合成相关基因表达的影响Fig.4Effects of different concentrations of ZEN on gene expression of E2 synthesis in KGN cells以上细胞试验结果表明,30 和90 MZEN显著抑制KGN细胞活力，导致其氧化应激和线粒体膜电位下降；同时,E,合成相关基因的表达水平显著下调，提示ZEN阻碍了KGN细胞中E,的正常合成.2.5抗氧化剂部分挽救ZEN处理的KGN细胞中E2合成相关基因表达进一步，我们分别在ZEN（30、90 M)处理KGN细胞中添加谷胱甘肽（GSH）、褪黑素（MT）和-烟酰胺单核苷酸（NMN），探索上述抗氧化剂对ZEN毒性的缓解作用.结果表明，联合添加抗氧化剂显著提高了KGN细胞E,合成基因的表达水平.与30 MZEN处理组相比，联合添加GSH显著上调了CYP11A1、STAR及HSD3B的基因表达.同时，CSH上调了90MZEN组中CYP11A1的mRNA表达量（P0.05）（图5A）.联合添加MT显著上调了30 MZEN处理组中CYP19A1、CYP11A 1、ST A R 及HSD3B的基因表达，同时，MT上调了90 MZEN组中CYP11A1及STAR的mRNA表达量（P0.05）（图5B）.联合添加NMN显著上调了30 MZEN处理组中CYP19A1、CYP11A1、ST A R 及HSD3B的基因表达，同时，NMN上调了90 MZEN组中STAR及HSD3B的mRNA表达量（P0.05）（图5C).这些结果提示，三种抗氧化剂可以部分缓解ZEN引发的E,合成紊乱.值得注意的是，与另两种抗氧化剂相比，MT更为显著的上调了CYP19A1的表达水平,因此选用MT作为挽救药物进行后续试验.146第50 卷西南民族大自然科学版CYP19A1CYP11A1STARHSD3BA1.5a2.0aaa1.531.0bb1.0C0.52dd0.51CC0.000.0-0ZEN(uM)030330+GSH9090+GSHZEN(uM)03030+GSH90990+GSHZEN(uM)003030+GSH9090+GSHZEN(M)3030+GSH9090+GSHCYP19A1CYP11A1STARHSD3BB2.0151.5-6aaa1.5ab101.0b1.05b0.50.5-bdCCCC0.000.0ZEN(M)03030+MT9090+MTZEN(M)03030+MT9090+MTZEN(M)3030+MT9090+MTZEN(uM)03030+MT9090+MTCYP19A1CYP11A1STARHSD3BC2.0-15-3120a1.5-a15a10aab1.0b105-d0.5-b5bCCCdd0.000ZEN(M)03030+NMN9090+NMNZEN(M)3030+NMN9090+NMNZEN(M)003030+NMN9090+NMNZEN(M)030330+NMN9090+NMNA.ZEN与GSH共处理KGN细胞后E,合成相关基因mRNA表达情况B.ZEN与MT共处理KGN细胞后E,合成相关基因mRNA表达情况C.ZEN与NMN共处理KGN细胞后E,合成相关基因mRNA表达情况图5ZEN与抗氧化物共处理后E,合成相关基因mRNA表达情况Fig.5mRNA expression of E,synthesis-related genes after co-treatment of ZEN with antioxidants2.6MT缓解ZEN诱导的KGN细胞活力损伤我们进一步探索MT对ZEN诱导的KGN细胞氧化应激的缓解作用.显微镜下观察细胞形态发现，联合添加MT后，细胞形态部分与对照组相似，形态基本正常，为成纤维样或梭形.与ZEN组相比,ZEN与MT共处理组中贴壁细胞数量增加，漂浮细胞减少（图6A）.经CCK-8检测结果显示，与ZEN组相比,ZEN与MT共处理组颗粒细胞活力显著增加（P0.05）（图6 B）.结果提示，MT部分缓解ZEN诱导的细胞活力损伤.A100CtrlZEN30MZEN30M+MTZEN90MZEN90M+MTB120abbC40d200ZEN(M)03030+MT9090+MTA.ZEN与MT共处理后KGN细胞的生长状态;B.ZEN与MT共处理对KGN细胞活力的影响图6 ZEN与MT共处理后对KGN细胞生长和细胞活力的影响Fig.6Effect of ZEN and MT co-treatment on cell growth and viability of KGN147李巧赤霉烯酮引发的卵巢颗粒细胞氧化应激与醇合成异常第2 期2.7MT缓解ZEN诱导的氧化应激ZEN促进KGN细胞中ROS的产生，在联合添加MT后，细胞ROS水平显著下降.与ZEN处理组相比，ZEN与MT共处理组中DCFH荧光信号明显减少，只少数细胞具有DCFH荧光信号（图7 A）.经统计分析，联合添加MT显著降低KGN细胞内ROS水平（P0.05）.上述结果表明，联合添加MT可抑制KGN细胞中ROS的产生，缓解ZEN诱导的氧化应激.A100.um100um100um100um100umCtrlZEN30MZEN30M+MTZEN90MZEN90M+MTB20-1510d50ZEN(M)03030+MT9090+MTA.ZEN与MT共处理后KGN细胞中ROS的荧光染色图;B.ROS水平荧光强度分析图7 ZEN与MT共处理对KCN细胞ROS水平的影响Fig.7Effect of ZEN and MT co-treatment on ROS levels in KGN cells2.8MT缓解ZEN诱导的线粒体功能损伤JC-1染色结果观察到随着ZEN处理浓度的提高，JC-1单体产生的绿色荧光信号增加，而联合添加MT后,JC-1单体产生的绿色荧光信号逐渐减弱,JC-1聚合物产生的红色荧光信号增强（图8 A）.与ZEN处理组相比，ZEN与MT共处理组中JC-1聚合体/JC-1单体比例显著上调（P0.05）（图8 B）.结果表明，MT显著提高KGN细胞线粒体膜电位水平，缓解ZEN诱导的线粒体功能损伤.AJC-I聚合体100JC-I单体100Merge00100CtrlZEN30MZEN30M+MTZEN90 MZEN90M+MTB6a2ZEN(M)03030+MT9090+MTA.ZEN与MT共处理后KGN细胞中线粒体膜电位染色图;B.线粒体膜电位荧光强度分析图8 ZEN与MT共处理对KCN细胞线粒体膜电位水平的影响Fig.8Effect of ZEN and MT co-treatment on the level of mitochondrial membrane potential in KGN cells148第50 卷西南民族大自然科学版）上述结果表明，MT能提高细胞活力，显著改善ZEN诱导的氧化应激和细胞线粒体功能损伤.综合上述结果,MT可以作为一种挽救药物来缓解ZEN的毒性作用及其引发的E，合成紊乱.3讨论卵巢颗粒细胞是卵巢卵泡内最主要的功能细胞 2 0 ,其主要功能是合成雌激素、促进卵泡的生长、发育及成熟 2 1.颗粒细胞的增殖、分化、凋亡及其与卵母细胞之间的联系还决定着卵母细胞的正常发育 2 2 。在不同的细胞类型中，不同剂量ZEN的毒性作用机制也不同.低浓度的ZEN及其衍生物能刺激细胞生长，高浓度的ZEN则抑制细胞活力，导致细胞死亡 2 3.在本试验中，我们采用体外培养的KGN细胞，通过添加不同浓度的ZEN建立体外细胞攻毒模型，近年的研究表明,ZEN可抑制猪和小鼠卵巢颗粒细胞的增殖活力,降低卵母细胞成熟率,且ZEN与卵巢颗粒细胞增殖呈剂量依赖性 2 4.Zhu等 2 5 研究报道，ZEN在较高的水平能减少猪卵巢颗粒细胞的增值,并能引起颗粒细胞调亡和坏死,从而影响卵巢颗粒细胞类固醇激素的合成.ZEN具有毒性作用,能够抑制细胞增殖,降低细胞活性 2 6 .本研究同时也发现,ZEN会致使KGN细胞形态发生变化，细胞活力呈浓度依赖性降低，再次证明高浓度的ZEN对细胞具有毒性作用.研究表明，ZEN及其代谢产物可通过诱导细胞发生氧化应激发挥毒性作用.ZEN可直接进人细胞体内产生大量ROS,而ROS在氧化应激诱导的细胞调亡中起重要作用,最终导致细胞凋亡或坏死 2 7 .本研究发现,ZEN处理KGN细胞后，细胞内的ROS水平上升及线粒体膜电位水平下降，证实ZEN可通过诱导细胞发生氧化应激、线粒体损伤而导致细胞调亡，进而发挥其毒性作用.颗粒细胞的正常功能极易受到氧化应激的影响，发生氧化损伤 2 8 ,进而干扰E,的合成分泌，最终降低动物的繁育能力 2 9.本研究运用RT-qPCR技术检测E,合成基因（CYP19A1、CYP11A 1、STAR、H SD 3B）的mRNA表达水平，同样也发现ZEN显著下调KCN细胞中E,合成基因的mRNA表达,可通过抑制从胆固醇到E,的生物合成途径来干扰E,的合成，致使KGN细胞E,合成受阻.外源性补充抗氧化剂是减缓氧化应激的重要途径.天然抗氧化剂常被用于抗ZEN诱导的细胞死亡，例如原花青素可减轻ZEN诱导的TM4细胞的氧化损伤与细胞凋亡 30 ,其可通过降低活性氧水平,抑制内质网应激通路,减轻ZEN诱导的细胞损伤 31.许多研究表明,抗氧化剂，包括谷胱甘肽 32】、褪黑素【3、烟酰胺单核苷酸【34 等,能提高机体的抗氧化水平，有效清除机体的活性氧,提高抗氧化酶的活性,减缓细胞毒性.本研究的结果表明,这些药物均能部分缓解ZEN诱导的KCN细胞E,的合成紊乱.芳香化酶可调节雄烯二酮和睾酮转化为E2,是E,合成的重要限速酶,由CYP19A1编码生成 35】.本研究发现，与GSH及NMN相比,MT更为显著的上调了E,关键基因CYP19A1的表达水平，同时，MT显著提高KGN细胞活力.这些结果表明，MT通过抑制ROS的产生来减弱ZEN诱导的KGN细胞氧化应激、减少细胞线粒体功能损伤，并恢复其E，合成能力.4结论ZEN降低KGN细胞活性,诱导氧化应激及线粒体损伤的同时，干扰E,合成相关基因表达；与CSH和NMN相比,MT更能有效缓解ZEN诱导的上述毒性作用.参考文献1 CHANG H M,QIAO J,LEUNG P C.Oocyte-somatic cell interactions in thehuman ovary-novel role of bone morphogenetic proteins and growth differen-tiation factors J.Human Reproduction Update.2016,23(1):1-18.2JALAM M H,MIYANO T.Interaction between growing oocytes and gran-ulosa cells in vitroJ.Reproductive Medicine and Biology.2019,19(1):13-23.3 J EDSON M A,NAGARAJA A K,MATZUK M M.The mammalian ovaryfrom genesis to revelationJ.Endocrine Reviews.2009,30(6):624-712.4 FUENTES N,SILVEYRA P.Estrogen receptor signaling mechanismsJ.Advances in Protein Chemistry and Structural Biology.2019,116(1):135-170.5JDROUIHET L,TARACNAT C,FONTAINE J,et al.Endocrine charac-terization of the reproductive axis in highly prolific lacaune sheep homo-zygous for the FecLL mutation J.Biology of Reproduction.2010,82(5):815-824.6ZHOU J,ZHAO L,HUANG S,et al.Zearalenone toxicosis on reproduc-tion as estrogen receptor selective modulator and alleviation ofzearalenone biodegradative agent in pregnant sows J.Journal of Ani-mal Science and Biotechnology.2022,13(1):36.7史海涛，曹志军，李键等.中国饲料霉菌毒素污染现状及研究进展J.西南民族大学学报（自然科学版）.2 0 19，45（0 4）：354-36 6149李巧赤霉烯酮引发的卵巢颗粒细胞氧化应激与醇合成异常第2 期8 J ROPEJKO K,TWARUZEK M.Zearalenone and Its Metabolites-General O-verview,Occurrence,and ToxicityJ.Toxins(Basel).2021,13(1):35.9CAI G,PAN S,FENG N,et al.Zearalenone inhibits T cell chemotaxisby inhibiting cell adhesion and migration related proteins J.Ecotoxi-cology and Environmental Safety.2019,175:263-271.10JJING S,LIU C,ZHENG J,et al.Toxicity of zearalenone and its nutri-tional intervention by natural productsJ.Food&Function.2022,13(20):10374-10400.11易江南，陈汉明，刘冰贤，等.玉米赤霉烯酮诱导睾丸细胞线粒体路径的调亡损伤小鼠生殖能力J.中国兽医学报.2 0 2 1,41（12)：2461-2467.12JLEE R,KIM D W,LEE W Y,et al.Zearalenone induces apoptosis andautophagy in a spermatogonia cell line J.Toxins(Basel).2022,14(2):148.13 JLI X,DUAN J,WANG S,et al.Isorhamnetin protects porcine oocytesfrom zearalenone-induced reproductive toxicity through the PI3K/Aktsignaling pathway J.Journal of Animal Science and Biotechnology.2023,14(1):22.14JI Y M,ZHANG K H,PAN Z N,et al.High-dose zearalenone exposuredisturbs G2/M transition during mouse oocyte maturation J.Repro-ductive Toxicology.2022,1