毕业设计-壳聚糖衍生物的制备及其抗新城疫病毒活性研究.doc

密级:，硕 士 学 位 论 文壳聚糖衍生物的制备及其抗新城疫病毒活性研究 2015年 05月原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任人由本人承担。论文作者签名： 日期：学位论文版权使用授权书本人完全了解中国科学院海洋研究所有关保留、使用学位论文的规定，同意海洋研究所保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国科学院海洋研究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。（保密论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签字： 日期：导师签字： 日期：The preparation of chitosan and its derivatives and their inhibition effect on Newcastle disease virusBy He Xiaofei(Marine Pharmacology)Directed by Xing RongeA Dissertation Submitted toThe University of Chinese Academy of SciencesIn partial fulfillment of the requirementFor the degree ofMaster of ScienceInstitute of Oceanology, Chinese Academy of SciencesMay, 2015致谢时光匆匆而逝，三年好似昨天。一年的北上求学，两年的实验探索，时至今日已接近尾声。十分感谢三年来，我的指导老师邢荣娥老师，在生活和学习上给予的悉心指导与帮助，让我对过去充满怀念、对现在充满感恩、对以后充满信心。邢老师以其热情开朗的生活态度、严谨客观的研究认识、努力认真的工作作风深深影响着我。从生活琐事到实验注意，事事躬亲，对学生关心爱护极佳。万分荣幸，能有这样一位博学、谦逊、严谨而又善良的老师指导我青春里最重要的道路。愿老师在以后的工作生活中，万事如意，幸福安康！十分感谢三年来课题组李鹏程老师的关心与指导，生活中，李老师平易近人、关心学生；科研中，李老师严谨认真，锐意创新。谆谆教诲、高尚师德学生永不敢忘，谨此毕业之际，特向李老师表达学生深深的感谢之情，望您身体健康，合家欢乐！在三年的学习生活中，感谢刘松老师、于华华老师、李克成老师、秦玉坤老师、王雪芹老师、李荣锋老师、陈晓琳老师给予的极大帮助与指导，在此特别表示感谢。感谢罗丰雷师姐、邹平师姐、杨皓月师姐、王晶师姐、李俨师兄、宋琳师姐、张恩惠师兄、周苗苗、岳洋、黄勇师弟、张晓倩师妹、刘卫翔师弟、金秋师妹、孙雨豪师弟、杨悦师妹等实验室兄弟姐妹们给予的支持与帮助，在此一并表示感谢。特别感谢奥兰百特尹燕博老师课题组对抗病毒实验的支持与指导，感谢张全斌老师课题组在仪器设备上的帮助与支持，也感谢家人一直以来的关心、支持与体谅。学生 何晓飞摘要新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病。目前针对鸡新城疫病毒主要采用疫苗方法，以预防为主。近年来大量研究表明，海洋生物多糖具有抗病毒和提高机体免疫力的活性。壳聚糖作为天然存在的唯一带正电荷的多糖，具有调节免疫、抗肿瘤、抗菌、降脂、保湿等非常好的生理活性，且研究发现，壳聚糖及其衍生物可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染。但其是否具有抗新城疫病毒活性，国内外还未见报道。因此，本文以不同分子量、不同结构类型、不同基团修饰的-壳聚糖、-壳聚糖和6-胺取代-6-脱氧壳聚糖衍生物为研究对象，鸡胚尿囊液中血凝效价的降低作用为指标，筛选出最佳抗鸡新城疫病毒的产品；同时，采用荧光定量PCR技术，测定免疫因子的变化，以此确定壳聚糖及其衍生物在对抗新城疫病毒的过程中，对于免疫系统的激活与调控，从而确定壳聚糖及其衍生物对于机体免疫系统的影响及药效机制。具体结果如下：测试样品均具有抗新城疫病毒活性，分子量、分子结构、修饰基团、产品浓度和接种方式对活性影响显著。1）-壳聚糖和-壳聚糖抑制新城疫病毒的最佳分子量分别为4513Da和5743Da；2）-壳聚糖的抗新城疫病毒活性明显优于-壳聚糖，-壳聚糖在分子量为3kDa-6kDa时，在直接抑制病毒的接种方式下可有效降低血凝效价至0，效果非常显著；3）6-脱氧-N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖显著提高了抗新城疫病毒活性，在直接抑制病毒的试验中可有效降低血凝效价至0；4）在浓度方面，8g/L分子量为3624Da和2g/L分子量为5743Da的-壳聚糖， 1g/L的6-脱氧-N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖均能将新城疫病毒血凝效价降至0。荧光定量PCR的测定结果表明：低分子量-壳聚糖、-壳聚糖都能有效增加IL-2、IFN-、IFN-、TNF-等免疫因子的转录，但并没有导致病毒RNA的明显下降。经胺取代修饰的壳聚糖衍生物虽然具有显著的抗新城疫病毒效果，但对于免疫因子转录影响表现独特，有效降低了病毒RNA。因此，-壳聚糖和6-胺代-6-脱氧壳聚糖衍生物的抗病毒机理应有所不同，值得我们进一步研究。本文研究为获得一种绿色低毒、治疗有效、价格低廉的抗新城疫病毒药物提供了可能，同时，对于免疫损伤性疾病新城疫的研究也为我们系统性研究治疗其他免疫损伤性疾病打下了重要基础。关键词不同分子量-壳聚糖 不同分子量-壳聚糖 6-胺代-6-脱氧壳聚糖衍生物 新城疫病毒 抗病毒机理ABSTRACTNewcastle disease (ND) is an acute septic and contact susceptible infectious disease caused by Newcastle disease virus (NDV). It resulted in blooding in respiratory tract and digestive tract mucosa. Currently, the treatments against ND are mainly adopts the prevention methods vaccines. In recent years, a large number of studies have shown that marine polysaccharide has antiviral activity and improve the body immunity. Chitosan as an only positively charged natural polysaccharide has terrific biological activities, such as the increase of immunity, antitumor, antibacterial, lipid-lowering and moisturizing. Whats more important, chitosan and its derivatives were found that they can inhibit dozens of plant virus and viroid infection. But if it against NDV has not been reported at home and abroad.Therefore, we take chitosan with different molecular weight (Mw), different modified groups and different form as research object in this article to select the best product against Newcastle disease virus. The results indicated by the hemagglutination titer of allantoic fluid in chicken embryo. At the same time, using the fluorescent quantitative PCR technology, we detected the change of immune factors in order to determine that if the chitosan and its derivatives has activated and regulated the immune system in the process of antiviral. Its useful to determine the influence of chitosan and its derivatives on the bodys immune system and its efficacy mechanism. Specific results are as follows:All test samples have antiviral activity against NDV influenced by Mw, modified group, the concentration of the product and the way of vaccination significantly. 1) The best Mw of -chitosan and -chitosan are 4513Da and 5743Da respectively; 2) -chitosans antiviral activity is superior to -chitosan. -chitosan with 3KDa-6KDa Mw effectively reduced blood clotting titer to 0 in the direct inhibiting virus group. 3) 6-deoxidation-N-phthalic acyl chitosan and 6-deoxidation-6-bromine-N-phthalic acyl chitosan significantly improve the antiviral activity in direct inhibiting virus group which reduce blood clotting titer to 0. 4) In terms of concentration, 8 g/L 3624Da and 2 g/L 5743Da -chitosan and 1 g/L 6-deoxidation-N-phthalic acyl chitosan and 6-deoxidation-6-bromine-N-phthalic acyl chitosan dropped the hemagglutination titer of NDV to zero.Results from fluorescence quantitative PCR showed that both -chitosan and -chitosan effectively increased the transcription of immune factors such as IL-2, IFN-, TNF-, IFN-, while not lead to a sharp decline in viral RNA. Although amine modified chitosan derivatives have significant effect on NDV, the transcription of immune factors performed specially, which reduced the viral RNA effectively. Therefore, we thought that the antiviral mechanism of -chitosan and 6-amine-6- deoxidization chitosan should be different which worth further research.This article made a road lead to obtain a green, inexpensive and effective drug against NDV. At the same time, it also made an important foundation for the systemic research of the treatment of other immune injury disease. KEY WORD-chitosan with different molecular weight -chitosan with different molecular weight 6-amine-6-deoxidation chitosan Newcastle disease Virus Antiviral mechanism第一章 绪论1.1 新城疫病毒的介绍及防治现状新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病1, 2。按病毒毒力可分为强毒株和弱毒株3，按临床表现可分为速发性嗜内脏型、速发性嗜肺脑型、中发型新城疫和缓发型新城疫。鸡新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血，死亡率高，危害严重4-6。仅2005年，发病家禽就高达168万只，给我国经济造成重大损失，是危害养鸡业健康发展的三大主要疫病（鸡马立克氏病，鸡新城疫，鸡传染性法氏囊病）之一7。具有分布范围广、易感禽类多、经济损失大、影响国际贸易等特点8。鸡新城疫病毒是具有囊膜的单股、负链和不分节段的RNA病毒9，通过羽毛、皮肤上皮细胞与粘液等第一道防线进入体内，在杀菌物质及吞噬细胞等第二道防线的作用下控制一部分病毒的入侵，同时也对吞噬细胞造成损伤，这属于非特异性免疫部分10, 11。而进入第三道防线，特异性免疫阶段则分为免疫器官和免疫细胞两部分，鸡法氏囊和哈德氏囊是重要的免疫器官。哈德氏腺及其导管系统中存在淋巴细胞群，进一步研究证实它是以B细胞为主(占淋巴细胞80%)的外周淋巴器官，是局部免疫的重要参与者。通过局部反应产生特异抗体，由腺管上皮细胞以顶浆分泌方式排至腺管，集成泪液。通过鼻泪管到达鼻腔再进入口腔和上呼吸道并保持强烈中和活性而起到局部免疫作用。可见到达这些部位的抗体不是血液中循环抗体的机械渗透而是来源于哈德氏腺ND局部免疫的发生部位，正是NDV的入侵门户12。HN糖蛋白在病毒侵染过程中，可识别细胞受体，介导病毒吸附于细胞膜，F蛋白参与病毒的穿透、细胞融合和溶血等过程，是决定NDV致病性的主要因素。HN呈血凝素及神经氨酸酶活性，F蛋白与细胞融合及病毒穿透细胞作用有关13, 14。鸡新城疫作为免疫抑制性疾病，在病毒早期感染雏鸡时病毒先在胸腺T细胞和骨髓多能干细胞内生长，并损伤破坏这些细胞，使骨髓系祖细胞的增殖受抑制，进而影响T细胞和B细胞等免疫细胞的形成。同时病毒的侵入还破坏了法氏囊内的免疫细胞和内皮细胞，由于这些免疫活性细胞被破坏，当用ND疫苗进行免疫时刺激机体巨噬细胞加工抗原、传递信息的能力减少，各种免疫细胞的减少和功能的降低致使机体发生免疫抑制现象或产生的免疫应答减少，不能抵抗新城疫野毒的感染而发生非典型的新城疫15。病毒性疾病与细菌性疾病不同，特效疗法较少，主要的防治手段有疫苗、化学合成药物及干扰素等16。通常药物并不能中断病毒感染，因此预防措施就显得尤为重要17。目前新城疫的防治主要以疫苗预防为主，由于价格便宜，免疫时间快，多使用LASOTA弱毒疫苗，但是效果不佳。虽然有多种疫苗和免疫方法，但是该病的发病率却仍是居高不下10, 18。其主要原因有母源抗体的干扰、病毒引起的免疫抑制、免疫程序不科学、免疫方法不恰当和疫苗质量参差不齐等19-21。治疗药物方面，由于病毒性疾病本身的难治愈性、易复发，长期使用药物易产生耐药性、成本高等缺点而限制其应用22, 23。此外，高免血清也具有用量大、成本高、反应多等缺点。干扰素只能在感染病毒的早期使用，而且需要反复使用；阿昔洛韦容易对动物肾功能造成损伤；头孢拉定则导致动物血尿情况24；病毒灵与病毒唑等一些药物可以抑制普通的感冒病毒，对其他病毒效果则不够理想19。因而积极、有效且廉价的抗病毒药物的研发与应用已刻不容缓25。吞噬细胞图1-1 病毒入侵机体刺激免疫细胞反应1.2 甲壳素和壳聚糖概述甲壳素是世界上第二大纤维素资源，存在于虾、蟹、霉菌、酵母、蘑菇等菌类的细胞壁及甲壳类昆虫的外骨骼等26, 27，年产可达10亿吨以上，是一种环境友好型的可再生天然高分子材料。这对于能源紧缺、环境污染较重的现代社会而言，具有十分重要的开发意义 28。甲壳素的来源不同，构型亦有所差异，可分为-甲壳素、-甲壳素和-甲壳素29, 30，结构的不同导致其性质也具有很大的差别。目前研究最为丰富的一类为-甲壳素，为反平行结构，由于其良好的组织相容性、生物低毒性和结构可修饰性等特点，作为基础材料广泛应用于纺织、印染、食品、医药、化工等多个领域31, 32。-甲壳素则是由平行糖链组成，常与胶原蛋白相结合，表现出一定的硬度、柔韧性和流动性，因此它具有参与生物体中电解质的控制和聚阴离子物质的运送等独特的生理功能。软体动物如鱿鱼软骨中主要分布有-甲壳素，在材料性能、吸附性、溶解性等方面表现突出，可应用于化工、医药材料等相关领域33-36。然而由于甲壳素分子内及分子间较强的氢键作用，使得甲壳素结构紧密31，不溶于水和大多数的有机溶剂，因此应用受到限制37。壳聚糖为甲壳素脱除部分乙酰基的产物，也是目前自然界唯一带正电荷的天然多糖化合物38，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-D-葡萄糖。由于分子链中胺基和羟基的存在，使其反应活性极大增强，具有良好的成膜性、絮凝性等机械性能，能够抑菌、抗癌、增强免疫，且具有细胞亲和性、组织相容性和生物可降解性39。更重要的是，脱除乙酰基后的甲壳素，溶解度极大增强，能溶于部分无机酸稀溶液和有机酸27，极大解决了其应用的局限性。因此，壳聚糖的脱乙酰度，也成为衡量其生理活性的重要的技术指标之一40。随着脱乙酰度的增大，氨基作用的增强，壳聚糖的生物活性随之增强。图1-2 甲壳素/壳聚糖的化学结构（这个结构有问题，甲壳素和壳聚糖可分着附，并写明乙酰度是多少代表甲壳素，多少代表壳聚糖）1.3 壳聚糖衍生物目前大多数聚合物是合成材料，他们的生物相容性和生物可降解性相比于纤维素、甲壳素、壳聚糖及其衍生物等天然聚合物相比，具有很大的局限性，但是天然材料的反应性和可加工性又阻碍着其应用与开发。羟基和氨基的存在是壳聚糖生物活性释放的关键的功能性基团，但由于分子内和分子间氢键所形成的半晶体结构，导致活性基团解离困难，通过脱乙酰化和解聚反应可增加聚合物骨架上活性位点的数量和反应性。因此脱乙酰化和分子量的调整成为壳聚糖开发应用中重要的改性28。1.3.1脱乙酰度和分子量对壳聚糖活性的影响分子量和脱乙酰度被认为是壳聚糖应用过程中必须的考虑因素41, 42。经过脱乙酰反应的壳聚糖在溶解度和生物活性的释放上均有所增强，根据脱乙酰度不同可将壳聚糖分为高（85-95%）、中（70-85%）、低（55-70%）三类43。脱乙酰度高于95%的壳聚糖，我们通常称之为超高脱乙酰度的壳聚糖，在工业生产中制备困难，适合于壳聚糖高水平的开发及利用。目前市售多为70-85%的中脱乙酰度的壳聚糖，适合于一般的生产，但对壳聚糖活性的不断开发和应用则迫切需要高甚至超高脱乙酰度的壳聚糖的批量制备。研究发现，壳聚糖脱乙酰度达97%时，能有效增加其对活性FM黑的吸附性能44。A-壳聚糖的原始分子量常为105Da数量级，而-壳聚糖具有更大分子量，通常达106Da以上。由于天然制备的壳聚糖分子量通常较高、粘度较大，因而即使脱乙酰度有了明显提高，其生物活性的释放仍受到限制45。高粘度的壳聚糖具有污水处理、捕集重金属及酶与细胞固定化等作用；中粘度的壳聚糖，主要用于纺织、印染、胶合剂；而低粘度的壳聚糖则不仅在工业、食品包装方面应用广泛，且可作为口服抗酸剂，缓解胃酸，控制人体胆固醇的吸收及制备多种药剂、药膏27, 46。据报道硫酸葡聚糖的抗HIV病毒活性在相对分子量为10kDa 时达到最大，10kDa -500kDa之间保持最大活性47。分子量是影响-卡拉胶抗流感病毒活性的重要因素之一，平均分子量在2kDa左右的-卡拉胶寡糖具有最显著的抗甲型H1N1流感病毒作用。JE等研究发现壳聚糖分子量在1-5kDa时，自由基的清除效果最好48，而自由基的产生与微生物的感染、免疫、细胞损伤、生命衰老和肿瘤的发生有关，在动物疫病中扮演着独特的角色49。1.3.2氨基和羟基修饰对壳聚糖活性的影响壳聚糖和甲壳素的化学修饰产生新的生物功能材料是目前主要研究领域，在不改变功能骨架的前提下，由于天然基团的引入保持并加强了其物理、生物、化学性质38。壳聚糖分子内2位氨基和3、6位羟基是化学修饰的主要位点，具有很好的反应性能，可与过渡金属、稀土金属进行配位50，经化学修饰后能产生与抗血栓形成、细胞活性、抗肿瘤活性和血液相容性等生物学潜能，可应用于医药材料的生产36, 51。通常的化学修饰手段有烷基修饰、羧甲基修饰、硫酸基团修饰等。壳聚糖半乳糖衍生物的制备能提高壳聚糖的水溶性、脂结合能力、水结合能力及抗氧化性，为壳聚糖在食品中的应用提供了可能52；N-丙基磷酸壳聚糖由于丙基磷酸酐的引入亲水性增加，作为多糖偶联剂添加在超滤膜中提高膜的抗污性和渗透性53；壳聚糖聚赖氨酸衍生物，由于巯基与马来酰亚胺基团的引入不仅在生理条件下能发生特异性反应，并且快速、均匀的成膜，具有好的粘附性、低毒性、止血性53；赤霉素壳聚糖交联作为新型的缓释农药，不仅有好的水溶性、稳定性，而且降低了壳聚糖的使用量，在更好地控制农药浓度的同时，降低了成本54；噻二唑环55、N-肉桂酰壳聚糖衍生物56对壳聚糖抑菌作用具有显著提高。壳聚糖的生物活性与2位氨基有着尤其紧密的关系。在酸性PH下，壳聚糖氨基质子化而带正电，能与带负电的细菌细胞外膜通过静电相互作用结合而发挥抑菌功能57。壳聚糖骨架上引入更多的氨基基团，即更多的生物活性反应位点和更多的化学修饰位点，可改变整个分子的PKa，使基团更容易带正电荷，从而更好发挥抗菌、抗病毒等生物活性。近年来研究人员不断探索壳聚糖衍生物的制备，以求提高壳聚糖水溶性、专一性、高效性，使之广泛用于农业、工业、食品业、化妆品业及医药行业等，实现产业化生产。1.4 壳聚糖衍生物抗病毒活性概述海洋生物多糖从来源上可分为海藻多糖和海洋动物多糖，目前多种海洋微生物也被发现可产生生物活性多糖58。多糖是生命有机体的重要组分，并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面具有重要作用，主要影响免疫系统中的网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞及白细胞，促成RNA、DNA、蛋白质的合成、抗体的生成、补体的生成以及对干扰素的作用，从而增强机体免疫功能，使抗病毒能力增强，从而达到抗衰老、抗放射线、抗肿瘤以及抗肝炎等目的59 60。海洋动物多糖中，壳聚糖具有激活机体免疫系统、介导机体免疫系统的系列生物学效应，提高吞噬细胞的系统功能，而被认为是解决病毒性疾病等难题的关键。壳聚糖作为抗病毒药物的载体的研究已经屡见不鲜61-63，这与其良好的免疫活性、生物相容性、可降解性及其良好的控释效果是分不开的。壳聚糖作为单独的抗病毒药物可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染，如对大豆花叶病毒和烟草花叶病毒，并对植物病毒种类没有明确的局限性64, 65，但与壳聚糖的分子量、聚合度、浓度及植物宿主种类有关。壳聚糖的抗病毒机制为促进巨噬细胞活性，影响非杀伤性细胞（NK）活性白介素的分泌，刺激辅助T细胞的生长，这也是其抗癌的主要机理之一28。巨噬细胞是抗原呈递细胞，与辅助T细胞联系后，启动体液和细胞免疫系统66。巨噬细胞表面存在着微生物多糖的受体，壳聚糖作为微生物多糖的类似物，能刺激巨噬细胞活化，产生如下反应：促进其吞噬功能，增强它在其它免疫应答中的协同效应，从而实现机体对T细胞、NK细胞和B细胞的调节，介导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答；此外，壳聚糖被认为有干扰遗传物质的复制与转录的功能，壳聚糖通过诱导病程相关蛋白，积累次生代谢产物和信号传导等方式来达到抗菌、抗病毒的目的。壳聚糖作为抗病毒药物的载体的研究已经屡见不鲜61-63，而作为单独的抗病毒药物，可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染，如对大豆花叶病毒和烟草花叶病毒。壳聚糖对植物病毒种类没有明确的局限性64, 65，而与自身的分子量、聚合度、浓度等有关。经过衍生化修饰的壳聚糖，一方面能够调控与免疫相关的辅助细胞的功能活性，如巨噬细胞和粒细胞等。另一方面巨噬细胞和自然杀伤性细胞的相互作用诱导干扰素的产生，干扰素通过破坏基因组RNA或早期mRNA而破坏转录，抑制病毒复制，因而在动物病毒的防治上也具有广泛的应用基础66。1.5 壳聚糖衍生物作为抗病毒首要的开发前景海洋多糖来源丰富，由于生长环境不同，海洋动物、海洋植物以及海洋微生物都能合成出不同于陆地植物的带有大量电荷、含有糖醛酸及硫酸酯的多糖。随着陆地资源的消耗，海洋生物多糖的作用逐渐被发现，它不仅具有明显的生物学活性，而且无毒副作用60，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗病毒以及作用于心脑血管等活性，海洋生物活性多糖的研究开发已成为一个热门领域58。海带多糖和大部分的海藻多糖等都具有免疫调节作用67，海藻细胞壁中的多聚硫酸脂多糖能阻止小鼠自身免疫系统脑脊髓炎的发生；钝顶螺旋藻多糖可提高病人杀伤细胞的细胞活性；寡褐藻胶，寡几丁质等寡聚糖片段能在病原侵入时启动植物的防御机制，诱导植物自身抗性基因的表达，达到防御植物病害的目的，多种海洋多糖已被制成药物和保健品出现在市场上68。壳聚糖具有如抗凝、溶栓、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗细菌、抗病毒、抗原虫等生物活性，能激活机体免疫系统和介导机体系统的系列生物学效应，提高吞噬细胞的系统功能。1958年，GERBER首次报道了多糖硫酸酯具有抗病毒活性，能强烈抑制具有包膜的病毒，DEREK HORTON和ERNST K.JUST研究证明壳聚糖氨基上含有硫酸根对白血病病毒具有显著抑制作用。VERCELLOTTI和SHARON等人发现壳聚糖磺化衍生物能抑制哺乳动物病毒感染，同时也能抑制劳舍氏白血病病毒和单纯疱疹病毒I和II69。CHIAKIISHIHARA等人证明甲壳质磺化衍生物对弗兰德鼠白血病病毒、仙台病毒和单纯疱疹病毒有作用34, 70。因此，基于壳聚糖在抗病毒方面的优异表现，我们以不同结构类型的壳聚糖为原料，进行分子量和氨基化的修饰，以提高其反应活性，并试验其对鸡新城疫病毒的抑制作用研究，通过鸡胚试验、分子实验等，对壳聚糖的修饰、浓度以及分子量等对新城疫病毒的抑制活性进行深入研究。1.6 研究的内容、目的和意义近年来，由于环境污染及病毒基因组的变异性，许多前所未闻的病毒进入人们的视野，引起恐慌。从艾滋病、禽流感到埃博拉病毒，每一次病毒的出现都给人类社会造成巨大影响，且病毒性疾病的发生与肿瘤这一医疗难题也是息息相关71。因此，人类与病毒性疾病的战役，已经不能只简单的进行被动抵抗了，而必须进行强有力的反击。新城疫作为危害养鸡业健康发展的三大主要疫病之一，不仅给我国的家禽养殖业造成了巨大的经济损失，同时由于疫情的发展，还极大的影响了旅游等相关产业的发展。虽然目前由于新城疫病毒的多发性而被我国规定为强制免疫病种，在政府组织下进行集中免疫72。然而，由于病毒的变异性及疫苗本身及接种程序所存在的问题，导致目前主要的防治新城疫的手段疫苗接种，面临极大的考验。近年来， 随着经贸的发展和交往的频繁，新城疫病毒的流行又有了新的特征，疫苗免疫尚不完善，抗病毒化学药物效果不显著，导致至今尚无有效的治疗药物73。而且，作为免疫损伤性疾病，对于新城疫的研究是对艾滋病、禽流感等人类迫切想要解决的免疫损伤性疾病的研究基础。海洋药物已成为国内外研究的热点之一。由于海洋生物特殊的生活环境导致体内多糖的合成过程与陆地生物不同，产生许多结构新颖、作用独特的海洋生物多糖11-12，而具有很好的生物相容性、生物可降解性的天然阳离子多糖壳聚糖即为其中一种。海洋生物多糖壳聚糖，其分子中含有正电性的氨基，具有非常好的生理活性，如调节免疫、抗肿瘤、抗菌、保湿性等，且研究发现，其可抑制几十种植物病毒、类病毒的侵染。目前国内外对于壳聚糖及其衍生物抑制鸡新城疫病毒的研究尚未见报道，不同分子构型、不同分子量壳聚糖及其衍生物对新城疫病毒抑制的系统性研究是首要需解决的关键性问题之一。因此，我们通过微波方法及接枝技术制备不同分子构型、不同分子量的高脱乙酰度壳聚糖及其胺代衍生物，并以此为研究对象，对鸡胚尿囊液中血凝效价的降低作用为指标，筛选出最佳分子构型、分子量及衍生物产品；同时，采用荧光定量PCR技术，测定细胞因子在分子及蛋白水平的变化，以此确定壳聚糖衍生物在对抗新城疫病毒的过程中，对于免疫系统的激活与调控，从而确定壳聚糖衍生物对于机体免疫系统的影响及药效机制，为壳聚糖硫酸酯成为预防与治疗新城疫病毒的药物打下坚实的理论基础。第二章 不同分子量-壳聚糖的制备及其抗新城疫病毒活性研究传统的抗病毒药物往往存在毒副作用大或是交叉产生病毒抗药性等特点，因此，亟待开发毒副作用小、抗病毒活性好的新型抗病毒药物74。壳聚糖作为天然聚合物有很好的生物相容性、生物可降解性、无毒性以及吸收性等，应用在水处理、生物医药、化妆品、农业和食品工业等多领域，具有免疫、抗菌、抗病毒、伤口愈合、药物递送、组织工程应用等生物活性35, 36。壳聚糖分子量的降低，由于导致溶解性的增加而有利于壳聚糖活性的释放，可显著提高其抗肿瘤、抗菌、抗炎及免疫调控活性75。本文采用过氧化氢微波辅助方法，降解-壳聚糖分子量在1kDa-10kDa之间，并采用鸡胚实验及相关分子实验，测定新城疫病毒血凝效价的变化及经过治疗后的鸡胚尿囊液中免疫因子IL-2、TLR-7、IFN-/及TNF-的变化，对壳聚糖影响新城疫病毒的RNA含量也进行了测定。2.1 实验原料2.1.1原料壳聚糖原料（青岛云宙生物科技有限公司，脱乙酰度为82%分子量为1160kDa）；SPF鸡胚（山东无特定病原鸡实验种鸡场，符合GB/T17999.1-2008以及国际通用标准）；2.1.2试剂氢氧化钠(分析纯，天津市达森化工产品销售公司)；乙酸钠(优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；冰醋酸(高效液相色谱，天津市科密欧化学试剂有限公司)；反转录试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技术有限公司）；荧光定量试剂盒（TransStart Top Green qRT-PCR SuperMix，北京全式金生物技术有限公司）；过氧化氢（分析纯，天津市巴斯天化工有限公司）；病毒，由？提供。（LASOTA鸡新城疫病毒，原始病毒效价为211，96h内致鸡胚死亡）；2.1.3 仪器微波降解反应器（MAS-II型，上海新仪微波化学科技有限公司）；透析袋（MEMBRA-CEL，截留分子量为500/1000/5000Da）；安捷伦1260凝胶渗透色谱仪(美国安捷伦科技公司)；Nicolet TM iSTM10傅立叶变换红外光谱仪（Thermo， USA）；SHZ-D（III）型循环水式真空泵（河南巩义市英峪豫华仪器厂）；FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；SARTORIUS精密分析天平（德国SARTORIUS公司）；Hitech-Kflow纯化水系统（上海和泰仪器有限公司）；Anke GL209-11型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；旋转蒸发仪（IKA RV/HB digital）；2.2 实验方法2.2.1 -壳聚糖的降解75称取-壳聚糖12g，分子量为1160kDa、脱乙酰度为82%，溶解于400mL浓度为2%的冰乙酸溶液（体积浓度），搅拌溶解直至获得澄清、均质的-壳聚糖溶液。将50mL溶解后的-壳聚糖倒入100mL微波反应器中，加入30%过氧化氢1.5mL，600W，70条件下，搅拌500 r/min，依次反应10min、15min、20 min、25min、30min、40min、60min、80 min、100min、180min，将获得的溶液透析、冻干并进行分子量及结构的测定。采用高效凝胶排阻色谱对-壳聚糖降解产物的平均分子量（Mw）进行分析。2.2.2 分子量的测定高效液相法测定壳聚糖样品分子量：进样量：20L；色谱柱：TSK G3000-PWXL、TSK G5000-PWXL；流动相：0.2M醋酸/0.1M醋酸钠溶液；流速：G3000-0.8 mL/min ，G5000-0.6mL/min；柱温：30；检测器：示差检测器；样品浓度：0.4%（W%）；采用不同分子量的葡聚糖2000、1100、 670、410、270、80、50、2、12、5、1kDa，对凝胶色谱柱进行校准。1.1.3 低分子量-壳聚糖抗新城疫病毒效果研究1, 73, 76A) 新城疫病毒毒力测定EID50的测定：取鸡胚30枚，分6组，分别注射10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9病毒原液生理盐水稀释液，37孵育72小时后收取尿囊液，测定EID50=10-8.45/0.2mL，取150EID5010-6为病毒注射量。B）低分子量-壳聚糖安